高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛乳中麥草畏殘留

張立佳，劉麗君，白艷梅，汪 洋，莫 楠，高玉杰，李翠枝*

（內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

麥草畏屬于苯氧羧酸類除草劑，價格低廉，除草效果顯著，適用范圍廣，因此在農業(yè)生產中被大量使用，但是長期不規(guī)范使用該農藥會對土壤和水體造成污染[1-2]。麥草畏在低劑量時顯示出與植物生長素類相似的效果，但是在高濃度下會刺激分生細胞中的異常細胞生長[3-4]。人體攝入高劑量的麥草畏會導致血管組織阻塞，嚴重時可引起人類軟組織的惡性腫瘤、干擾內分泌系統(tǒng)、肝腎損傷、遲發(fā)性神經(jīng)病變等[5-6]。奶牛長期飼用殘留麥草畏的飼料，會導致牛乳中蓄積該農藥，對食品安全造成較大的風險隱患。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[7]規(guī)定了生乳中麥草畏的臨時限量為0.2 mg/kg。隨著人們的生活水平不斷提高，牛乳的需求量也日益增加，人們也更加關注麥草畏等農藥殘留帶來的危害，因此構建牛乳中麥草畏快速、高效的檢測方法迫在眉睫。

麥草畏的檢測方法主要集中在谷物[8-12]、蔬菜[13-16]、煙草[17-18]等植物源基質，而牛乳中麥草畏的檢測方法較少。但由于牛乳中含有大量蛋白質、脂肪、磷脂等成分，基質較復雜，已報道的植物源基質檢測方法并不適合牛乳中麥草畏檢測，同時植物源基質檢測方法也存在諸多問題。由于麥草畏極性較強且不易汽化，氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）和GC檢測時需要經(jīng)過衍生化處理，過程復雜且耗時較長[8-11]；采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定時雖然不需要衍生化處理，且在常溫下能夠進行分離分析，但是靈敏度較低，且通常需采用液-液萃取、固相萃取等前處理技術再結合紫外檢測器進行分析，所需試劑量較大，操作步驟繁多[15-16]；LC-MS/MS在LC的優(yōu)勢基礎上，兼具串聯(lián)質譜的高選擇性、高靈敏度和準確性等諸多優(yōu)點，已成為目前檢測農藥殘留的主流方法[17-21]。本研究通過優(yōu)化前處理方法和色譜條件，建立HPLC-MS/MS法測定牛乳中麥草畏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 市售；生鮮乳 呼和浩特地區(qū)牧場。

麥草畏標準品（純度≥97.0%）、乙腈、甲酸（均為色譜純）、0.22 μm聚四氟乙烯針式濾器 上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉（優(yōu)級純） 天津市富宇商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX 6500＋HPLC-MS/MS儀（配備電噴霧電離（elaectrospray ionization，ESI）源） 美國AB Sciex公司；ACQITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；ST16R高速冷凍離心機美國Thermo Fisher公司；S25旋渦振蕩器 德國IKA公司；TurboVap氮吹儀 瑞典Biotage公司；ME2002E分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Millipore Q純水機美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

麥草畏儲備液（500 μg/mL）：準確稱取12.5 mg麥草畏標準品（精確至0.01 mg）于25 mL棕色容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，0～4 ℃避光保存，有效期為3 個月。

標準中間溶液Ⅰ（10 μg/mL）：準確吸取1 mL儲備溶液于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制質量濃度為10 μg/mL的標準中間溶液Ⅰ，0～4 ℃避光保存，有效期為1 個月。

標準中間溶液Ⅱ（1 μg/mL）：準確吸取1 mL標準中間溶液Ⅰ于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制質量濃度為1 μg/mL的標準中間溶液Ⅱ，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g牛乳于30 mL離心管中，加入10 mL體積分數(shù)0.5%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩提取10 min后，加入氯化鈉2.0 g，再次渦旋振蕩10 min，在4 ℃下以15 000 r/min離心10 min。準確移取5 mL上清液于12 mL玻璃氮吹管中，在40 ℃下氮氣濃縮至近干，加入1 mL體積分數(shù)80%乙腈水溶液，渦旋復溶2 min，復溶液通過0.22 μm微孔濾膜過濾，用于儀器分析測定。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

ACQITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A：0.01%甲酸溶液；B：乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution

1.3.3.2 質譜條件

ESI負離子模式（ESI-）；離子源電壓：-4 500 V；離子源溫度：450 ℃；氣簾氣（N2）壓力：40 MPa；霧化氣（N2）壓力：50 MPa；輔助加熱氣（N2）壓力：50 MPa；掃描方式：多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。具體質譜參數(shù)見表2。

1.3.4 結果計算

試樣中麥草畏的殘留量按式（1）計算。

式中：X為試樣中被測物殘留量/（mg/kg）；ρ為試樣上機溶液中被測物殘留量/（ng/mL）；V為樣液最終定容體積/mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣質量/g；1 000為換算系數(shù)。

1.3.5 基質效應（matrix effect，ME）

選擇陰性牛乳樣品，按照1.3.2節(jié)方法處理后得到空白基質溶液。依次準確加入一定體積的標準品溶液，以空白基質溶液逐級稀釋后得到質量濃度分別為5、10、20、50、100、250 ng/mL的系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)儀器響應和檢測需要，濃度由低到高進行檢測，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線。ME按式（2）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用QTRAP 6500 HPLC-MS/MS Analyst工作站軟件對譜圖數(shù)據(jù)進行處理，Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Origin 2022軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

對麥草畏標準品的質譜條件進行優(yōu)化。首先，采用注射方式進樣，對母離子進行掃描，獲取目標物的母離子，然后通過子離子掃描獲取其碎片離子，將母離子和2 個響應信號較強的碎片離子組成檢測離子對，以MRM掃描方式優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量。結果表明，在ESI-電離模式下，[M-H]-峰（m/z218.8）響應值較高，這是因為麥草畏苯環(huán)上有羧基，容易電離掉氫離子，同時苯環(huán)上含有氯原子，其同位素峰響應值也較高[22-24]。確定母離子后，分別對母離子m/z218.8和m/z220.9進行子離子掃描，確定特征碎片離子，響應值較高的碎片離子分別為m/z174.9（對應母離子為m/z218.8）和m/z176.9（對應母離子為m/z220.9），其他碎片響應值較小。因此，選取響應值較高的218.8/174.9和220.9/176.9作為定量定性監(jiān)測離子對，完全滿足歐盟2002/657/EC指令[25-26]。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 液相條件的選擇

目前已報道的檢測麥草畏的方法中，大部分流動相含有無機鹽類，如甲酸銨和乙酸銨等[3,27]。由于無機鹽不易揮發(fā)，對儀器和色譜柱污染較大，長期使用會降低儀器的靈敏度。因此，本方法以乙腈-水作為流動相體系，同時考察水中甲酸含量的變化（0、0.005%、0.010%、0.050%、0.100%）對麥草畏的儀器響應和色譜峰的影響。由圖1可知：當水相不含甲酸時，色譜峰出現(xiàn)分叉，保留能力較差（圖1A）；當水中加入0.005%甲酸時，麥草畏的峰形得到改善，但是存在拖尾等基質干擾（圖1B）；當甲酸含量達到0.010%時，麥草畏的色譜峰最佳（圖1C），繼續(xù)增加甲酸的含量，峰形沒有明顯變化，但是響應逐漸降低（圖1D、1E），因為麥草畏的電離模式為負離子模式，過高的甲酸含量會抑制麥草畏的離子化效率，導致響應降低。因此，最終選擇0.010%甲酸溶液-乙腈為流動相。同時優(yōu)化梯度洗脫的起始比例，進一步增強了麥草畏的響應，改善了目標化合物的分離效果。當流動相A、B的初始體積比為95∶5時，化合物的響應強度較高，能與相鄰目標峰實現(xiàn)有效分離。

圖1 麥草畏在不同甲酸比例流動相條件下的色譜圖Fig.1 Chromatograms of dicamba with mobile phases containing different concentrations of formic acid

2.2.2 色譜柱的選擇

考察麥草畏在Waters Anionic Polar Pesticide色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex Bphenyl色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）和Waters ACQITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上的色譜行為。結果表明，由于麥草畏極性較大，Waters Anionic Polar Pesticide色譜柱、Phenomenex Kinetex Bphenyl色譜柱對麥草畏具有一定的保留能力，但色譜峰峰形分叉、存在干擾峰、本底基線高、色譜峰拖尾、出峰時間不穩(wěn)定等異?，F(xiàn)象（圖2A、2B），需要加入甲酸銨等鹽類改善峰形，對色譜柱本身和儀器污染較大，嚴重影響靈敏度和使用壽命，不利于長時間進樣分析。相比而言，麥草畏在Waters ACQITY UPLC BEH C18色譜柱上響應強度較高，出峰時間穩(wěn)定（圖2C）。因此，本方法最終選擇Waters ACQITY UPLC BEH C18色譜柱進行分析檢測。

圖2 麥草畏在不同色譜柱條件下的色譜圖Fig.2 Chromatograms of dicamba on different columns

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取體系的選擇

由于麥草畏屬于苯氧羧酸類除草劑，其酸度系數(shù)為1.9，在堿性條件下易離解成鹽而溶于水相中，可在提取液中加入適量的甲酸來抑制麥草畏的離解，從而增強麥草畏向有機相中的分配比例?？瞻讟悠分刑砑欲湶菸窐藴势泛?，分別經(jīng)過0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%甲酸-乙腈溶液6 種體系提取，考察麥草畏的回收率，由圖3可知：隨著甲酸含量增加，麥草畏的回收率也逐漸增大，當乙腈中甲酸含量達到0.5%時，回收率達到最大值，這是因為酸化乙腈抑制了麥草畏中羧基被電離成離子，進而提高提取效率，回收率增大；繼續(xù)增加甲酸的含量，麥草畏的回收率沒有明顯變化?？紤]到麥草畏為負離子檢測，過高的酸度會抑制化合物的響應，故選擇0.5%甲酸-乙腈溶液作為提取體系。

圖3 提取試劑中不同甲酸含量對麥草畏回收率的影響Fig.3 Effect of different formic acid contents in the extraction solvent on the recovery of dicamba

同時，考察前處理中加入不同含量的氯化鈉對麥草畏回收率的影響，由圖4可知：當不加氯化鈉時，水相與有機相分層不明顯，不利于上清液的移取；加入氯化鈉后，兩相分層明顯，隨著氯化鈉含量的增加，麥草畏的回收率逐漸增大，當氯化鈉含量達到2.0 g時，回收率最高達到99.2%，當氯化鈉含量繼續(xù)增加到2.5 g和3.0 g，回收率略有下降，因此氯化鈉最佳使用量為2.0 g。最后，考察低溫冷凍離心條件對樣品的影響，當樣品在4 ℃、15 000 r/min條件下低溫高速離心10 min，使溶液中的脂肪凝結在液體表面，蛋白沉淀至液體底部，有效去除脂肪、蛋白等雜質，凈化效果較好。

圖4 氯化鈉含量對麥草畏回收率的影響Fig.4 Effect of sodium chloride content on the recovery of dicamba

2.3.2 復溶溶劑的選擇

為了減小溶劑效應對結果的影響，本研究考察不同體積分數(shù)的乙腈溶液（乙腈、水體積比：0∶100、5∶95、10∶90、20∶80、50∶50、80∶20、100∶0）作為復溶溶劑時麥草畏的回收率變化趨勢，由圖5可知：不同體積分數(shù)乙腈溶液對麥草畏回收率的影響顯著，當選擇水溶解樣品時，麥草畏的回收率低于20%，隨著乙腈體積分數(shù)的增加，麥草畏的回收率逐漸變大；當乙腈體積分數(shù)達到80%時，麥草畏的回收率達到95%以上；繼續(xù)增加乙腈體積分數(shù)，麥草畏的回收率沒有明顯的變化，但是色譜峰出現(xiàn)峰展寬、峰分叉現(xiàn)象，這可能因為強溶劑溶解樣品時，樣品溶劑與流動相溶劑的強度相差較大，有些樣品分子溶解在強溶劑中，并隨強溶劑流過柱子，而有些則溶解在流動相中，從而導致峰分叉、峰展寬。因此，選擇體積分數(shù)80%乙腈溶液作為復溶溶劑。

圖5 不同復溶溶劑對麥草畏回收率的影響Fig.5 Effects of different redissolving solvents on the recovery of dicamba

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

溶劑校準曲線的建立：依次吸取標準中間溶液Ⅱ（1 μg/mL）5、10、20、50、100、250 μL，經(jīng)體積分數(shù)80%乙腈溶液稀釋至1 000 μL，得到質量濃度分別為5、10、20、50、100、250 ng/mL的系列標準工作溶液。按質量濃度由低到高的順序在最優(yōu)色譜條件下測定，對峰面積（y）和質量濃度（x）進行線性擬合，建立標準曲線。由表3可知，相應的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)（r）大于0.995，麥草畏在牛乳中的檢出限均為5.0 μg/kg（信噪比≥3），定量限均為10.0 μg/kg（信噪比≥10），滿足GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對生乳中麥草畏的最大殘留限量的規(guī)定。

表3 線性范圍、相關系數(shù)（r）、檢出限及定量限Table 3 Linear relationship, correlation coefficient (r), LOD and LOQ

2.4.2 ME

ME是除了目標物以外的其他物質，如蛋白、磷脂、脂肪、礦物質等對目標物的響應所產生的影響，導致目標物的響應增強或減弱，所產生的效應稱之為基質增強或基質抑制[28-29]。ME為負值表示存在基質抑制效應，為正值表示基質增強，絕對值越大表示ME越強，需要通過基質匹配標準曲線減小ME對結果的影響[19]。結果表明，牛乳中麥草畏的ME為97.2%，ME不明顯，可忽略不計，通過溶劑標準曲線進行外標法定量分析。

2.4.3 加標回收率和精密度

為了驗證方法的準確性和重復性，對陰性牛乳樣品分別進行低、中、高（10.0、20.0、200.0 μg/kg）3 個水平且每個水平重復6 次的加標回收實驗。由表4可知，牛乳中麥草畏的平均加標回收率為96.2%～104.3%，相對標準偏差為1.5%～3.0%，說明該方法準確度和重復性較好，符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[30]對化學方法確認的規(guī)定，滿足牛乳中麥草畏的檢測要求。

表4 牛乳中麥草畏的加標回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of dicamba in spiked milk (n = 6)

2.5 實際樣品測定

隨機抽取呼和浩特地區(qū)市售生鮮乳30 批，參照本方法對樣品進行檢測，通過配制標準曲線、過程空白和加標回收進行質控，質控數(shù)據(jù)全部符合標準規(guī)定，30 批次均未檢出麥草畏，說明樣品不含有麥草畏。但由于采集樣品量有限，并不反映麥草畏農殘在牛乳中的整體污染情況，需要繼續(xù)監(jiān)測。

3 結 論

綜上所述，本方法通過優(yōu)化前處理方法和儀器條件，建立了檢測牛乳中麥草畏的HPLC-MS/MS方法。提取試劑為0.5%酸化乙腈溶液，加入氯化鈉含量為2 g，通過低溫高速冷凍離心，采用體積分數(shù)80%乙腈溶液作為復溶溶劑，結合Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以乙腈-體積分數(shù)0.01%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫分析。采用方法學驗證結論，麥草畏的檢出限和定量限分別為5.0、10.0 μg/kg，在牛乳中的平均回收率為96.2%～104.3%，相對標準偏差為1.5%～3.0%。本方法具有較高的靈敏度和準確性，操作簡單，適合大批量樣品的檢測。