介質(zhì)阻擋放電等離子體對不同pH值生長的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活作用

陳琳，陳緣，何亮亮，李萬華*，汪浪紅,*，曾新安

（1.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710069）（2.佛山科技學(xué)院廣東省食品智能制造重點實驗室，廣東佛山 528225）（3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，A.acidoterrestris）是一類非致病性、產(chǎn)芽孢的嗜酸耐熱菌，大量研究表明這類細菌是引起蘋果汁、橙汁等酸性果汁腐敗的主要原因之一[1-3]。被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的果汁在初期并不出現(xiàn)明顯酸敗或漲包現(xiàn)象，很難直接觀察到，但其代謝產(chǎn)物如愈創(chuàng)木酚、2,6-二溴苯酚以及2,6-二氯苯酚會使果汁出現(xiàn)口感和風(fēng)味變劣、濁度升高等質(zhì)量問題[4]，進而給生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。巴氏滅菌處理（70～90 ℃）是果汁加工中最常見的殺菌手段，但是很難將其完全殺滅[5,6]。鑒于其危害性，脂環(huán)酸芽孢桿菌被認(rèn)為是果汁加工中需控制的關(guān)鍵微生物之一[7]。因此，如何有效殺滅果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌對于我國果汁行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

非熱等離子體技術(shù)是由電離或部分電離的氣體所產(chǎn)生的原子、電子、帶電粒子、自由基、紫外線光子形成的集合體[8]。等離子體能夠在低溫短時間殺滅食品中的各種微生物，近幾年被廣泛運用于果汁、快餐食品、肉類制品等各類食品滅菌[9-11]。研究表明，細菌在遭受不良的環(huán)境狀況如低溫、酸或堿以及食品加工或儲存中的高鹽脅迫后會引入應(yīng)激反應(yīng)并通過相應(yīng)的代謝過程對其產(chǎn)生耐受性[12]。根據(jù)同源耐受性原理，產(chǎn)生適應(yīng)的細菌會對同一脅迫條件產(chǎn)生更高的耐受性[13]。另外，遭受脅迫的細菌可能還會誘發(fā)交叉耐受性反應(yīng)，進而產(chǎn)生對不同的條件如酸、熱環(huán)境產(chǎn)生高耐受性[14,15]。果汁是一種高酸環(huán)境體系（pH值為3.2～5.0），不同的酸性環(huán)境對脂環(huán)酸芽孢桿菌造成酸脅迫，并引起應(yīng)激反應(yīng)。然而，pH值介導(dǎo)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對等離子體的耐受性的高低并未見相關(guān)報道。

因此，本文從酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同pH值下的生長速率、形態(tài)變化，并基于氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法分析酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分的差異，探究pH值介導(dǎo)下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌與等離子耐受性之間的關(guān)系，本文對于全面了解脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同pH值下的生長特性及對等離子體耐受性機理具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 原料

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestrisATCC 49025）采購廣東微生物研究所微生物培養(yǎng)物保藏中心提供。細菌脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

CTP-2000K等離子體設(shè)備（裝配DBD-50反應(yīng)器），南京蘇曼有限公司；UV-1800島津紫外可見分光光度計，日本島津公司；8890B-7000D氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；掃描電鏡儀，日本日立有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

將安瓿管中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌轉(zhuǎn)移至AAM培養(yǎng)基中，于搖床中在45 ℃條件下隔夜培養(yǎng)。用接種環(huán)沾取酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)物于固體培養(yǎng)基中進行劃線，放置培養(yǎng)箱中于45 ℃溫度下培養(yǎng)24.0 h進行菌種活化。將含酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)物接種至新鮮AAM培養(yǎng)基中（pH值3.2、3.6、4.0和4.4），45 ℃下進行培養(yǎng)，并測定其生長曲線。

1.3.2 細胞膜脂肪酸提取與分析

不同pH值下將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心收集菌體。根據(jù)Wang等[16]報道的方法進行膜脂肪酸提取與甲基化，具體方法如下：（1）取菌體40～50 mg加入1.0 mL皂化液（4.5 g NaOH，15.0 mL甲醇，15.0 mL蒸餾水），浸泡在沸水浴中充分混合30 min；（2）冷卻至室溫后，加入2.0 mL甲基化溶液（32.5 mL 6.0 mol/L HCl和27.5 mL甲醇），80 ℃水浴10 min后冷卻至適溫；（3）加入1.25 mL的萃取液（正己烷/甲基叔丁基醚，V/V=1:1）充分混合，去除水相；（4）加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH，將一定量的有機相移到氣相小瓶，并作氣質(zhì)聯(lián)用分析。

1.3.3 DBD-等離子體處理

介質(zhì)阻擋放電等離子體（DBD-ACP）設(shè)備原理圖如圖1所示，產(chǎn)生等離子體的氣源為空氣。將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心重懸于等體積的無菌生理鹽水和蘋果汁之中。取4.0 mL菌液于20 kV和30 kV電壓下處理0、0.5、1.0和2.0 min，其中高壓電極板和樣品表面距離為5 mm，頻率為1.0 kHz。處理后的菌液進行梯度稀釋并涂布，于45 ℃下培養(yǎng)36.0～48.0 h以檢測菌落總數(shù)（CFU/mL），根據(jù)處理前后菌落數(shù)變化分析致死率。每次處理重復(fù)三次，實驗結(jié)果取平均值。

圖1 介質(zhì)阻擋放電（DBD）等離子體處理實驗裝置原理圖Fig.1 Schematic of a dielectric barrier discharge (DBD) plasma treatment experimental device

1.3.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡制樣參考之前的方法進行[17]：將不同pH值（3.2、3.6、4.0和4.4）培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進行菌體收集（離心，4 000g，5.0 min），并用含2.5%（V/V）戊二醛的PBS緩沖液在4 ℃條件下保存過夜。離心后分別使用φ=30%～100%乙醇溶液對細菌樣品進行梯度脫水。脫水后的菌體用叔丁醇處理兩次，然后將樣品滴在錫箔紙上進行真空冷凍干燥，噴金后即可觀察酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài)變化。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以O(shè)rigin Pro 8作圖，采用SPSS Statistics 22作數(shù)據(jù)分析分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，每組試驗平行3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長動力學(xué)分析

通過測量OD600nm值繪制生長曲線，研究不同pH值對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響。如圖2所示，不同pH值培養(yǎng)基培養(yǎng)下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長速率存在一定的差異。其中，pH值4.0條件下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長速率最快，培養(yǎng)6 h后即進入生長對數(shù)期，20 h后進入生長穩(wěn)定期。pH值3.6和4.4條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長有輕微的延遲，分別在10 h后和22 h后進入生長對數(shù)期和生長穩(wěn)定期。相比之下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在pH值3.2下生長被顯著抑制，培養(yǎng)16 h后才進入對數(shù)生長期，36 h后才進入穩(wěn)定期。另外，從圖中可以看出，到達穩(wěn)定期后，不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長總量（OD600nm）存在差異，依次為pH值4.0＞4.4≈3.6＞3.2。不同pH值下生長的菌體總量和生長延遲的現(xiàn)象與Zhao等[18]報道的結(jié)果一致，表明不同的pH值培養(yǎng)下對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長總量（OD600）有一定的影響。

圖2 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of Alicyclobacillus acidoterrestris under various pH

2.2 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的形態(tài)變化

采用掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察，進一步研究不同pH值生長環(huán)境對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響，結(jié)果如圖3a～d所示。從圖3c和d看到，pH值4.0和4.4生長下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體呈現(xiàn)短桿狀，為正常形態(tài)特征，與之前的文獻結(jié)果一致[19]；然而酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在pH值3.2與3.6生長條件下出現(xiàn)異常伸長，呈現(xiàn)絲狀形態(tài)，且pH值3.2培養(yǎng)的菌體更為明顯。Zhao等[18]也發(fā)現(xiàn)低pH值（2.8和3.4）培養(yǎng)下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌表現(xiàn)出類似的菌體形態(tài)延長的現(xiàn)象。Wehrens等[20]在大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)42 ℃的培養(yǎng)溫度對大腸桿菌進行脅迫，發(fā)現(xiàn)細菌能比正常狀態(tài)下伸長10～20倍，最長能達到40 μm，但是寬度幾乎不變，最終表現(xiàn)為長絲狀。這種菌體的絲化現(xiàn)象被認(rèn)為是細菌在應(yīng)對外部環(huán)境應(yīng)激時的自我保護機制之一[20]。

圖3 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

2.3 DBD-等離子體對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅作用分析

不同pH值條件下培養(yǎng)的菌體經(jīng)離心、洗滌并重新分散于無菌生理鹽水溶液和非濃縮蘋果汁中，采用DBD-等離子體進行處理。處理后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌梯度稀釋并進行平板培養(yǎng)，進而分析DBD-等離子體對不同pH值生長的菌體的致死作用，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，在生理鹽水（圖4a和b）和蘋果汁（圖4c和d）中，DBD-等離子體對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活量均隨著處理電壓和時間的增加而增大，且對不同pH值生長下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌殺滅效率表現(xiàn)出一定差異。例如當(dāng)處理電壓為20 kV，時間為1.0 min條件下，DBD-等離子體處理對pH值為3.2條件培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌殺滅效率為3.0個對數(shù)（圖4a）。相比之下，DBD-等離子體對pH值為3.6條件下培養(yǎng)的菌體滅活數(shù)顯著降低，僅為3.6個對數(shù)（P＜0.05），且pH值為4.0條件生長的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的死亡數(shù)量最低，約為1.1個對數(shù)（P＜0.05）。當(dāng)處理時間為2.0 min時，不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量都有一定的提高，但不同溫度之間酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活量仍有差異。其中DBD-等離子體處理引起pH值3.2條件培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量為4.7個對數(shù)，導(dǎo)致pH值為3.6和4.0培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的失活量則分別為4.2和2.7個對數(shù)（P＜0.05）。當(dāng)處理電壓為30 kV，處理時間為2.0 min時（圖4b），pH值3.2、3.6和4.0條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量分別達5.9、5.4和4.8個對數(shù)。以蘋果汁為處理體系也展現(xiàn)出類似的現(xiàn)象（圖4c和d）。

pH值為3.2～4.0范圍內(nèi)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對等離子體的耐受性的高低可能與菌體形態(tài)直接相關(guān)。研究表明，DBD-等離子體處理時能夠產(chǎn)生自由基如活性氮類和活性氧類物質(zhì)[8,21]，對細菌表面產(chǎn)生強烈的刻蝕作用導(dǎo)致細胞膜的破裂，進而引起菌體死亡。因此菌體表面積越大，所遭受的自由基損傷越嚴(yán)重[22]。相比于最適pH值4.0，pH值3.2和3.6條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌呈長桿狀，表面積顯著增加，由等離子引起的致死率顯著增加。pH值3.2條件下培養(yǎng)的菌體長桿狀數(shù)量更多、且長度相對更大，因而死亡率最高。

值得注意的是，DBD-等離子體對pH值為4.4條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài)正常，相比于pH值4.0生長的菌體表現(xiàn)出致死率更高的現(xiàn)象。該結(jié)果可能與菌體膜脂質(zhì)存在一定關(guān)系。大量研究表明，環(huán)境的改變可介導(dǎo)細菌細胞膜脂肪酸組成進而影響其對熱與非熱滅菌技術(shù)如脈沖電場、等離子體和超高壓等的耐受性[23,24]。例如，Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對脈沖電場的耐受性與細胞膜支鏈/直鏈脂肪酸含量有一定的聯(lián)系，柚皮素介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌為了增加細胞膜流動性，合成了更多的支鏈脂肪酸，進而更易被脈沖電場擊穿。Pan等[24]研究了不同溫度下李斯特菌對等離子體的耐受性，結(jié)果表明溫度越低李斯特菌對等離子體的耐受性越強，認(rèn)為主要與低溫下李斯特菌細胞膜中的支鏈脂肪酸（Anteiso-C15:0）相對含量增加有關(guān)，這類脂肪酸與親水性活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）相互作用，降低ROS滲入細胞內(nèi)部的效率，提高了李斯特菌對等離子體對DBD-等離子體的耐受性。

2.4 不同pH值下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌膜脂肪酸分析

為了驗證酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分與其對等離子體耐受性之間的關(guān)系，不同pH值下培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分經(jīng)提取，甲酯化和氣質(zhì)聯(lián)用分析，結(jié)果如表1所示。所檢測出的脂肪酸種類主要為7種，分別為肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、棕櫚油酸、油酸、環(huán)己烷十一酸（ω-Cyclohexyl C17:0）和環(huán)戊烷十三酸（ω-Cyclopentane C18:0）。這些膜脂肪酸可以分為三類，即直鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和環(huán)狀脂肪酸。從表中可以看出，在不同pH值條件下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜中以上三類脂肪酸的總量沒有太大變化（P＞0.05），但單一脂肪酸成分存在顯著差異（P＜0.05）。其中環(huán)己烷-11-十一酸在培養(yǎng)pH值為3.2時相對含量最低，占35.49%。隨著培養(yǎng)pH值的增加（3.2～4.4），環(huán)己烷-11-十一酸含量逐步增加，分別占48.37%、59.21%和67.86%（P＜0.05）。相比之下，環(huán)戊烷-13-十三酸的含量則出現(xiàn)下降的趨勢，隨著pH值的升高從53.83%降低至40.94%、31.61%和22.21%。研究表明，細菌處于不同環(huán)境下，為了維持一個合適的細胞膜流動性，會改變細胞膜中不同脂肪酸的含量[25,26]。其中直鏈脂肪酸可在細胞膜中排列整齊，堆疊性好而緊密。因此直鏈脂肪酸在細胞膜中所占比例越高，細胞膜的流動性越低[16]。相比之下，支鏈脂肪酸堆疊性差所占空間更大，因此更有利于增加細胞膜的流動性[24]。ω-環(huán)狀脂肪酸是一類較為特殊的支鏈脂肪酸，主要出現(xiàn)在嗜酸耐熱菌細胞膜中，且含量可達到60%～90%。本研究中，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌為嗜酸耐熱菌，環(huán)己烷-11-十一酸和環(huán)戊烷-13-十三酸占比超過80%。研究表明，堆疊疏松的ω-脂環(huán)脂肪酸可通過形成動態(tài)屏障，限制脂質(zhì)擴散和H+的跨膜擴散，從而保護嗜酸耐熱菌的免受H+的毒害作用[27]。最近的研究表明，ω-環(huán)狀脂肪酸在細胞膜中的堆積松散，引起脂質(zhì)尾部的有序度降低進而導(dǎo)致細胞膜流動性增加，并且ω-脂環(huán)脂肪酸中的環(huán)尺寸越大，其作用越明顯[28]。本研究中隨著培養(yǎng)pH值的上升（3.2～4.4），酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸的相對含量逐步增加，從48.37%增加至67.86%（P＜0.05），而環(huán)戊烷-13-十三酸的含量從53.83%減少至22.21%。該結(jié)果表明，pH值的升高，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜流動性逐步增加。由此可推斷，在低pH值條件下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌通過調(diào)整環(huán)己烷-11-十一酸與環(huán)戊烷-13-十三酸的相對比例降低細胞膜流動性，進而適應(yīng)低pH值環(huán)境達到生長的目的。

表1 不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的膜脂肪酸種類Table 1 Membrane fatty acid composition of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

與低酸（H+）作用機制不同，等離子體處理過程中會產(chǎn)生各類活性氧、活性氮成分如臭氧、羥基自由基、單線態(tài)氧自由基等會損害脂肪酸的功能，誘導(dǎo)脂質(zhì)尤其是不飽和脂肪酸的過氧化，甚至破壞細胞膜導(dǎo)致細胞裂解而引起細菌死亡[29,30]。另外，等離子處理產(chǎn)生的自由基還能跨過細胞膜進入細胞質(zhì)攻擊核酸等生物大分子[31]。由此可以推斷，環(huán)己烷-11-十一酸可能更有利于氧自由基等成分在細胞膜中的堆積，不僅引起細胞膜的破壞，還增加了氧自由基等成分的進入而引起細胞死亡。因此，相比于pH值4.0，pH值4.4條件下生長的菌體細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸含量的增加，是其對等離子體耐受性降低的潛在原因。

3 結(jié)論

本研究探討了不同pH值生長條件對DBD-空氣低溫等離子體滅活酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響，結(jié)果表明不同pH值條件下生長的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對DBD-空氣低溫等離子體的耐受性存在差異。其中pH值3.2條件下生長的菌體耐受性最低，pH值升高（3.2～4.0），菌體耐受性逐步增強，然而pH值4.4條件下生長的菌體對等離子體耐受性并未進一步增強，反而表現(xiàn)出降低的趨勢。這種耐受性的差異主要與菌體形態(tài)和菌體膜脂質(zhì)有關(guān)。掃描電鏡結(jié)果表明，pH值3.2和3.6條件下生長的菌體呈現(xiàn)長桿狀，使其表面積增大，因而菌體更易被自由基損傷而導(dǎo)致死亡。氣相-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)果顯示不同培養(yǎng)溫度下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜成分有一定的差異，且pH值的升高使細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸含量逐步升高，而環(huán)戊烷-13-十三酸則逐步降低。這種變化使pH值4.4培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌耐受性降低更易被DBD-空氣低溫等離子體導(dǎo)致氧化損傷而死亡。