基于消熒光差分拉曼光譜技術(shù)預測食用油復熱時長

趙 迎 沈?qū)W靜 李小佳，*

（1鋼鐵研究總院，北京 100081；2鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司，北京 100094）

食用油是我國居民飲食中不可或缺的食物原料。新鮮優(yōu)質(zhì)的食用油包含了人體所需的多種有益不飽和脂肪酸和維生素，但長時間的高溫煎炸、反復多次加熱會使不飽和脂肪酸和維生素發(fā)生氧化、聚合、異構(gòu)化等一系列化學變化，產(chǎn)生對人體有毒有害的物質(zhì)。已有研究表明，在高溫下反復加熱會降低食用油不飽和脂肪酸含量，增加飽和脂肪酸、硬脂酸、反式脂肪酸的含量。其中，反式脂肪酸（tallow fatty acid，TFA）對人體危害較大，Cam 等［1］研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入反復加熱食用油后，小鼠體內(nèi)的基因表達狀況會發(fā)生改變，增加乳腺癌的發(fā)病風險；此外，研究發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸會對青少年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育造成不良影響［2-4］。

為提高餐飲服務(wù)食品安全水平，保障消費者身體健康，規(guī)范生產(chǎn)經(jīng)營行為，國家制定了《餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)［5-8］，極大程度地保障了食用油市場安全，但一些不良企業(yè)受利益驅(qū)使，無視國家法律，油炸用油的使用時長遠超過相關(guān)規(guī)定。此外，在日常監(jiān)督方面，我國監(jiān)管部門依然沿用傳統(tǒng)經(jīng)驗檢查法，缺少此方面的快速檢驗方法，監(jiān)督抽查的針對性不強、篩查能力下降；在檢測能力方面，現(xiàn)行食用油國家檢測標準僅適用于未使用過的油品，且國標方法檢測時間長，有毒試劑用量大，無法判斷是否為復熱油品；從檢驗方面看，監(jiān)督檢驗周期太長、效率太低，而且依照常規(guī)檢驗方法無法快速查明造假、變質(zhì)等問題，導致監(jiān)督檢驗的時效性不高、支撐力度不夠，無法為稽查提前或及時采取行政控制措施提供依據(jù)。因此，亟需一種可快速、準確鑒別食用油復熱時長的方法［9-14］。

基于檢測分子結(jié)構(gòu)等信息的振動光譜技術(shù)，是被公認為判定食用油加熱時長的最佳檢測技術(shù)。拉曼光譜分析技術(shù)和紅外光譜分析技術(shù)同為振動光譜分析技術(shù)，具有無污染、分析速度快、無損、現(xiàn)場、提供物質(zhì)的指紋圖譜等特點，已廣泛應用于食品等行業(yè)。目前已有紅外光譜分析技術(shù)用于食用油加熱時長分析的研究，而拉曼光譜在復熱食用油方面的研究很少。與紅外光譜對非對稱振動模式和極性基團的振動更有可能表現(xiàn)出顯著紅外吸收不同，對稱振動模式通常會引起強烈的拉曼散射，因此，采用拉曼光譜技術(shù)可以觀察到樣品的其他振動模式。此外，采用拉曼光譜法可有效檢測食用油在加熱氧化過程中C=C 鍵和脂質(zhì)碳骨架的化學變化，且光譜特征更為顯著，從而對食用油多次復熱總時長進行有效判別［15-20］。

在檢測食用油過程中，常規(guī)拉曼光譜不可避免地受到熒光光譜背景干擾［21-22］；尤其是基底較為復雜的食用油樣品，在加熱過程中，其熒光背景隨加熱時長變化［23］，導致后續(xù)數(shù)據(jù)模型的準確度降低。因此，采用合理的消熒光技術(shù)是建立基于拉曼光譜技術(shù)鑒別復熱油預測模型的前提?；诖耍狙芯繃L試采用消熒光差分拉曼光譜技術(shù)實現(xiàn)4 種常用植物油復熱時長的預測，自主研制消熒光差分拉曼檢測系統(tǒng)，分析并對比4種植物油的拉曼光譜，對比分析小波變換去背景拉曼光譜與消熒光差分拉曼光譜的主成分分析結(jié)果，采用偏最小二乘回歸（partial least-squares regression analysis，PLSR）方法分別建立4 種植物油復熱時長的預測模型［16，24］，并對預測結(jié)果進行分析和對比，以期為食用油復熱時長快速定量研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗以市售優(yōu)質(zhì)品牌的4種植物油為分析對象，詳細信息見表1。分別取4 種植物油各20 mL 置于燒杯中，將電加熱板溫度設(shè)置為250 ℃，溫度波動不超過2 ℃。當電加熱板溫度達到250 ℃后，將燒杯放置于電加熱板上，預熱1 min后開始計時，每加熱6 h后關(guān)閉電加熱板，使其溫度自然降至室溫，從燒杯中取2 mL樣品置于樣品瓶中，共加熱3次，總加熱時長為18 h，樣品加熱周期不超過3 d。共獲得0、6、12、18 h 加熱時長的4 種植物油樣品。

表1 植物食用油樣品詳細信息Table 1 Vegetable oil sample details

1.2 主要儀器與設(shè)備

研制自主知識產(chǎn)權(quán)的消熒光差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)，整機結(jié)構(gòu)及整機外觀如圖1 所示。激光器出射的激光經(jīng)線濾光片，去除等離子射線后，由雙膠合聚焦透鏡聚焦，垂直作用于樣品；樣品置于載物臺上，通過挾持工裝固定，并可以調(diào)節(jié)物鏡與樣品之間的距離；激光與樣品作用產(chǎn)生的拉曼散射光譜由雙膠合聚焦透鏡收集，截止濾光片濾除瑞利散射干擾后，經(jīng)雙膠合聚焦透鏡收集耦合進光譜儀進行分光和采集。試驗前，采用氖元素燈校準光譜儀波長的準確性，采用標準硅片校準激光器中心波長，采用標準光源校準光譜強度。

圖1 差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)示意圖及儀器Fig.1 Schematic diagram of the shifted excitation raman difference spectroscopy system

消熒光差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)采用雙波長784.5 nm&785.5 nm半導體激光器作為激發(fā)光源，輸出功率0 mW至500 mW 連續(xù)可調(diào)，且具有差分拉曼光譜工作模式和常規(guī)拉曼光譜工作模式。在差分拉曼光譜模式下，對待測樣品進行雙波長激光的拉曼光譜采集，并重建差分拉曼光譜；在常規(guī)拉曼光譜模式下，使用單一波長激光對樣品進行拉曼光譜采集。

1.3 試驗方法

試驗前，消熒光差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)需預熱10 min，測試條件：物距38.5 mm，積分時間1 s，積分次數(shù)5 次，激光功率450 mW。首先，分別使用差分拉曼光譜模式和常規(guī)拉曼光譜模式對樣品進行檢測，每個樣品分別采集100 組原始拉曼光譜及100 組差分拉曼光譜。然后，對采集的拉曼光譜進行小波變換處理及差分拉曼恢復處理。最終，每種樣品分別得到3 種類型的拉曼光譜數(shù)據(jù)：常規(guī)拉曼光譜數(shù)據(jù)、小波變換去背景拉曼光譜數(shù)據(jù)及消熒光差分拉曼光譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物油的拉曼光譜分析結(jié)果

4 種植物油的原始拉曼光譜如圖2 所示。結(jié)果表明，植物油的原始拉曼光譜均受到不同程度的熒光背景影響。熒光背景強度的差異主要由不同廠家制油工藝及樣品原料所致。植物油的原始拉曼光譜特征峰位相同、峰形近似，說明不同種類植物油的主要成分結(jié)構(gòu)相似，而拉曼特征峰強度的差異則是由樣品中成分含量比例不同所致。

植物油的原始拉曼光譜特征峰代表不同組分的官能團振動信息，其中，868 cm-1及1 078 cm-1分別為—（CH2）—基團的骨架伸縮振動；969 cm-1為RHC=CHR基團的C=C彎曲振動；1 265 cm-1及1 652 cm-1為RHC=CHR 基團的C=C 的伸縮振動；1 295 cm-1為—CH2的卷曲振動；1 442 cm-1為—CH2的剪式振動；1 742 cm-1為RC=OOR基團的C=O伸縮振動；2 847 cm-1為—CH2du對稱伸縮振動；2 907 cm-1為—CH2反對稱伸縮振動；2 992 cm-1為RHC=CHR 基團的=C—H 對稱伸縮振動［25-30］。

不同加熱時長植物油的拉曼光譜如圖3 所示。結(jié)果表明，隨著復熱時長的增加，4 種植物油的熒光背景呈現(xiàn)一致的下降趨勢，這是由于加熱導致熒光分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低了熒光背景強度。由于加熱過程中熒光背景的變化為多種熒光物質(zhì)變化的整體結(jié)果，熒光背景來源較為復雜，無法對熒光背景振動模式進行分析和有效歸屬，因此，基于原始拉曼光譜數(shù)據(jù)難以實現(xiàn)植物油復熱時長的有效檢測，需將熒光背景扣除后，基于拉曼光譜特征峰的變化進行植物油復熱時長判定方法開發(fā)。

圖3 不同加熱時長的植物油原始拉曼光譜Fig.3 Raman spectra of vegetable oil with different heating time

2.2 基于小波變換扣背景算法的食用油復熱時長定量模型

采用小波變換扣背景算法對原始拉曼光譜數(shù)據(jù)進行處理，選用db4小波函數(shù)，分解次數(shù)為5次重構(gòu)，得到熒光背景扣除后的拉曼光譜（圖4）。結(jié)果表明，4種植物油加熱時長的不同導致拉曼特征峰出現(xiàn)了明顯變化，這是由加熱過程中分子降解、順式脂肪酸和反式脂肪酸含量變化所致。局部放大的拉曼特征峰強度變化趨勢與加熱時長呈不一致現(xiàn)象，可能是由小波變換扣背景算法引起。此外，花生油、葵花籽油及大豆油熒光干擾較大，在低波數(shù)范圍內(nèi)，熒光背景難以用小波變換扣背景算法完全消除。

圖4 經(jīng)小波變換扣背景處理的植物油拉曼光譜Fig. 4 Raman spectra of vegetable oil with different reheating time treated by wavelet transform

進一步探究不同復熱時長是否存在差異及聚類現(xiàn)象，選取600～3 000 cm-1光譜范圍內(nèi)的所有拉曼特征峰信息進行主成分分析，考察聚類分析后是否能夠有效區(qū)分不同復熱時長，計算結(jié)果的前2 主成分空間分布如圖5 所示。4 種不同加熱時長植物油的前兩組主成分分量分布已展現(xiàn)出明顯聚類特性，但較分散且存在交叉情況。為實現(xiàn)油品復熱時長的定量分析，基于多項式線性擬合方法對其進行復熱時長的定量分析。采用均方根誤差確定最佳因子數(shù)，結(jié)果表明，最佳主因子數(shù)取20，累計貢獻率為89%（圖6）。

圖5 小波變換扣背景處理的4種植物油拉曼數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果Fig.5 The results of principal component analysis of four kinds of vegetable oil raman data which are processed by wavelet transform and background subtraction

圖6 不同主因子數(shù)的預測殘差平方和Fig.6 RMSE of oil with different principle factor numbers

在主成分分析基礎(chǔ)上，結(jié)合偏最小二乘回歸分析方法，選取主成分變換后前20 組變量，將每種復熱時長植物油取50 組拉曼光譜數(shù)據(jù)作為訓練集，得到復熱時長定量模型如圖7 所示。樣品編號1～50 為未復熱樣品、51～100為累計復熱6 h樣品、101～150為累計復熱12 h樣品、151～200為累計復熱18 h樣品。

圖7 經(jīng)過小波變換扣背景處理拉曼數(shù)據(jù)的偏最小二乘回歸分析結(jié)果Fig.7 The results of a partial least squares regression analysis of raman data which are processed by wavelet transform and background subtraction

由圖7 可知，基于小波變換算法扣除背景后的原始拉曼光譜建立的偏最小二乘回歸定量分析模型測試值和4 種植物油的復熱時長呈線性梯度關(guān)系。將每種復熱時長植物油剩余的50 組拉曼光譜數(shù)據(jù)作為驗證集，分別計算訓練集R2、驗證集R2、訓練集均方根誤差（root mean square of calibration，RMSEC）、驗證集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP），結(jié)果見表2。基于小波變換算法扣除背景后的原始拉曼光譜建立的偏最小二乘回歸定量分析模型，雖然可以預測食用油復熱時長，但訓練集及驗證集的均方根誤差較大，表明食用油復熱時長定量模型的精確度較低。

表2 植物油的預測模型結(jié)果Table 2 The results of prediction models for vegetable oils

2.3 基于差分拉曼光譜技術(shù)的食用油復熱時長定量模型

差分拉曼光譜如圖8 所示。與原始光譜經(jīng)小波變換扣除熒光背景相比，差分拉曼技術(shù)可在全譜范圍內(nèi)有效去除熒光背景干擾。隨著復熱時長增加，4 種植物油的局部放大拉曼特征峰強度變化趨勢與加熱時長相關(guān)，這是由于植物油加熱過程中成分含量的變化導致。

圖8 不同加熱時長植物油的差分拉曼光譜Fig.8 Differential raman spectra of vegetable oils with different heating lengths

進一步探究基于差分拉曼光譜技術(shù)的不同復熱時長是否存在差異及聚類現(xiàn)象，選取600～3 000 cm-1光譜范圍內(nèi)的所有拉曼特征峰信息進行主成分分析，考察聚類分析后是否能夠有效區(qū)分不同復熱時長，計算結(jié)果的前2 主成分空間分布如圖9 所示。與小波變換扣背景算法主成分對比，經(jīng)過差分拉曼技術(shù)處理的4 種不同加熱時長植物油的前兩組主成分分量集中度有所改善，且不同加熱時間分量基本可以區(qū)分。

圖9 植物油差分拉曼光譜的主成分分析結(jié)果Fig.9 Principal component analysis of differential raman spectroscopy of vegetable oil

為實現(xiàn)油品復熱時長的定量分析，將主成分分析與多項式線性擬合方法結(jié)合，進行復熱時長的定量分析。采用均方根誤差確定最佳因子數(shù)，結(jié)果如圖10 所示，最佳主因子數(shù)取6，累計貢獻率為98%。

圖10 不同主因子數(shù)的預測殘差平方和Fig.10 RMSE of oil with different principle factor numbers

同樣采用偏最小二乘回歸分析方法，以600～3 000 cm-1光譜范圍內(nèi)的所有拉曼特征峰強度參與運算，多項式變量設(shè)置為6，將每種復熱時長植物油取50組差分拉曼光譜數(shù)據(jù)作為訓練集，得到復熱時長定量模型如圖11所示。

圖11 差分拉曼光譜的偏最小二乘回歸分析結(jié)果Fig.11 The results of partial least squares regression analysis of differential raman spectra

由圖11 可知，基于消熒光差分拉曼光譜技術(shù)建立的偏最小二乘回歸定量分析模型測試值和4 種植物油的復熱時長呈明顯線性關(guān)系，與原始光譜經(jīng)小波變換扣除背景算法相比，其波動小、誤差低。將每種復熱時長植物油剩余的50 組差分拉曼光譜數(shù)據(jù)作為驗證集，分別計算訓練集R2、驗證集R2、訓練集RMSEC、驗證集RMSEP，結(jié)果見表3。與原始光譜經(jīng)小波變換扣除背景算法相比，基于差分拉曼光譜技術(shù)建立的偏最小二乘回歸定量分析模型訓練集R2及驗證集R2均有所提高，訓練集及驗證集的均方根誤差均降低，表明基于差分拉曼光譜技術(shù)可以有效提高定量模型的穩(wěn)定性和精確度。

表3 植物油的預測模型結(jié)果Table 3 The results of prediction models for vegetable oils

3 討論

本研究將消熒光差分拉曼光譜技術(shù)應用于植物油復熱時長有效定量檢測分析，為食用油復熱時長快速檢測方法研究提供了參考和借鑒。結(jié)果表明，原始拉曼光譜通過小波變換算法處理，可以在一定程度上消除熒光背景干擾，但基于此建立的植物油復熱時長回歸定量分析模型穩(wěn)定性和精確度較低。在自主研制的差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上，基于消熒光拉曼光譜建立的植物油復熱時長回歸定量分析模型，其穩(wěn)定性和精確度均有明顯提升，這與方方等［31］將差分拉曼光譜技術(shù)應用于化妝品中非法添加唑類抗真菌藥物定量研究結(jié)論一致。在食用油中反式脂肪酸含量檢測上，于慧春等［32］和付曉雅［33］分別采用常規(guī)拉曼光譜技術(shù)結(jié)合（non-information variable elimination combined with the support vector regression，UVE-SVR）算法實現(xiàn)了食用油中反式脂肪酸（trans fatty acids，TFAs）含量的檢測，TFAs含量與食用油復熱時長相關(guān)，這在一定程度上驗證了拉曼光譜技術(shù)用于食用油復熱時長定量的可行性，但其玉米油定量模型的相關(guān)性系數(shù)最高為0.958 5，有待進一步提升。在其他檢測方法上，Li 等［34］和劉雨琪［35］分別基于近紅外光譜技術(shù)對食用油中TFAs含量進行了測定，但該方法數(shù)據(jù)量較大，計算繁瑣，且近紅外光譜技術(shù)難以適用于遠程在線檢測場景。

本研究僅選用了固定的復熱溫度，并未探究溫度變化因素對模型的影響，下一步研究需對溫度變化影響進行探究。其次，本研究僅針對了4 種植物油，后續(xù)可以增加植物油品類。

4 結(jié)論

本研究分別采用常規(guī)拉曼光譜及差分拉曼光譜對4 種植物油復熱時長定量進行分析，結(jié)果表明，常規(guī)拉曼光譜受熒光背景干擾嚴重，難以實現(xiàn)植物油復熱時長有效定量檢測。通過小波變換算法處理，雖然可以基本消除熒光背景干擾，但算法會對拉曼光譜信號造成影響，基于此建立的偏最小二乘回歸定量分析模型，雖然能夠?qū)χ参镉蛷蜔釙r長進行定量分析，但模型定量準確度及精度較差。在完成自主研制的差分拉曼光譜檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地將差分拉曼光譜技術(shù)應用于植物油不同復熱時長定量檢測中，該方法不僅簡化了預測模型，而且明顯提高了模型定量分析能力的精確度，為植物油復熱時長定量快速檢測提供了一種可行的方法。