薯蕷丸聯合紫杉醇抑制三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231上皮間質轉化作用和機制研究

駱小珊,謝 甦,朱曼荊,黃雅珍,朱久龍,馮豆豆,謝 青,蒙雁云,凌湘力

(1.貴州醫(yī)科大學,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550004;3.寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院,浙江 寧波 315800;4.南方醫(yī)科大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院,廣東 廣州 516006)

乳腺癌嚴重威脅著全球女性健康,2020年超過肺癌成為全球女性第一大癌癥[1]。如今乳腺癌的各種治療手段正在不斷進步,但其治療后仍有較高的復發(fā)轉移率[2]。其中,三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)惡性程度高、侵襲性強,手術聯合放化療是目前最主要的治療手段,但治療后患者復發(fā)轉移率高,遠期生存率遠低于其他類型乳腺癌[3-4]。紫杉醇作為TNBC的一線化療藥物廣泛應用于臨床。有研究表明,持續(xù)的紫杉醇化療可能會導致腫瘤細胞侵襲、轉移能力增強,進而增加患者治療后的復發(fā)轉移率[5-6]。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是患者在經歷化療過程中腫瘤細胞獲得轉移能力的重要機制之一[7]。通過EMT,腫瘤細胞可隨血液或淋巴系統浸潤至其他器官,并處于可逆的“潛伏”狀態(tài),此時腫瘤細胞會通過減緩分裂,爭取在化療造成的惡劣環(huán)境中生存,待治療停止后伺機繼續(xù)“作案”,最終導致腫瘤遠處轉移灶的形成[8]。如何抑制腫瘤化療中EMT的發(fā)生,降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力,進而改善患者預后是當前研究的熱點之一。

中藥聯合化療藥物在增效減毒、減少腫瘤復發(fā)轉移、改善患者預后等方面展現了獨特的優(yōu)勢[9-11]。課題組在前期的臨床研究中發(fā)現薯蕷丸能減輕TNBC患者化療的不良反應,降低Ki-67陽性表達[12-13];實驗室研究發(fā)現薯蕷丸聯合化療藥環(huán)磷酰胺可抑制TNBC荷瘤小鼠腫瘤的生長、提高化療后荷瘤小鼠的免疫功能[14],降低腫瘤組織中EMT相關蛋白及mRNA的表達[15]。針對TNBC,薯蕷丸聯合紫杉醇能否通過抑制腫瘤細胞EMT,降低化療中腫瘤細胞的侵襲轉移能力尚未得到驗證。本研究運用血清藥理學方法制備薯蕷丸含藥血清,并聯合紫杉醇共同干預MDA-MB-231細胞,體外模擬腫瘤細胞在經歷化療藥物治療的同時聯合薯蕷丸治療,觀察MDA-MB-231細胞EMT相關指標及侵襲遷移能力的變化,并進一步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞株:本次研究獲得貴州醫(yī)科大學倫理委員會審批通過,動物倫理審查號為1900650。40只健康SD大鼠,雌性,SPF級,體重(200±20)g,由長沙天勤生物科技有限公司提供[合格證號為:SCXK(湘)2019-0014],動物飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床研究中心動物室,在標準的環(huán)境條件下,22～24 ℃恒溫,濕度45%～50%,普通飼料及蒸餾水喂養(yǎng),12 h晝夜節(jié)律。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗,實驗遵循“3R”原則。人源TNBC細胞系 MDA-MB-231購自上海中喬新舟生物科技有限公司,批號為:ZQ0118。

1.1.2 實驗藥物:紫杉醇購自美國MedChemExpress公司,貨號HY-B0015/CS-1145。薯蕷丸按中藥飲片比例將其配制為顆粒劑,由廣東一方制藥有限公司提供。薯蕷丸顆粒劑組成:薯蕷(山藥)、干地黃各2 g,桂枝、豆蔻、芍藥、干姜各0.5 g,神曲、柴胡各0.7 g,麥門冬、白術各1.52 g,茯苓、白蘞各0.25 g,川芎1.3 g,當歸3.03 g,阿膠6 g,桔梗1.25 g,杏仁0.35 g,人參1 g,防風0.65 g,大棗7.5 g,甘草3 g。

1.1.3 實驗主要試劑:高效RIPA裂解液(R0010)、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(P1200)等購自北京索萊寶科技有限公司;BD基質膠(356234)購于美國BD股份有限公司;胎牛血清(04-001-ACS)購于以色列BI公司;mTOR(ab32028)、PI3K(ab40776)、Vimentin(ab92547)等抗體均購自英國Abcam公司;N-cadherin(bs-1172R)、MMP2(bs-22503R)等購自北京博奧森生物技術公司;E-cadherin(20874-1-AP)、GAPDH(10494-1-AP)等抗體購于Proteintech Group,Inc公司。

1.1.4 主要儀器:倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司,Axio);正置熒光顯微鏡(日本尼康,NIKON ECLIPSE CI);多功能酶標儀(美國BioTec公司,ELX50);細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司中國,FormaTM3111);熒光定量PCR儀(美國ABI公司,ViiA7Dx);臺式高速離心機(美國貝克曼庫爾特公司,Microfuge 20R);化學發(fā)光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司,ChemiScope3000Mini);水平電泳儀(北京六一儀器廠,DY-6C)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備:隨機把SD大鼠分為薯蕷丸組和空白組各20只,參照文獻[16],空白組以10 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液灌胃,每日2次;薯蕷丸組予以配置好的薯蕷丸藥液10 ml/kg灌胃 (含薯蕷丸生藥量 3.05 g),每日2次(用藥量按成人臨床用藥劑量每公斤體重為標準,人鼠比例換算后10倍),兩組均連續(xù)灌胃7 d,末次給藥1.5 h后麻醉下腹主動脈取血,無菌條件下分離血清,56 ℃水浴滅活30 min,使用0.22 μm無菌微孔過濾器過濾,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MDA-MB-231細胞培養(yǎng):人TNBC細胞株MDA-MB-231復蘇后,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),將細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1～2天更換培養(yǎng)基。取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組與給藥方法:實驗前我們驗證了紫杉醇對MDA-MB-231細胞的半數抑制濃度(IC50)為991.2 nmol/L。本次研究共設置三組:空白組、紫杉醇組、薯蕷丸聯合紫杉醇組。藥物干預方法:取處于對數生長期MDA-MB-231細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后,空白組細胞給予10%空白血清、紫杉醇組細胞給予10%空白血清聯合紫杉醇溶液、薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞給予10%含薯蕷丸含藥血清聯合紫杉醇溶液處理,各組均加入DMEM高糖培養(yǎng)基補足體系。以下實驗分組均按上述分組設置處理。

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞增殖:取對數生長期的MDA-MB-231細胞,接種于96孔板,調整細胞密度為5×103個/孔,每組設置3個復孔,待細胞貼壁后按上述1.2.3分組設置和藥液的配比處理細胞24、48、72 h后,吸出原藥液培養(yǎng)基,PBS洗,棄PBS,避光下加入CCK8工作液,37 ℃培養(yǎng)箱內避光孵育1～2 h;多功能酶標儀設置溫度37 ℃,波長450 nm,測定各組OD值,并計算細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力:按上述1.2.3分組設置和藥液的配比處理MDA-MB-231細胞48 h后,收集細胞重懸,調整細胞密度為3×105個/孔(侵襲實驗時預先用matrige膠包被Transwell小室),于上室中加入200 μl細胞懸液,下層加入600 μl含30%FBS的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出小室,PBS輕洗后,用棉簽輕輕擦去matrige膠,4%多聚甲醛固定40 min,結晶紫染色30 min,PBS清洗,輕輕擦去上室未遷移的細胞,待其晾干后于100×倒置顯微鏡下取5個視野拍照,通過Image J計算細胞數量,求其平均值。實驗共重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測EMT和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關蛋白表達水平:按上述1.2.3分組設置和藥液的配比處理MDA-MB-231細胞48 h后,提取細胞總蛋白,按BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度,確定各組上樣量,制10%分離膠,配電泳液、轉膜液,加上樣液,電泳分離,轉膜,5%脫脂奶粉或BSA封閉1.5 h,加入一抗,搖床4 ℃過夜。回收一抗,洗膜3次,加入二抗,37 ℃孵育45 min,洗膜3次。取出PVDF膜,吸凈余液,放入成像儀中,滴加適量發(fā)光液(1∶1混合A液和B液),高敏模式自動曝光。利用Image J軟件分析條帶灰度值。實驗重復3次。

1.2.7 RT-qPCR實驗檢測EMT相關指標mRNA的表達:按上述1.2.3分組設置及藥液比例處理MDA-MB-231細胞48 h后,收集細胞,PBS洗3次,提取總RNA,檢測RNA濃度,稀釋后,將提取的RNA逆轉錄成cDNA,-80 ℃保存。以GAPDH為內參基因,E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和MMP2 為目標基因。每組設3個復孔,采用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1所示。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組MDA-MB-231細胞增殖情況比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞增殖受到明顯抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯合紫杉醇組抑制細胞增殖能力增強,其中除24 h外,差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組MDA-MB-231細胞增殖情況比較(%)

2.2 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞侵襲能力明顯受到抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯合紫杉醇組抑制細胞侵襲的能力顯著增強(P<0.01),表明薯蕷丸聯合紫杉醇具有協同抑制MDA-MB-231細胞侵襲能力的作用。見圖1、表3。

圖1 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力比較(結晶紫染色,×100)

表3 各組MDA-MB-231細胞侵襲、遷移能力比較(個)

2.3 各組MDA-MB-231細胞遷移能力能力比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯合紫杉醇組抑制細胞遷移能力顯著增強(P<0.01),表明薯蕷丸聯合紫杉醇具有協同抑制MDA-MB-231細胞遷移能力的作用。見圖2、表3。

圖2 各組對MDA-MB-231細胞遷移能力比較(結晶紫染色,×100)

2.4 各組MDA-MB-231細胞EMT相關蛋白表達水平比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞中E-cadherin蛋白表達上調(P<0.05,P<0.01),Vimentin、N-cadherin和MMP2蛋白表達下調(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇組的MMP2蛋白表達未見明顯下調。與紫杉醇組比較,薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞中E-cadherin蛋白表達明顯上調(P<0.05),Vimentin、MMP2蛋白表達明顯下調(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 各組MDA-MB-231細胞EMT相關蛋白表達水平比較

2.5 各組MDA-MB-231細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達水平比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯合紫杉醇組細胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達下調(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達未見明顯下調。與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯合紫杉醇組PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達明顯下調(P<0.05,P<0.01)。見表5。

表5 各組MDA-MB-231細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達水平比較

2.6 各組MDA-MB-231細胞EMT相關mRNA表達比較 與空白組相比,紫杉醇組、薯蕷丸聯合紫杉醇組均能上調E-cadherin、下調Vimentin、MMP2 mRNA的表達(P<0.01),薯蕷丸聯合紫杉醇組能下調N-cadherin mRNA的表達(P<0.01),而紫杉醇組上調了N-cadherin mRNA的表達;與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯合紫杉醇組上調E-cadherin mRNA,下調N-cadherin、MMP2 mRNA表達能力增強(P<0.01,P<0.05)。見表6。

表6 各組MDA-MB-231細胞EMT相關mRNA表達比較

3 討 論

TNBC是乳腺癌中預后最差的類型,約占乳腺癌總發(fā)病率的20%,因其缺乏激素受體及Her2的表達,故對內分泌和分子靶向治療均不敏感[17],在經歷系統治療后仍有很大部分患者復發(fā)轉移,這是導致患者治療后死亡最主要的原因之一。紫杉醇是一種具有抗腫瘤活性的天然藥物,其可以通過促進微管蛋白聚合、阻滯細胞周期進程和有絲分裂,從而誘導細胞死亡[18],是目前廣泛應用于乳腺癌的一線化療藥物。然而,越來越多的研究表明,紫杉醇在殺死癌細胞的同時,也會增加癌細胞對化療藥物的抗性并促進癌細胞轉移[5,19];還可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的表達促使腫瘤細胞遷移能力提升[20],這些是紫杉醇治療后患者腫瘤仍舊復發(fā)的可能因素。在眾多促進腫瘤轉移的機制中,EMT是上皮來源的腫瘤細胞獲得侵襲轉移能力的關鍵步驟,其發(fā)生的重要標志是上皮細胞標志物 E-cadherin缺失,間充質細胞標志物N-cadherin、Vimentin及MMPs分泌表達的增加,使細胞形態(tài)發(fā)生改變、黏附力降低,進而促使腫瘤細胞發(fā)生遷移、侵襲[21]。PI3K/Akt/mTOR傳導通路控制著腫瘤細胞的多種生物學行為,如調控腫瘤細胞增殖、凋亡、自噬等[22],在約70%的乳腺癌患者中被過度激活,該通路過度激活后促使EMT發(fā)生是TNBC細胞發(fā)生侵襲轉移的重要機制[23-24]。

乳腺癌在中醫(yī)學里屬“乳巖”“乳石癰”等范疇,總病機主要概括為“瘀”“毒”“虛”三個方面,其中“虛”貫穿整個疾病的始終,也是乳腺癌復發(fā)、轉移的決定因素。乳腺癌患者在化療過程中氣血陰陽被耗傷,癌毒殘留,極易復發(fā)或轉移。針對TNBC患者在手術及化療后正氣耗傷,無力抗邪,虛不受補的病機,課題組前期在“護場”理論指導下從后天脾胃入手,選用薯蕷丸進行臨床及實驗室研究獲得良效[12-15,25]。薯蕷丸出自張仲景《金匱要略-血痹虛勞病脈證并治第六》,方中以“薯蕷”(山藥)為君統領全方,健脾益氣,益胃養(yǎng)陰,平補陰陽,同調氣血;合以八珍湯補益氣血;阿膠、麥門冬養(yǎng)血滋陰;柴胡、桂枝、防風、白蘞祛風散邪疏絡;杏仁、桔梗疏利氣機。整方著眼于培補后天之本,“執(zhí)中州而灌四旁”,集補脾益氣、養(yǎng)血滋陰、驅邪理氣于一方,攻補兼施、寒熱并用、陰陽氣血共調,可共奏“護場”之功,限制腫瘤的發(fā)展。近年來,薯蕷丸多用于改善患者化療焦慮抑郁、疲乏、厭食、降低慢性腎功能衰竭患者腎衰進程等[26],但鮮見協同化療藥物抑制腫瘤發(fā)展的相關報道。

本研究通過體外實驗模擬人TNBC細胞經歷化療藥物時加入薯蕷丸共同干預,探索其對MDA-MB-231細胞增殖、侵襲、遷移的影響,探尋中醫(yī)藥聯合化療藥物對腫瘤細胞發(fā)揮的作用,并從EMT及PI3K/Akt/mTOR信號通路入手,探究其可能的機制。本次研究結果表明,MDA-MB-231細胞在受到紫杉醇及紫杉醇聯合薯蕷丸干預后,可顯著抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力,其中薯蕷丸聯合紫杉醇效果更佳,這表明薯蕷丸聯合紫杉醇具有協同增效抑制乳腺癌細胞惡性生物學行為的作用;在調控EMT方面,單用紫杉醇并不能顯著調節(jié)EMT關鍵蛋白MMP2,甚至增強了N-cadherin mRNA的表達。MMP2是基質金屬蛋白酶家族的明膠酶類,能夠降解細胞外基質,在腫瘤細胞生長、分化、侵襲、轉移、調節(jié)腫瘤血管生成及免疫監(jiān)視中起到關鍵作用[27];N-cadherin則是間充質細胞典型的分子標記物,被認為是腫瘤侵襲的啟動子;此外,在調控PI3K/Akt/mTOR信號通路時,單用紫杉醇不能有效抑制關鍵位點p-Akt、p-mTOR的表達。而將薯蕷丸聯合紫杉醇共同干預后則有效的抑制腫瘤EMT及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關分子的發(fā)展。

綜上所述,薯蕷丸聯合紫杉醇可以抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移及侵襲,且具有協同紫杉醇增效的作用,其機制可能與下調PI3K/Akt/mTOR通路進而抑制EMT有關。應用于臨床中,薯蕷丸聯合化療藥物可能降低TNBC患者治療后復發(fā)、轉移率,將有益于乳腺癌患者預后,提高生存率。