用于誘導(dǎo)納米金快速聚集比色傳感的DNA染料篩選

葉子熠, 劉 霜, 張信鳳

成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院, 四川 成都 610059

引 言

納米材料具有特殊的尺寸效應(yīng)和優(yōu)異的光電性質(zhì), 已在傳感分析中得到廣泛應(yīng)用[1-2], 特別是金納米粒子(AuNPs)由于局部表面等離子體共振, 其光學(xué)響應(yīng)會伴隨AuNPs形態(tài)、 大小以及組成的改變而發(fā)生變化[3]。 AuNPs具有極高的消光系數(shù), 且其形狀、 大小以及AuNPs之間的距離會影響其溶液所呈現(xiàn)的顏色[4]。 因此AuNPs已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建比色生物傳感器[5-7]。 目前引起AuNPs聚集的方式有兩種類型[8-9], 一類是交聯(lián)作用引起的聚集, 比如Mirkin[10]等借助DNA交聯(lián)分子, 通過在AuNPs上雜交兩條互補的DNA鏈來觸發(fā)AuNPs聚集; 也可以通過抗體修飾的AuNPs和目標(biāo)物之間的相互作用實現(xiàn)AuNPs的聚集[11-12]。 另一類是非交聯(lián)作用引起的聚集, 主要是鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集。 鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集具有方便, 價廉以及顏色變化顯著等優(yōu)點, 在比色傳感中得到廣泛應(yīng)用。 然而, 鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集動力學(xué)過程較復(fù)雜, 并且聚集后顏色以及吸光度值不斷變化, 不利于準(zhǔn)確分析[13-15]。

前期實驗發(fā)現(xiàn)DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集具有用量少、 速度快并且穩(wěn)定性好的優(yōu)勢[16]。 DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集主要通過帶正電的染料中和AuNPs表面的電荷, 實現(xiàn) AuNPs的聚集, 帶來顏色變化。 Xing[17]等報道了利用電荷中和誘導(dǎo)AuNPs聚集, 并構(gòu)建了無標(biāo)記、 比色傳感體系, 用于檢測玉米烯酮。 然而, 這些研究工作僅對SYBR Green I (SG)一種DNA染料進行研究。 本研究進一步詳細(xì)篩選了常見的DNA染料[18-20], 考察了其誘導(dǎo)AuNPs聚集的染料用量“IC50”、 堿基對與染料的結(jié)合比及DNA與染料的結(jié)合常數(shù), 以篩選出最佳DNA染料。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-5200PC型紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司); Nikon D7000型數(shù)碼照相機(株式會社尼康); ZEN360型納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司); F-7000型熒光分光光度計(日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué))。

實驗所用試劑均為分析純, 用水均為超純水(18.25 MΩ·cm-1, 四川優(yōu)普超純科技有限公司)。 四氯金酸(HAuCl4·3H2O, 99.99%), 磷酸二氫鈉二水合物(NaH2PO4·2H2O), 噻唑橙(TO), 溴化乙錠(EB)購買于阿拉丁生化科技股份有限公司。 檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O), 二甲基亞砜(DMSO)購買于成都科龍化工試劑廠。 氫氧化鈉(NaOH)購買于成都金山化學(xué)試劑有限公司。 Picogreen(PG, 10 000×), TOTO-1碘化物(1 mmol·L-1), TOTO-3碘化物(1 mmol·L-1), YOYO-1碘化物(1 mmol·L-1), SYBRGreen(SG, 10 000×)購買于賽默飛世爾科技有限公司。 吖啶橙(AO)購買于西格瑪奧德里奇科技有限公司。 本實驗所用雙鏈DNA(dsDNA)由上海生工生物工程有限公司合成并純化, 兩條鏈的序列為TTC CTC TGT GCG CCG GTC TCT CCT和AGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA。

1.2 方法

1.2.1 AuNPs的制備

參照文獻[21]方法進行制備。 將60 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的HAuCl4溶液加入三頸燒瓶, 油浴加熱煮沸后立即加入800 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的檸檬酸三鈉, 當(dāng)溶液顏色由藍色變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)煮沸20 min停止加熱, 可獲得粒徑為14 nm, 濃度為4 nmol·L-1的AuNPs顆粒, 將溶液緩慢攪拌冷卻至室溫后保存在4 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集

用不同的DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集, 每種DNA染料取8種不同的濃度, 這8種濃度能使AuNPs產(chǎn)生紅色到紫色再到藍色的顏色變化。 將一定量DNA染料加入到250 μL AuNPs 溶液中, 終體積為300 μL。 用移液槍充分?jǐn)嚢杌靹蛞陨先芤? 隨著DNA染料濃度的增大, 溶液產(chǎn)生由紅色到紫色再到深藍色的顏色變化, 隨后用數(shù)碼相機拍攝溶液照片。

1.2.3 不同DNA染料與DNA的結(jié)合比

結(jié)合比的測定參照文獻[22]介紹的方法并加以改進。 取一定量的dsDNA與一定量DNA染料于磷酸緩沖液中, 終體積為300 μL, 保持堿基對與DNA染料的總物質(zhì)摩爾濃度不變, 改變堿基對與DNA染料的摩爾分?jǐn)?shù), 在dsDNA與DNA染料的最佳激發(fā)波長下測定不同比例的熒光強度, 選出最高熒光強度的條件即為堿基對與DNA染料的結(jié)合比n值。

1.2.4 不同DNA染料與DNA的結(jié)合常數(shù)

取一定量的DNA染料和磷酸緩沖溶液于比色皿中, 終體積為1 000 μL, 測定其DNA染料初始的熒光值Fmin, 然后逐次滴加dsDNA, dsDNA的濃度由低到高, 每滴加一次dsDNA測定一次熒光值, 直至DNA染料和dsDNA的熒光值不再發(fā)生變化, 此時的熒光值記為Fmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同DNA染料誘導(dǎo)納米金聚集

篩選了一些常見的DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集, 包括EB、 AO、 TO、 SG、 PG、 TOTO-1、 TOTO-3、 YOYO八種染料, 其分子結(jié)構(gòu)分別如圖1所示。

圖1 不同核酸的結(jié)構(gòu)式

所考察的8種染料均可誘導(dǎo)AuNPs快速聚集, 使AuNPs顏色由紅色變?yōu)樯钏{色(圖2)。 這8種DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集所使用試劑濃度大小排序為AO(2.6 μmol·L-1), EB(1.6 μmol·L-1), TO(1.1 μmol·L-1), SG(0.59 μmol·L-1), TOTO-1(0.30 μmol·L-1), TOTO-3(0.30 μmol·L-1), PG(0.24 μmol·L-1), YOYO(0.18 μmol·L-1)。 其中, 使用濃度最小的是 YOYO, 誘導(dǎo) AuNPs 聚集僅需要0.18 μmol·L-1, 使用濃度最大的是AO, 誘導(dǎo)AuNPs聚集也僅需要2.6 μmol·L-1。 傳統(tǒng)的 NaCl 和半胱氨酸(Cys)的使用濃度分別為60和20 mmol·L-1。 可見, DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集的用量僅為NaCl和Cys用量的萬分之一。

圖2 DNA染料, NaCl, Cys誘導(dǎo)AuNPs聚集可視化圖片

2.2 不同DNA染料誘導(dǎo)的聚集效率

為了定量評價DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集的效果, 考察DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集效率, 定義一個“IC50”值, 即誘導(dǎo)劑使AuNPs聚集的最大吸光度變化(A680/A520)50%所對應(yīng)的濃度。 不同濃度的DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集吸光度比值A(chǔ)680/A520的變化圖3(a—h)所示。

圖3 不同濃度的DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集吸光度比值A(chǔ)680/A520

根據(jù)最大吸光度變化(A680/A520)50%所得出各個DNA染料的“IC50”值如表1。 DNA染料誘導(dǎo)AuNPs的“IC50”值越小, 則DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集的用量就越少。 因此根據(jù)誘導(dǎo)AuNPs聚集的DNA染料用量可以得出: YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG、 SG的誘導(dǎo)聚集效果明顯優(yōu)于EB、 TO、 AO。

表1 DNA染料誘導(dǎo)AuNPs的IC50的比較

前期研究[16]發(fā)現(xiàn)DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集依賴于電荷中和效應(yīng), 并且?guī)д姷腘原子數(shù)量對AuNPs的聚集有關(guān)鍵性的作用, 帶正電的N原子數(shù)量越多, 中和AuNPs時的用量越少。 因此使用Marvin View中microspecies(微觀結(jié)構(gòu)式)和microspecies distribution(微觀結(jié)構(gòu)式分布)計算出具體帶正電的N原子個數(shù)。 結(jié)果表明, 在pH=7條件下, AO有0.94個N原子帶正電荷, EB和TO 有1個N原子帶正電荷, SG有2.59個N原子帶正電荷, PG有3.08個N原子帶正電荷, TOTO-1、 TOTO-3、 YOYO有4個N原子帶正電荷, 很好地解釋了YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG、 SG的誘導(dǎo)聚集效果明顯優(yōu)于EB、 TO、 AO的原因。

2.3 DNA染料的結(jié)合比

DNA染料常與dsDNA結(jié)合[23], 因此堿基對與染料的結(jié)合比及dsDNA與DNA染料的結(jié)合常數(shù)會影響游離DNA染料的量, 進而影響對AuNPs聚集調(diào)控。 考察堿基對與染料的結(jié)合比以及dsDNA與DNA染料的結(jié)合常數(shù)是非常重要的。

首先通過Job曲線[22]確定堿基對與DNA染料的結(jié)合比,XBp表示堿基對物質(zhì)的量比堿基對和DNA染料總的物質(zhì)的量, 最高熒光強度的條件即為堿基對與DNA染料的結(jié)合比n值。 由圖4(a—h)可知, 堿基對與SG、 PG、 TOTO-3、 YOYO的結(jié)合比為1∶0.67; 與TO, TOTO-1的結(jié)合比為1∶1, 與EB的結(jié)合比為1∶1.5, 與AO的結(jié)合比為1∶2.3。 結(jié)果表明, 相同條件下, dsDNA中的堿基對與8種DNA染料的結(jié)合比相差不大。

圖4 不同DNA染料XBp對FL intensity的Job曲線

2.4 DNA染料的結(jié)合常數(shù)

研究中通過dsDNA與DNA染料的結(jié)合常數(shù)評估了兩者間的相互作用[24]。 在已知結(jié)合比的基礎(chǔ)上, 將結(jié)合比n值,Fmin,Fmax代入如式(1)—式(5)擬合滴定曲線即可得到結(jié)合常數(shù)Ka[25]。

(1)

F=Fmin(1-X1)+FmaxX1

(2)

(3)

(4)

(5)

式(1)—式(5)中,X1為結(jié)合率,Fmin為沒有加入dsDNA時染料的熒光強度,Fmax為加入dsDNA飽和后染料的熒光強度。

由圖5(a—h)分別可以看出, PG、 SG、 TOTO-3、 YOYO和TOTO-1的結(jié)合常數(shù)遠大于AO、 EB和TO。 本實驗中, 結(jié)合常數(shù)Ka越大, dsDNA與DNA染料的結(jié)合強度越大, dsDNA結(jié)合的DNA染料越多, 調(diào)控DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集效果更顯著。

圖5 不同DNA染料的實驗擬合曲線

將堿基對與DNA染料的結(jié)合比、 dsDNA與DNA染料的結(jié)合常數(shù)總結(jié)于表2。 dsDNA 與染料 SG、 YOYO、 TOTO-3和PG的結(jié)合常數(shù)較大, 分別為3.12×1010, 9.49×109, 4.25×109和2.75×109L·mol-1, 遠遠大于dsDNA與其他染料的結(jié)合常數(shù), 說明當(dāng)dsDNA與SG、 PG、 YOYO和TOTO-3結(jié)合時, 游離的DNA染料相對較少, 在調(diào)控AuNPs的聚集上將有更好的效果, 用于檢測DNA有更高的靈敏度。

表2 堿基對與DNA染料的結(jié)合比以及dsDNA與DNA染料的結(jié)合常數(shù)

3 結(jié) 論

考察了一系列常見DNA染料誘導(dǎo)AuNPs的聚集效率(“IC50”)以及DNA染料與DNA的相互作用。 從DNA染料誘導(dǎo)AuNPs聚集的使用量來看, YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG和SG的用量更少, 誘導(dǎo)AuNPs聚集效果顯著; 從dsDNA與DNA染料相互作用來看, dsDNA 與染料SG、 PG、 YOYO及TOTO-3 的結(jié)合能力比較強, 用于檢測DNA將具有更高的靈敏度。 總之, SG、 YOYO、 PG和TOTO-3在調(diào)控AuNPs聚集效果及用于DNA檢測的靈敏度將相差不大。 以上四種DNA染料有望用于構(gòu)建高性能的AuNPs比色傳感體系。