高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的不確定度評定

黃炯力，范菲，王喻，王為梁

（1.西安計量技術(shù)研究院，西安 710068；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054）

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[1]（2015年版）將吡硫鎓鋅、水楊酸、山梨酸、苯氧異丙醇、2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、鄰傘花烴-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、芐氯酚、吡羅克酮乙醇胺鹽、三氯卡班、三氯生、溴氯芬、硫柳汞鈉等19種化合物列為防腐劑限用成分，并規(guī)定了高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分含量的方法[2-4]，對組分含量的準(zhǔn)確測定是保障化妝品質(zhì)量安全的重要保證。測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，其測量結(jié)果的可信度和可用性很大程度上取決于其不確定度的大小[5-11]。所以，測量結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)該附有測量不確定度說明才是完整并有意義的?？紤]到上述的影響因素和測量過程的不確定性，筆者參考相關(guān)文獻[12?15]，對吡硫鎓鋅等19 種組分的高效液相含量測定方法建立了數(shù)學(xué)模型，進行了不確定度評定，為檢驗結(jié)果評定的準(zhǔn)確性和合理性，提供一定參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：ULTIMATE U-3000 型，二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子天平：(1) BSA124S-CW 型，分度值為0.1 mg，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，(2) MS105型，分度值為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

高速冷凍離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

渦旋混勻器：V2S025 型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

吡硫鎓鋅、山梨酸、三氯卡班、溴氯芬標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.8%、99.9%、99.4%、99.6%，北京曼哈格生物科技有限公司。

水楊酸、苯氧異丙醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、三氯生標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.9%、99.8%、99.16%、99.46%、99.90%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、鄰傘花烴-5-醇、芐氯酚、吡羅克酮乙醇胺鹽、硫柳汞鈉標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.00%、99.60%、98.52%、99.08%、98.23%、99.94%、99.85%、99.02%、99.86%、98.8%，美國Stanford Chemicals 公司。

化妝品樣品：洗發(fā)乳，市售。

甲醇、乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為高純水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Thermo Acclaim TM 120-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；柱溫：30 ℃；流動相：(A)磷酸二氫鈉溶液(pH值3.80)，(B)甲醇溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，0.0～5.0 min 80%～55% A，5.0～15.0 min 55%A，15.0～32.0 min 55%～30% A，32.0～47.0 min，30%～15% A，47.0～54.0 min 15% A，54.0～55.0 min 15%～55% A，55.0～60.0 min 55% A，60.0～60.1 min 55%～80% A，60.1～65.0 min 80% A；檢測波長：吡硫鎓鋅、水楊酸、山梨酸、苯氧異丙醇、鄰傘花烴-5-醇、氯二甲酚、三氯卡班、三氯生的測定采用280 nm，2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、氯咪巴唑、芐氯酚、溴氯芬、硫柳汞鈉的測定采用230 nm，吡羅克酮乙醇胺鹽的測定采用300 nm；進樣體積：10 μL。

1.3 溶液制備

17種組分的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取除硫柳汞鈉、吡硫鎓鋅以外的17 種組分標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

吡硫鎓鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1.00 mg/mL，精密稱取吡硫鎓鋅標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于100 mL 容量瓶中，先加入20 mL 二甲亞砜溶解，再用甲醇定容至標(biāo)線，搖勻。

硫柳汞鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：2.5 mg/mL，精密稱取硫柳汞鈉標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

18種組分的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別精密量取17 種組分的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，吡硫鎓鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mL，分別置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻。

硫柳汞鈉系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取硫柳汞鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mL，置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻。

化妝品樣品溶液A：準(zhǔn)確稱取樣品1.0 g (精確至0.001 g)，置于50 mL 具塞比色管中，加入甲醇8 mL，渦旋振蕩30 s，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，用甲醇定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min。上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得。該溶液用于測定除吡硫鎓鋅外的18 種組分。

化妝品樣品溶液B：準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g (精確至0.001 g)，置于50 mL具塞比色管中，加入乙腈-甲醇(體積比為95∶5) 40 mL，渦旋振蕩30 s，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，用乙腈-甲醇(體積比95∶5)定容至50 mL，搖勻，以10 000 r/min離心5 min。取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得。該溶液用于測定樣品中的吡硫鎓鋅。

1.4 實驗步驟

按1.2 色譜條件，取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進樣，進行色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品溶液進樣，進行色譜分析，根據(jù)保留時間和紫外光圖譜定性，測得色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到待測溶液中各測定組分的濃度，計算樣品中各待測組分的含量。

2 數(shù)學(xué)模型

2.1 數(shù)學(xué)模型建立

根據(jù)保留時間定性，測得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測溶液中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量濃度，按式（1）計算其中的含量。

式中：w——化妝品中待測組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g；

m——樣品稱取質(zhì)量，g；

ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的目標(biāo)組分質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品定容體積，mL。

2.2 測量不確定度來源

根據(jù)測定數(shù)學(xué)模型分析，其測量不確定的來源主要有：

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度u(ms)、玻璃量器移液定容引入的不確定度u(Vs)及由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u(L)；

（2）樣品引入的不確定度：樣品稱量引入的不確定度u(mx)、樣品定容引入的不確定度u(Vx)；

（3）高效液相色譜儀引入的不確定度u(D)；

（4）樣品測量重復(fù)性引入的不確定度u(f)。

測量模型中輸入量估計值相互獨立，采用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成公式計算：

由上式可推導(dǎo)出被測樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成公式（2）為：

3 測量不確定度分量的量化

3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ms)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量采用分度值為0.01 mg 的電子天平，其測量不確定度分量應(yīng)包括天平最大示值誤差、重復(fù)性、分辨力及偏載等的影響，但考慮為單次稱量，重復(fù)性、分辨力及偏載等影響均包含在最大示值誤差內(nèi)，故主要考慮天平最大示值誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ms,1)。此外，環(huán)境溫度、大氣浮力、重力加速度可忽略不計。根據(jù)計量檢定證書結(jié)果，天平最大允許誤差為±0.05 mg，則其區(qū)間半寬為0.05 mg，估計為均勻分布，包含因子k=2，對其標(biāo)準(zhǔn)不確定度進行計算，得到u(ms,1)=2.89×10-2mg。

由于采用差減法稱量，存在2次讀數(shù)，因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱取質(zhì)量為ms，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量質(zhì)量引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（3）計算，結(jié)果見表1。

表1 稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.2 玻璃量器移液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Vs)

玻璃量器移液定容引入的不確定度分量基本由三部分組成：容量允差u(V1)及溶劑體積膨脹系數(shù)u(V2)的影響。

由以上2項合成得出相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

其它玻璃量器移液定容引入的不確定度計算同上，結(jié)果見表2。

表2 各玻璃量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，分別進樣測定，以色譜峰平均面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度用最小二乘法進行擬合，由線性方程計算樣品溶液平均質(zhì)量濃度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由式（4）計算：

式中：s(A)——標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，9.08；

ρx——樣品溶液的平均質(zhì)量濃度,μg/mL；

ρˉ——系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的平均質(zhì)量濃度，μg/mL；

A——線性方程斜率；

N——樣品平行測定次數(shù)，N=2；

n——標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，n=6×2。

將上述各值代入公式得出u(L)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

計算結(jié)果見表3。

3.2 樣品引入的不確定度

3.2.1 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mx)

配制化妝品樣品溶液A、化妝品樣品溶液B，分別取樣兩份。配制樣品溶液A樣品稱取質(zhì)量分別為1.012 3、1.024 6 g，則稱量結(jié)果引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(mx)=2.53×10-3。

配制樣品溶液B 樣品稱取質(zhì)量分別為0.506 4、0.517 8 g，則稱量引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.50×10-3。

3.2.2 樣品溶液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vx)

同理，測定吡硫鎓鋅時使用50 mL 比色管的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為5.11×10-3。

3.3 高效液相色譜儀引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)

由檢定證書可知，高效液相色譜儀DAD檢測器的定量測量誤差為0.05%，即其相對擴展不確定度為0.05%，按均勻分布計算，k= 3，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f)

在重復(fù)條件下，精密稱取6份樣品各測定2次（n=6，N=2），實驗結(jié)果按式(5)和式(6)計算，標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表4。

表4 樣品重復(fù)性測定結(jié)果

3.5 測量結(jié)果的不確定度

將以上各不確定度分量的值代入式(2)計算6份化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值w，取包含因子k=2(置信概率95%)，則液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19 種組分的相對擴展不確定度按式(8)和式(9)計算：

高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相對擴展不確定度(k=2)見表5。

表5 化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的含量

4 結(jié)語

通過對各分量不確定度的考察表明，高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19 種組分，7 個不確定度來源對測定結(jié)果的影響較大，其中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱重、玻璃量器移液定容和標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度分量為合成不確定度的主要貢獻量，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、重復(fù)性、樣品稱量和液相色譜儀引入的不確定度分量相對較小，可采用配制的工作曲線標(biāo)準(zhǔn)點盡量與被測組分濃度接近，增加系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液實驗點數(shù)，定期對儀器及量器進行檢定和維護，使其保持較高靈敏度等，降低相應(yīng)測量不確定度分量對測量結(jié)果的影響，對于基質(zhì)相對復(fù)雜的樣品，可采用內(nèi)標(biāo)法等方法進行測定，降低樣品基質(zhì)引入的不確定度。