• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制

      2023-09-08 09:25:50王德霞趙勇李榮辛輝
      山東醫(yī)藥 2023年25期
      關(guān)鍵詞:焦亡外泌體來(lái)源

      王德霞,趙勇,李榮,辛輝

      1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,山東青島266000;2 棗莊市山亭區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科

      心肌梗死是臨床常見的心血管疾病,近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率居高不下,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞,具有體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫原性低和多向分化潛能等特點(diǎn),是組織工程和細(xì)胞治療的常用種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死后移植BMSCs能夠顯著促進(jìn)梗死區(qū)域新生血管形成和受損心肌修復(fù)[2]。而BMSCs來(lái)源的外泌體被證實(shí)可提供與BMSCs相似的心臟保護(hù)作用[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)是一種具有低編碼概率的lncRNA,在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并扮演致癌基因的角色[6]。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA SNHG12可通過(guò)miR-218-5p/胰島素樣生長(zhǎng)因子2軸調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化中氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7],提示lncRNA SNHG12能夠抑制心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。但lncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制尚未闡明。2022年2月—2023年3月,本研究探討了BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

      1.料與方法

      1.1.料 大鼠BMSCs及心肌細(xì)胞H9c2,購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。SNHG12、SH-沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、miR-138-5p抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。IX51倒置顯微鏡,購(gòu)自日本Olympus公司;凝膠成像儀,購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀,購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。CD9、CD63一抗,購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;腫瘤易感基因101(TSG101)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、剪切的半胱氨酸蛋白酶1(Cleaved-Caspase-1)、剪切的焦孔素D(Cleaved-GSDMD)一抗,購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。IgG二抗,購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。外泌體提取試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒,購(gòu)自美國(guó)R&D公司;CCK-8試劑盒,購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司。

      1.2.MSCs轉(zhuǎn)染與外泌體提取 采用貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs并傳代。取傳3代BMSCs細(xì)胞3 × 105個(gè),接種至6孔板,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待BMSCs生長(zhǎng)至40%~60%融合時(shí),按Lipofectamine?3000說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染SNHG12。轉(zhuǎn)染48 h,收獲細(xì)胞并分離外泌體。當(dāng)BMSCs生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用無(wú)外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,收集上清液。上清液以2 000 × g離心20 min,再以10 000 × g離心40 min,然后用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。將上清液以100 000 × g超速離心70 min,重懸于PBS中,再以100 000 × g離心70 min除去任何剩余的RNA,并用含PBS和RNAse Ⅰ的混合物稀釋,最終獲得外泌體懸浮液。

      1.3.MSCs來(lái)源外泌體鑒定 取部分外泌體懸浮液,加入適量RIPA裂解液充分裂解,提取外泌體總蛋白。加入蛋白上樣緩沖液,煮沸變性。取變性蛋白,SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜,5%脫脂牛奶室溫封閉,然后分別加入CD9、CD63、TSG101一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,TBST洗膜后滴加IgG二抗,室溫孵育1 h。TBST洗膜,ECL發(fā)光,凝膠成像儀曝光并采集圖像。

      1.4.氧模型建立 取H9c2細(xì)胞,隨機(jī)分為陰性對(duì)照(NC)外泌體組與SNHG12外泌體組,分別加入等體積NC外泌體、SNHG12外泌體轉(zhuǎn)染;SNHG12外泌體 + miR138-5p抑制劑組與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組,分別加入等體積SNHG12外泌體 +miR138-5p抑制劑及SNHG12外泌體 + NC抑制劑轉(zhuǎn)染;SNHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組,分別加入等體積SNHG12外泌體 +SH-NC及SNHG12外泌體 + SH-SIRT1轉(zhuǎn)染。然后根據(jù)KOYAMA等[8]的方法制備缺氧溶液,將各組細(xì)胞與缺氧溶液共孵育6 h,建立體外缺氧細(xì)胞模型。

      1.5.癥因子檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,離心留取上清液。采用ELISA法檢測(cè)上清液IL-1β、IL-18。

      1.6.泌體特異性生物標(biāo)志物及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液充分裂解,提取細(xì)胞總蛋白。加入蛋白上樣緩沖液,煮沸變性。取變性蛋白,SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜,5%脫脂牛奶室溫封閉,然后分別加入NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,TBST洗膜后滴加IgG二抗,室溫孵育1 h。TBST洗膜,ECL發(fā)光,凝膠成像儀曝光并采集圖像。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。

      1.7.胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。收集各組細(xì)胞,接種至96孔板,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。

      1.8.胞凋亡率檢測(cè) 采用TUNEL法。收集各組細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,PBS潤(rùn)洗,置于冰上并使用0.1%Triton X-100透化處理,然后加入TUNEL反應(yīng)液,室溫黑暗孵育1 h。PBS洗滌,DAPI襯染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下采集圖像,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=每視野TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) × 100%。

      1.9.計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad7.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2.果

      2.1.MSCs來(lái)源外泌體鑒定 經(jīng)鑒定,BMSCs來(lái)源外泌體特異性標(biāo)志物CD9、CD63、TSG101表達(dá)均呈陽(yáng)性,證實(shí)成功獲取BMSCs來(lái)源外泌體。

      2.2.MSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 NC外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較見表1,NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)比較見表2。

      表1.C外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較(±s)

      表1.C外泌體組與SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比較(±s)

      注:與NC外泌體組比較,*P<0.05。

      組別NC外泌體組SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率(%)18.20 ± 3.03 14.00 ± 1.53*細(xì)胞活力(%)1.55 ± 0.32 2.39 ± 0.34*IL-1β(pg/mL)347.26 ± 18.06 99.68 ± 11.95*IL-18(pg/mL)194.59 ± 6.01 72.15 ± 10.34*

      表2.C外泌體組與SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      表2.C外泌體組與SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      注:與NC外泌體組比較,*P<0.05。

      組別NC外泌體組SNHG12外泌體組0.32 ± 0.04 0.15 ± 0.03*0.33 ± 0.07 0.18 ± 0.04*0.34 ± 0.06 0.17 ± 0.05*0.37 ± 0.07 0.21 ± 0.06*NLRP3ASCCleaved-Caspase-1Cleaved-GSDMD

      2.3.調(diào)miR-138-5p表達(dá)后BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 在缺氧心肌細(xì)胞中,下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后,BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞活力升高、細(xì)胞凋亡率降低(P均<0.05),見表3、4。

      表3.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      表3.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      注:與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組比較,*P<0.05。

      組別SNHG12外泌體 + NC抑制劑組SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組NLRP3 0.56 ± 0.11 0.37 ± 0.05*ASC 0.29 ± 0.03 0.15 ± 0.03*Cleaved-Caspase-1 0.61 ± 0.03 0.53 ± 0.14*Cleaved-GSDMD 0.42 ± 0.04 0.22 ± 0.04*

      表4.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

      表4.NHG12外泌體 + NC抑制劑組與SNHG12外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

      注:與SNHG12外泌體 + NC抑制劑組比較,*P<0.05。

      組別SNHG12 外泌體 + NC抑制劑組SNHG12 外泌體 + miR-138-5p抑制劑組細(xì)胞活力1.71 ± 0.26 2.06 ± 0.37*細(xì)胞凋亡率27.04 ± 3.52 19.83 ± 2.27*

      2.4.調(diào)SIRT1表達(dá)后BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12對(duì)體外缺氧心肌細(xì)胞的影響 在缺氧心肌細(xì)胞中,下調(diào)SIRT1表達(dá)后,BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.05),見表5、6。

      表5.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      表5.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      注:與SNHG12外泌體 + SH-NC組比較,*P<0.05。

      組別SNHG12外泌體 + SH-NC組SNHG12外泌體 + SH-SIRT1組NLRP3 0.20 ± 0.05 0.48 ± 0.04*ASC 0.48 ± 0.08 0.64 ± 0.10*Cleaved-Caspase-1 0.39 ± 0.05 0.50 ± 0.02*Cleaved-GSDMD 0.33 ± 0.02 0.49 ± 0.16*

      表6.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

      表6.NHG12外泌體 + SH-NC組與SNHG12外泌體 +SH-SIRT1組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

      注:與SNHG12外泌體 + SH-NC組比較,*P<0.05。

      組別SNHG12 外泌體 + SH-NC組SNHG12 外泌體 + SH-SIRT1組細(xì)胞活力1.44 ± 0.20 0.99 ± 0.27*細(xì)胞凋亡率18.30 ± 1.55 21.23 ± 2.86*

      3.論

      心肌梗死是臨床常見的急危重癥之一,典型臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作劇烈而持久的胸骨后或心前區(qū)壓榨性疼痛,休息或含服硝酸甘油不能緩解,常伴有煩躁不安、出汗、恐懼或?yàn)l死感。在心肌梗死過(guò)程中,當(dāng)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或急性血栓形成時(shí),會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧和能量代謝障礙,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[9]。因此,挽救和修復(fù)受損的心肌細(xì)胞是心肌梗死治療的重要目標(biāo)。

      BMSCs是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)中最有潛力的種子細(xì)胞。外泌體是一種由活體細(xì)胞通過(guò)胞吐方式釋放的小囊泡,其內(nèi)包含細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì),可介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞。近年來(lái),外泌體已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床疾病診治和生物技術(shù)領(lǐng)域,如干細(xì)胞治療、基因遞送、藥物運(yùn)載等。將外泌體注射到心肌梗死早期的心肌組織中,能夠顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡[10]。研究表明,BMSCs可通過(guò)釋放外泌體的方式,提供多種生物活性分子來(lái)修復(fù)受損的心肌細(xì)胞、減少梗死周邊區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)損傷心肌的再生性修復(fù)[11]。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。在心血管疾病中,lncRNA已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖、凋亡以及心肌肥厚、纖維化和血管生成等,改善心功能障礙[12]。外泌體來(lái)源lncRNA可抑制心肌細(xì)胞凋亡和焦亡,從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[13]。BMSCs衍生的外泌體lncRNA mir9-3hg可通過(guò)Pum2/PRDX6軸抑制缺血再灌注小鼠心肌細(xì)胞鐵死亡[14]。lncRNA SNHG12是一種具有低編碼概率的lncRNA,定位于人染色體1q25.1區(qū)域。有研究報(bào)道,SNHG12高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、阻遏細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成等,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。因此,lncRNA SNHG12被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但在心肌梗死中BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。

      本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在體外缺氧細(xì)胞中,SNHG12外泌體組細(xì)胞凋亡率顯著低于NC外泌體組,細(xì)胞活力顯著高于NC外泌體組。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。心肌梗死后會(huì)引起強(qiáng)烈的全身和局部炎癥反應(yīng),抑制或減弱炎癥反應(yīng)有利于心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞存活[15]。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性細(xì)胞程序性死亡方式。Caspase-1在細(xì)胞焦亡中起著至關(guān)重要的作用,Caspase-1激活可觸發(fā)炎癥因子IL-1β、IL-18釋放[16]。靶向細(xì)胞焦亡的抑制劑可減少心肌梗死面積和抑制炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡的特征在于GSDMD介導(dǎo)的膜孔形成,細(xì)胞腫脹和快速裂解,隨后大量釋放促炎癥介質(zhì)[17]。NLRP3是啟動(dòng)細(xì)胞焦亡的必要條件,心肌梗死患者血漿NLRP3水平顯著升高[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在體外缺氧細(xì)胞中,SNHG12外泌體組NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)和上清液IL-1β、IL-18水平均顯著低于NC外泌體組,細(xì)胞活力顯著高于NC外泌體組。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12能夠抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡。抑制miR-138-5p表達(dá)和過(guò)表達(dá)SNHG12均可上調(diào)SIRT1表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1在心肌梗死中具有心肌保護(hù)作用,敲除SIRT1基因小鼠心肌梗死面積顯著增大,而過(guò)表達(dá)SIRT1基因小鼠心肌梗死面積顯著縮?。?9]。有研究證實(shí),miR-138-5p可特異性結(jié)合SIRT1[20],而lncRNA SNHG12可靶向miR-138-5p[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-138-5p表達(dá)后,BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)顯著降低,細(xì)胞活力顯著升高、細(xì)胞凋亡率顯著降低;下調(diào)SIRT1表達(dá)后,BMSCs來(lái)源外泌體中SNHG12可導(dǎo)致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表達(dá)顯著升高,細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高。提示BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-138-5p/SIRT1軸抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡。

      綜上所述,BMSCs來(lái)源外泌體中l(wèi)ncRNA SNHG12可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-138-5p/SIRT1軸抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞焦亡和凋亡,從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

      猜你喜歡
      焦亡外泌體來(lái)源
      針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞焦亡的影響
      將來(lái)吃魚不用調(diào)刺啦
      miRNA調(diào)控細(xì)胞焦亡及參與糖尿病腎病作用機(jī)制的研究進(jìn)展
      外泌體miRNA在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展
      間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在口腔組織再生中的研究進(jìn)展
      循環(huán)外泌體在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展
      缺血再灌注損傷與細(xì)胞焦亡的相關(guān)性研究進(jìn)展
      電針對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白酶Caspase-1的影響
      試論《說(shuō)文》“丵”字的來(lái)源
      外泌體在腫瘤中的研究進(jìn)展
      章丘市| 隆安县| 公主岭市| 凌云县| 长岭县| 武义县| 蒙山县| 巴南区| 阿鲁科尔沁旗| 茶陵县| 龙山县| 清远市| 闸北区| 乡宁县| 娄烦县| 离岛区| 浮梁县| 沂南县| 吉首市| 津市市| 福建省| 五原县| 阳江市| 双辽市| 宜州市| 南通市| 尚志市| 桃源县| 伽师县| 永福县| 湘西| 罗山县| 元朗区| 长岭县| 石狮市| 札达县| 怀宁县| 句容市| 吴川市| 巨鹿县| 遂川县|