液相芯片技術(shù)在動(dòng)物遺傳育種中的應(yīng)用

張格陽，呂世杰，朱肖亭，翟亞瑩，張志浩，施巧婷，張子敬，屈俊峰，陳付英，王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450002；3.河南省科技創(chuàng)新促進(jìn)中心，河南鄭州 450008）

隨著全球化的深入發(fā)展，畜禽產(chǎn)品需求逐年遞增，中國畜牧業(yè)得到了高速平穩(wěn)的發(fā)展。畜禽種業(yè)是畜牧業(yè)的源頭，是畜牧業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。我國畜禽種業(yè)在經(jīng)歷了高速平穩(wěn)的發(fā)展后，面臨著一些卡脖子的問題，雖然我國種業(yè)技術(shù)發(fā)展已有長足進(jìn)步，但在種質(zhì)資源創(chuàng)新和基因編輯等核心技術(shù)方面，仍相對(duì)滯后。這導(dǎo)致了種業(yè)發(fā)展的瓶頸，也限制了中國在全球種業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中的作用。液相芯片技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，在協(xié)助育種工作者培育高品質(zhì)優(yōu)良畜禽品種中發(fā)揮了極大的作用。

1 概念和原理

液相芯片體系是一種通過聚苯乙烯微球制備的液相芯片系統(tǒng)，其主要基材是粒徑均勻直徑為5.5～5.6μm 的圓形微球[1]。該微球可以懸浮于液相中，構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)。微球上的不同探針分子可以與待測(cè)物特異性結(jié)合，利用這個(gè)系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多種不同分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。液相系統(tǒng)中的微球通常都具有獨(dú)特的熒光編碼或稱為色彩編號(hào)，可以通過熒光染料或者其他的方法進(jìn)行標(biāo)記。其中，熒光編碼是一種常見的方法[2,3]，通過在制造微球時(shí)將不同熒光染料混合在一起，使得微球具有不同的熒光信號(hào)和顏色。這樣一來，每種顏色的微球可以固定不同的探針分子，完成對(duì)多種不同物質(zhì)的同時(shí)鑒定和檢測(cè)。

在液相芯片技術(shù)中，測(cè)試樣品和報(bào)告分子被添加到96 孔板的培養(yǎng)基中與標(biāo)記的微球反應(yīng)。靶分子[3]（如待檢測(cè)的抗原或抗體、生物素標(biāo)記的靶核酸片段和酶等）會(huì)與探針和微球上的報(bào)告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶報(bào)告分子生物素和熒光素。通過這種標(biāo)記，在液相芯片技術(shù)中既能快速地對(duì)生物分子進(jìn)行分析，還能進(jìn)行多幀實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像的記錄。

2 液相芯片的特點(diǎn)

2.1 液相芯片技術(shù)優(yōu)勢(shì)

液相芯片技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的免疫學(xué)和核酸檢測(cè)方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

2.1.1 高通量

不同于傳統(tǒng)免疫分析方法，液相芯片技術(shù)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種分子的檢測(cè)及分析，可以在同一樣本中快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行不同目分子的定量和定性檢測(cè)，且用于檢測(cè)的微球種類數(shù)可多達(dá)100種。利用液相芯片技術(shù)，可以通過將熒光標(biāo)記在磁性微球表面，利用微流控系統(tǒng)將樣本與微球混合，并通過激光束對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量、定性分析，具有較好的重復(fù)性。

2.1.2 樣本用量少

液相芯片技術(shù)可以通過對(duì)芯片表面進(jìn)行不同標(biāo)記物的打印和生物分子的修飾，實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)完成多重生物學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)。這種技術(shù)在很大程度上降低了需要的樣本和試劑用量，降低了生物實(shí)驗(yàn)成本，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，提高了生物分析效率。

2.1.3 操作簡單、快速

液相芯片技術(shù)建立在液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上，因此可以通過微流控調(diào)控反應(yīng)條件來控制反應(yīng)速度，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的快速檢測(cè)。相比傳統(tǒng)的固相檢測(cè)方法，該技術(shù)的檢測(cè)步驟更簡單、更快速。免疫學(xué)分析時(shí)，選擇高親和力抗體，只需2～3h 即可完成檢測(cè)，同樣的，核酸雜交分析也只需要在PCR 擴(kuò)增后不到1h 就能得到精準(zhǔn)結(jié)果[4]。液相芯片技術(shù)除了反應(yīng)速度更快之外，還具有樣品孵育時(shí)間更短的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)橐合嘈酒夹g(shù)所采用的液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型自身具備快捷的反應(yīng)過程，從而使其在樣品檢測(cè)方面具有更高的時(shí)效性和敏感性。液相芯片技術(shù)通過微型化和自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，可以大幅度減少實(shí)驗(yàn)工作量和人力成本，數(shù)據(jù)分析過程也相對(duì)簡單快捷。

2.1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)量高

液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多種待測(cè)分子，可以減少樣本的消耗，并且可以避免數(shù)據(jù)偏差和誤差，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。

2.1.5 特異性強(qiáng)

液相芯片技術(shù)可以通過熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效、無需洗滌的自動(dòng)化檢測(cè)。同時(shí)，液相芯片微球與待測(cè)分子之間的結(jié)合通常是高度特異性的，這意味著只有目標(biāo)分子與微球結(jié)合后才會(huì)形成復(fù)合物，并通過共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光信號(hào)，未結(jié)合的分子不會(huì)產(chǎn)生干擾。

通過對(duì)兩類傳感器接收信號(hào)的分析與比較，發(fā)現(xiàn)R6α傳感器與Nano30傳感器均能得到較為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但是相比較而言，R6α頻帶窄，但響應(yīng)快，能盡可能多地接收到信號(hào)，保證巖石破裂過程的聲發(fā)射表征更為準(zhǔn)確。此外，還可以隔絕一些其他頻段的噪聲信號(hào)干擾，保證時(shí)序能量表征的準(zhǔn)確性，因此適合分析聲發(fā)射時(shí)域規(guī)律。而Nano30頻帶較寬，對(duì)于一些頻率成分較豐富的突發(fā)性信號(hào)，在頻率上能夠盡可能保證聲發(fā)射信號(hào)的完整性，保證巖石破裂過程聲發(fā)射信號(hào)頻率分析更為全面，故更適合分析巖石聲發(fā)射信號(hào)波形特征。此外，由于頻段較寬，一些非破裂信號(hào)也會(huì)采集到，在分析時(shí)應(yīng)進(jìn)行去噪處理。

2.1.6 準(zhǔn)確性高

根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)分子的濃度成正比，可以通過對(duì)熒光信號(hào)的測(cè)量來間接檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的存在及濃度大小，不需要像ELISA 檢測(cè)中那樣將樣本多倍稀釋，這可以減少誤差來源，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.1.7 靈活性強(qiáng)

液相芯片技術(shù)還可以對(duì)多種不同類型的樣品進(jìn)行檢測(cè)，如生物組織、體液等，同時(shí)，液相芯片技術(shù)在檢測(cè)樣品時(shí)通常無需做進(jìn)一步處理，比如無需進(jìn)行濃縮或稀釋。不僅可以用于核酸檢測(cè)，還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究。使用商品化試劑盒進(jìn)行分析時(shí)，可以根據(jù)具體的檢測(cè)項(xiàng)目，選擇合適的交聯(lián)微球和標(biāo)記分子的探針，并對(duì)其進(jìn)行靈活調(diào)整。

2.1.8 檢測(cè)范圍廣

液相芯片檢測(cè)范圍廣，主要包括細(xì)胞因子檢測(cè)、免疫分析、感染性疾病檢測(cè)、自身抗體檢測(cè)、疫苗效果評(píng)價(jià)、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)、免疫球蛋白分型等。液相芯片技術(shù)在分析速度、靈敏度、通量等方面有著極大的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于分子診斷、藥物篩選、生物學(xué)研究以及臨床實(shí)踐等領(lǐng)域。

2.2 液相芯片技術(shù)劣勢(shì)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)操作要求高

對(duì)于一些復(fù)雜的樣本（如血液、唾液等），還需要進(jìn)行一些樣本前處理，操作難度相對(duì)較大。液相芯片技術(shù)需要進(jìn)行多步驟操作，操作方法綜合要求比較高，不易上手，需要培訓(xùn)和專業(yè)知識(shí)。

2.2.2 初始設(shè)備和引物的制備成本高，原材料采購價(jià)格高昂

對(duì)于新的檢測(cè)目標(biāo)，首先需要開發(fā)適當(dāng)?shù)臏y(cè)量信號(hào)，同時(shí)應(yīng)選用不同種類的微小顆粒，這需要前期高昂的投資。熒光編碼微球是目前制備液相芯片技術(shù)的核心設(shè)備，國內(nèi)技術(shù)發(fā)展的滯后給液相芯片相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了諸多困難與挑戰(zhàn)。國外壟斷了制備液相芯片的高性能、高附加值的熒光微球材料，國內(nèi)所使用的材料幾乎都從國外高價(jià)進(jìn)口，因此國內(nèi)液相芯片的發(fā)展也受到了極大的阻礙。

3 液相芯片在動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 液相芯片在全基因組關(guān)聯(lián)分析和全基因組選擇育種中的應(yīng)用

隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們根據(jù)研究需求設(shè)計(jì)了不同類型的液相芯片用于畜禽遺傳特性解析、品種鑒定、資源保護(hù)和新品種開發(fā)等工作，例如 “神農(nóng)1 號(hào)” 地方雞基因組系列液相芯片、“吉牛1 號(hào)” 肉牛20K 液相育種芯片、湘豬64K cGPS 液相芯片、綿羊40K 液相基因芯片等。郭應(yīng)威[5]基于靶向捕獲測(cè)序技術(shù)的40K 綿羊液相芯片，其中包含了40156 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。該芯片利用高通量技術(shù)，對(duì)323 只湖羊和東佛里生綿羊雜交F2代（即東湖羊）進(jìn)行基因分型，篩選后檢測(cè)到209625 個(gè)高質(zhì)量SNPs，其目標(biāo)位點(diǎn)平均捕獲效率達(dá)99.7%，平均測(cè)序深度為70X。邱奧等[6]開發(fā)的豬50K SNP 液相芯片是一種用于品種鑒定、系譜校正、基因定位和基因選擇等多種用途的芯片。它提供了高通量的檢測(cè)能力，包括50000 個(gè)位點(diǎn)，可以高效地檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，從而加速了品種鑒定和遺傳研究。陳宇[7]等研究表明，將豬液相芯片從10K 基因位點(diǎn)擴(kuò)充到50K 是可行的。這一擴(kuò)充方案可以在大規(guī)模的基因組選擇中應(yīng)用，并降低相關(guān)育種成本。實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)增加了代謝和育種相關(guān)基因組位點(diǎn)的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)了豬基因組育種信息資源的擴(kuò)展。

3.2 液相芯片在疾病抗性選擇育種中的應(yīng)用

現(xiàn)代動(dòng)物育種的目標(biāo)之一是提高動(dòng)物的疾病抗性。傳統(tǒng)的家系育種方法受到諸多限制，如多性狀選擇的難度大、易造成血緣增強(qiáng)（Inbreeding）等。相比之下，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行選擇，尤其是針對(duì)涉及多個(gè)基因的特殊疾病，可以更為準(zhǔn)確地選擇具有高抗性的個(gè)體。相應(yīng)地，針對(duì)不同物種疾病的抗性液相芯片的研究將有助于提高動(dòng)物的抗性選擇準(zhǔn)確性，加速育種進(jìn)程。

劉錦宇等[8]開發(fā)了液相芯片40K SNP “黃海芯1 號(hào)”，利用該芯片對(duì)AHPND 抗性測(cè)試個(gè)體進(jìn)行基因分型，并通過ssGBLUP 與ssBR 等方法復(fù)合系譜和基因型信息，評(píng)估AHPND 抗性，極大提高了AHPND 抗性的選擇準(zhǔn)確性。丁向東等[9]研究利用實(shí)例確證了液相芯片在基因組選擇育種中的高效性。與傳統(tǒng)的基因組選擇策略相比，液相芯片技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，從而大幅縮短了育種周期，并且檢測(cè)成本也大幅降低。這一技術(shù)的優(yōu)越性表現(xiàn)在成本更低、育種效率更高、易于實(shí)現(xiàn)等方面。在丁向東等[9]的實(shí)驗(yàn)中，液相芯片技術(shù)成功地篩選出具有理想性狀的優(yōu)異品種，為育種工作帶來了加速效果。郭喜玲等[10]研發(fā)了一種能識(shí)別甲型流感病毒的NP 基因、乙型流感病毒的HA 基因以及H5N1 亞型AI 病毒的H5 和N1 基因的液相芯片技術(shù)，其對(duì)病毒核酸的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1pg。Lamaire 等[11]人建立了一種多重液相芯片方法，用于區(qū)分單一和混合感染中的禽呼吸道病毒。這個(gè)液相芯片方法可以同時(shí)檢測(cè)AIV、NDV、IBV 和ILTV，而且用時(shí)更短，樣本需求更少。采用液相芯片技術(shù)對(duì)70 個(gè)臨床樣本進(jìn)行了準(zhǔn)確的檢測(cè)，并證實(shí)該技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與單一實(shí)時(shí)熒光定量PCR 一致。王慧煜等研究人員設(shè)計(jì)了一種基于微球偶聯(lián)的探針，針對(duì)禽流感病毒M 基因進(jìn)行液相芯片檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法具有特異性，可以特異性地檢測(cè)出禽流感病毒；同時(shí)，該方法的最低檢出量也非常低，僅為10-4ng/μL 的病毒核酸。劉春梅[12]利用液相芯片技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)小鼠三種病毒的方法。王瑩[13]通過液相芯片技術(shù)建立多種豬源性外來病液相芯片檢測(cè)的方法。楊顯超[14]利用液相芯片技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)豬繁殖障礙病毒的方法。張曉娜等[15,16]建立的AIV 多重液相芯片技術(shù)具有高度的特異性和靈敏度。該技術(shù)對(duì)禽流感病毒的H5、H7 和H9 亞型識(shí)別特異性很高，并且經(jīng)過優(yōu)化，可以同時(shí)識(shí)別多個(gè)流感病毒亞型，包括NDV、IBV、ILTV 等至少6 種病毒。該技術(shù)敏感性明顯提高，最低檢測(cè)限可達(dá)到10-4ng/μL 的病毒核酸，相對(duì)于傳統(tǒng)的RT-PCR/PCR 檢測(cè)方法，具有更高的檢測(cè)能力。Wu 等[17,18]開發(fā)了一種液相芯片分析方法來監(jiān)測(cè)兔出血性疾病病毒（RHDV）、兔輪狀病毒（RRV）和仙臺(tái)病毒（SeV）三種兔病原體的核酸。該方法的三種病毒的檢出限為102 拷貝/μL。經(jīng)過檢測(cè)，使用這種方法得到的結(jié)果與常規(guī)的RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果一致。劉志玲等[19]人基于原核表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建了一種牛白血病病毒(gp51)的重組蛋白抗原。利用該抗原，他們建立了一種液相芯片檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)牛白血病病毒抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該技術(shù)具有極高的敏感性，達(dá)到119.7ng/μL。樣本量為169 份的臨床牛血清中，該技術(shù)檢測(cè)出陽性率為57.4%。此外，與ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，液相芯片技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果符合率高達(dá)94.67%。該項(xiàng)研究成果為日后多重液相芯片檢測(cè)牛病的研究奠定了基石，為動(dòng)物疫病的相應(yīng)研究提供了有益的啟示。

3.3 液相芯片在檢測(cè)動(dòng)物致病基因研究中的應(yīng)用

篩選動(dòng)物的致病基因，能夠幫助人們更好的了解和研究致病基因與疾病之間的關(guān)系，為動(dòng)物的遺傳育種提供參考。

有研究使用液相芯片技術(shù)檢測(cè)了斑馬魚體內(nèi)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MYH6 和MYH7 等關(guān)鍵基因的表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因與人類肝癌、肝炎等疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。這一結(jié)果為基于斑馬魚模型進(jìn)行腫瘤等多種疾病的研究提供了有力的支撐[20]。根據(jù)研究，Aβ 和Tau 基因表達(dá)的變化是導(dǎo)致阿爾茲海默癥發(fā)生的重要原因。研究人員使用液相芯片技術(shù)對(duì)帕金森病和阿爾茲海默病模型的海馬體組織中的miRNA 進(jìn)行檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)了兩種疾病模型中表達(dá)顯著的兩種miRNA：miR-27a-5p 和miR-148a-5p[21]。研究者使用液相芯片技術(shù)篩查了脂肪肝大鼠模型的肝臟組織，發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4 和CCR2 等基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。這些基因的表達(dá)受到脂肪肝的刺激，并且能夠調(diào)控細(xì)胞因子的分泌[22]。

4 展望

目前，液相芯片技術(shù)在動(dòng)物遺傳育種中已經(jīng)取得了顯著成效。通過該技術(shù)，育種單位或公司可以建立育種聯(lián)盟或聯(lián)合體，在育種過程中實(shí)現(xiàn)信息和資源共享，從而提高育種的效率和質(zhì)量。在這樣的背景下，液相芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物育種研究中，大大推動(dòng)了我國農(nóng)業(yè)育種的發(fā)展和升級(jí)。

可以預(yù)見，在數(shù)字化技術(shù)、生物信息學(xué)和育種技術(shù)的不斷發(fā)展下，液相芯片技術(shù)將會(huì)在農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。同時(shí)，它也將有助于加強(qiáng)不同育種單位之間的合作和交流，推動(dòng)育種研究的集約化和區(qū)域化發(fā)展。