RNA m6A修飾在子宮內膜癌進展和診療評估中的研究現狀*

朱杏緣,林怡忻,謝晉燁 綜述,陳 康 審校

廣東醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,廣東湛江 524023

子宮內膜癌(EC)是女性生殖系統腫瘤中最常見的一種,其發(fā)病率在女性所有腫瘤類型中排名第2,死亡率排名第3[1]。外科手術是EC的主要治療方法,并根據FIGO等臨床分級和分子分型進行化療。早期階段EC手術治療的5年生存率可以達到95%,而晚期治療的5年生存率不到20%,且復發(fā)和轉移患者的治療效果更差[2],說明早期預防和診斷對EC患者預后具有重要意義。有研究表明,胰島素抵抗、高血糖和肥胖癥等代謝綜合征是EC的高危因素[3],而肥胖相關蛋白(FTO)[4]與多種惡性腫瘤,如膀胱癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]和卵巢癌[8]有著密切的關聯。N6-甲基腺苷(m6A)是高等生物信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)上最為普遍的修飾。有研究表明,FTO可以使mRNA m6A修飾的堿基發(fā)生去甲基化,參與調控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制[9]。然而,相比肺癌、結腸癌和乳腺癌,包括FTO在內的m6A修飾蛋白在EC中的調控機制研究較少。本文對近年來RNA m6A修飾蛋白參與EC發(fā)生、轉移和耐藥的分子機制,以及RNA m6A修飾蛋白在EC的診斷預后中的作用進行了綜述研究,以期對EC預防、早期診斷和治療方法提供新的思路。

1 RNA m6A修飾調控及檢測方法

RNA m6A修飾是一種重要的轉錄后修飾類型,促癌基因和抑癌基因RNA m6A修飾異常[10]及其引起的相關信號通路變化,可導致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。RNA m6A修飾主要由甲基轉移酶復合物動態(tài)可逆地調控RNA腺苷酸的第6個氮原子上的甲基化水平,不僅參與mRNA可變剪接、出核、定位、穩(wěn)定性及翻譯等轉錄后修飾調控[11],還可以通過對ncRNA的調控影響下游表達,包括調控mRNA前體(pri-mRNA)加工、影響長鏈非編碼RNA(lncRNA)結合微小RNA(miRNA)等廣泛影響機體正常生理及疾病的機制和進展。RNA m6A甲基轉移酶復合物包括甲基轉移酶、去甲基化酶和甲基識別蛋白這3類蛋白[12]。

RNA m6A甲基轉移酶,又稱為寫入蛋白,能以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,催化RNA上的m6A修飾形成。目前認為RNA m6A甲基轉移酶包括甲基轉移酶樣蛋白3/14(METTL 3/14)、Wilms腫瘤1相關蛋白(WTAP)、RNA結合基序蛋白15/15B(RBM15/15B)、病毒樣m6A轉移酶相關蛋白(VIRMA)、CCCH型鋅指蛋白13(ZC3H13)等。其中METTL3是RNA m6A甲基轉移酶復合物的核心,起主要催化作用,而其他蛋白起募集和穩(wěn)定甲基轉移酶復合物的功能[13-15]。

RNA m6A去甲基酶,也被稱為擦除蛋白,主要由人源Alkbh5蛋白(ALKBH5)和FTO[11]組成。FTO為首個發(fā)現具有RNA m6A去甲基化功能的蛋白,能與甲基轉移酶復合物共定位,拮抗METTL3的作用,是實現動態(tài)可逆調控RNA m6A修飾的關鍵蛋白[16]。ALKBH5幾乎表達于所有組織細胞中,與METTL3的甲基化作用相反,可以直接去除RNA m6A甲基化基團,該基因缺失可阻礙mRNA的出核轉運,影響基因的表達。

甲基識別蛋白,也被稱為閱讀蛋白,其通過連接m6A修飾RNA和核RNA輸出因子、剪接因子、翻譯起始因子、去腺苷化酶和脫帽酶復合物等,調控RNA的出核、成熟、翻譯和降解過程,是m6A修飾影響靶RNA命運的主要調控分子,主要包括YTH結合蛋白1-3(YTHDF1-3)、YTH結構域蛋白1-2(YTHDC1-2)及胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(IGF2BPs)等[12]。

RNA m6A修飾穩(wěn)態(tài)調控,在生長、發(fā)育、代謝、免疫、抗炎等正常生理和病理過程中起關鍵作用;異常的RNA m6A修飾則會導致腫瘤、自身免疫病、代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[17]。因此,檢測RNA m6A修飾水平的改變,以及特定靶RNA m6A修飾的異常,在疾病的診療評估中具有關鍵的指示作用。目前RNA m6A修飾水平的檢測主要包括色譜法、印跡法和比色法,可從整體水平上判斷RNA m6A修飾水平在疾病發(fā)生發(fā)展和治療前后的差異,以對疾病預防和預后評估做出判斷,但無法鑒定出m6A修飾的具體RNA和位點。RNA甲基化免疫沉淀測序[18-19](MeRIP-Seq)使用RNA m6A高特異性抗體分離m6A修飾的RNA片段,再通過高通量測序繪制轉錄組的RNA m6A圖譜。MeRIP-Seq可以篩選出不同疾病、不同階段中m6A修飾異常的RNA及其位點,更有利于疾病發(fā)生發(fā)展機制的研究。RNA免疫共沉淀技術(RIP)通過上述特定RNA m6A修飾相關蛋白抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,再對與靶蛋白結合的RNA進行分析,該方法可用于對MeRIP-Seq的結果進行驗證。同樣,也可通過一些可用的數據庫對RNA m6A修飾進行分析,包括WHISTLE、BGRU、PseDNC、MeT-DB、m6AViewer等不同的計算方法來關聯現有的基因表達、蛋白質表達、RNA甲基化、疾病或細胞系數據庫,從而預測和分析不同基因、細胞系或疾病的RNA m6A修飾位點、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、RNA結合蛋白(RBP)和RNA剪接模式[20-24]。

2 RNA m6A修飾在EC中的生物學作用

越來越多的研究發(fā)現RNA m6A修飾蛋白通過改變靶基因或者mRNA的m6A修飾及激活異常信號通路促進癌細胞的惡性生物活性,其在EC發(fā)生、轉移和耐藥過程中發(fā)揮重要作用,關于在EC中,RNA m6A修飾相關蛋白的變化總結見表1,下文將從RNA m6A與EC發(fā)生、轉移和耐藥的相關分子機制及其作為診斷預后標志物等方面進行總結和介紹。

表1 RNA m6A修飾相關蛋白在EC中的作用

2.1RNA m6A修飾與EC發(fā)生和轉移 EC的發(fā)生涉及增殖信號通路、激素、代謝和炎癥紊亂等復雜過程,目前研究表明RNA m6A修飾相關蛋白表達差異和功能異常參與EC微環(huán)境紊亂和增殖信號的異?；罨?/p>

有研究發(fā)現,去甲基化酶FTO在EC中表達上調,導致核內信號分子TCF4/β-catenin拮抗分子同源域轉錄因子HOXB13的mRNA m6A甲基化水平降低,與閱讀蛋白YTHDF2結合減少,HOXB13 mRNA發(fā)生明顯降解,誘發(fā)Wnt信號通路的過度激活,促進EC發(fā)生發(fā)展[25]。而肥胖與長期暴露于雌激素水平較高的環(huán)境中可能通過上調FTO的表達,增加患EC的風險[26]。ZHANG等[27]的研究指出,雌二醇可能通過與雌激素受體結合,活化PI3K/AKT和MAPK信號通道,從而使FTO表達上調,促進基質金屬蛋白酶2(MMP)-2、MMP-9和細胞周期蛋白D(cyclinD)表達,從而刺激EC細胞的增殖。ZHU等[28]進一步確定雌激素誘導FTO發(fā)生ERα依賴性的核定位與增強子宮內膜細胞增殖活性有關。

此外,也有報道發(fā)現,去甲基化酶ALKBH5在EC組織中顯著上調。一方面,在正常子宮內膜中,胰島素樣生長因子1(IGF-1)在絕經前子宮內膜增生期、分泌期和月經期的轉變中起著關鍵的調節(jié)作用,其高表達被認為是影響腫瘤進展的重要預后因素,而ALKBH5使IGF-1R轉錄本的m6A修飾去甲基化,抑制IGF-1R mRNA降解,從而上調IGF-1軸的促增殖作用,促進EC細胞的生成和轉移[29]。另一方面,缺氧是促進腫瘤轉移的動力,缺氧會促進腫瘤血管新生及增強腫瘤干細胞自我更新能力,SOX2是一項重要的干細胞轉錄因子,不僅維持、調控組織和器官的發(fā)育,也可以調控癌癥的發(fā)生與發(fā)展。研究指出,EC細胞在缺氧條件下ALKBH5表達上調,通過降低轉錄因子SOX2的mRNA m6A修飾,抑制其降解,從而上調SOX2表達促進EC干細胞的自我更新和轉移[30-31]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是一種重要的信號傳導機制,它可以激活絲裂原信號,從而促進細胞周期、增殖、代謝和運動,從而影響生物體的功能[32]。LIU等[33]的研究發(fā)現,RNA m6A甲基化轉移酶METTL14功能喪失性突變或METTL3低表達介導的RNA m6A水平降低,與ECPI3K/AKT/mTOR持續(xù)活化相關。其中,AKT信號的負調控因子PHLPP2蛋白水平在METTL14突變、敲低和METTL13敲低的情況下降低,而mTOR的mRNA水平和蛋白水平均上調,說明不同基因mRNA的m6A修飾改變可產生不同的調控結果。該研究者進一步干擾m6A閱讀蛋白YTHDF1和YTHDF2,結果發(fā)現YTHDF1可與RNA m6A修飾的PHLPP2 mRNA結合并促進其翻譯,YTHDF2可以與RNA m6A修飾的mTOR基因mRNA結合并促進其降解。然而,在EC細胞中YTHDF1和YTHDF2的表達水平沒有明顯差異,提示METTL3和METTL14異常打破了PHLPP2和mTOR mRNA m6A修飾穩(wěn)態(tài),是誘發(fā)EC發(fā)生的關鍵步驟。

然而,也有研究提示,EC組織中閱讀蛋白YTHDF2、IGF2BP1[34]、IGF2BP3[35],以及寫入蛋白WTAP的表達上調,通過干擾特定基因的RNA m6A修飾穩(wěn)態(tài),促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲[36];同時也有報道稱,YTHDF2表達在EC細胞中下調,減少對促癌基因表達的抑制,從而增強EC惡性程度[37]。造成研究之間結果差異的原因可能與檢測方法不同有關,有些研究檢測m6A修飾蛋白的mRNA表達水平,有些通過組織化學染色檢測EC細胞中RNA m6A修飾蛋白的表達,也有通過免疫共沉淀技術檢測特定基因RNA m6A修飾蛋白的差異。

同時,以上研究也說明,RNA m6A修飾紊亂可以誘發(fā)EC發(fā)生,而且在EC發(fā)生發(fā)展的過程中,RNA m6A修飾的進一步變化可能是腫瘤轉歸的一個重要分子過程。因此,對EC相關RNA m6A修飾水平變化的監(jiān)測和研究,以及探討關鍵的RNA m6A修飾關鍵基因和修飾蛋白的表達,可能對了解EC的發(fā)生發(fā)展和個體化差異具有重要意義,仍有待深入研究。

2.2RNA m6A修飾與EC的耐藥關系 癌癥耐藥性是癌癥治療的主要障礙,RNA m6A修飾改變癌癥關鍵基因和通路從而導致耐藥性。FTO在各種人類惡性腫瘤中大量表達,增加癌細胞代謝,從而導致腫瘤發(fā)生和化療耐藥。在EC患者中發(fā)現,與分化良好腫瘤患者相比,在低分化腫瘤患者中檢測到更高的m6A mRNA表達水平,且與更差的臨床結果有關,而FTO表達增加與EC患者生存率降低有關,FTO通過HOXB13介導的Wnt信號激活促進了EC的轉移性傳播[38];在宮頸癌中,FTO通過m6A去甲基化引起的β-連環(huán)蛋白表達改變來增強患者對化療和放療的抵抗力[39]。這也可能適用于EC,因為FTO過表達可能導致放療和化療失敗,導致不利的臨床結果,但FTO在EC中具體的耐藥機制仍有待探究。

2.3RNA m6A修飾與EC的腫瘤免疫關系 在腫瘤進展過程中,癌細胞可以通過各種機制逃避宿主免疫監(jiān)視并削弱免疫反應,包括降低腫瘤相關抗原的表達或促進免疫炎癥微環(huán)境的形成[40]。目前發(fā)現RNA m6A不僅可以改變癌細胞的生物特性,還可以改變T淋巴細胞、NK細胞等免疫相關分子調節(jié)的修飾。EC組織中ZC3H13、YTHDC1和METTL14的表達與PD-L1的表達呈正相關;PD-1/PD-L1通路控制腫瘤微環(huán)境中免疫耐受的誘導和維持,阻斷這些蛋白可能增強免疫治療的效果。根據CHEN等[41]研究,TIMER數據庫分析表明,METTL14、ZC3H13、YTHDC1與CD4+T淋巴細胞的浸潤呈正相關,ZC3H13和YTHDC1與巨噬細胞和NK細胞浸潤呈負相關。說明RNA m6A調節(jié)蛋白與EC腫瘤免疫浸潤密切相關,是潛在的免疫調控、靶向治療位點。目前關于RNA m6A與腫瘤免疫在EC中的研究比較少,需要進一步研究。

2.4RNA m6A修飾水平及關鍵基因作為EC早期診斷、預后標志物可能性 根據MA等[42]的研究,免疫組織化學結果提示ZC3H13、YTHDC1和METTL14在EC組織中的表達顯著降低,可以作為EC潛在的診斷及預后生物標志物。同樣地,根據ZHAI等[43]研究,RBM15、FTO和YTHDF1被確定為EC的預后生物標志物,其可能參與細胞周期調控,影響RNA加工和翻譯,并與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程和EC的預后相關。然而,這些調控因子的確切機制仍有待完全闡明,需要進一步的研究。

有研究發(fā)現,利用主成分分析法構建RNA m6A評分,量化每個腫瘤患者的RNA m6A修飾模式,可以預測腫瘤炎癥的分期、亞型、TME間質活性、遺傳變異及預后,根據RNA m6A評分給患者提供顯著的治療優(yōu)勢和臨床效益[44]。據TIAN等[45]研究發(fā)現,還有其他的轉錄組學與RNA m6A轉錄組學有串聯干擾作用,共同影響多種生物學過程。在胃癌中發(fā)現m5C(一種DNA修飾類型)與RNA m6A調節(jié)器有相似遺傳變化,猜測這兩種修飾模式存在互相作用,在肝癌細胞驗證這兩種調節(jié)劑協同削弱肝癌細胞的凋亡,增強DNA損傷核修復,促進肝癌細胞的增殖、遷徙、轉移等生物性質。進一步開發(fā)了5Mc/m6A多組學EME打分系統,精確預測肝癌的免疫反應治療及潛在的藥物靶點。提示RNA m6A修飾水平及關鍵基因可作為EC早期診斷、轉歸、預后標志物及預測潛在藥物靶點,但在EC中尚未有相關數據和研究的發(fā)表。

3 小結與展望

由于生活的改善,肥胖癥、高血糖和胰島素抵抗等發(fā)生風險升高,發(fā)生EC的風險也越來越高。目前針對EC沒有特異性早期診斷標志物,治療手段單一,晚期復發(fā)和轉移更是治療難點。所以,早期診斷和靶向治療EC變得日益重要。目前,研究人員正在探索RNA m6A修飾蛋白在EC發(fā)生、轉化和耐藥領域的更深入的分子機制,以期尋找較高特異度和靈敏度的腫瘤標志物,以及將RNA m6A調節(jié)劑在相關通路的靶向作用應用于實際。