除草劑分子靶標研究進展

唐 婷, 陳東雨, 張子葉, 楊文超*,,

(1.貴州大學 精細化工研究開發(fā)中心，綠色農(nóng)藥全國重點實驗室，貴陽 550025；2.華中師范大學化學學院，綠色農(nóng)藥全國重點實驗室，武漢 430079)

我國每年農(nóng)田雜草危害發(fā)生超過9.3 億公頃，由此造成的經(jīng)濟損失達2200 億元[1]，除草劑的使用挽回了巨大的損失。然而，除草劑抗性問題日益嚴重，已成為威脅全球糧食安全的關鍵問題之一。截止2022 年11 月，全世界已報道515 種除草劑抗性雜草生物型，其中267 種分布在72 個國家，涉及97 種作物[2]。我國是世界上雜草抗性危害最為嚴重的5 個國家之一，其中抗性雜草最多的是小麥田和水稻田。按不同類型劃分的抗除草劑雜草種類見圖1。圖1 左 為按作用模式劃分的抗除草劑雜草種類，從圖中可以看出，不同靶標雜草抗性數(shù)量在逐年增加，其中作用模式為乙酰羥酸合酶的雜草抗性數(shù)量最多；由圖1 右可以看出，莠去津是物種產(chǎn)生抗性最多的一類除草劑，其次是草甘膦。這些抗性雜草危害嚴重，防治困難，而除草劑新分子靶標的發(fā)現(xiàn)有利于緩解抗性雜草這一嚴重問題。為此，本文在蘇少泉[3]和譚效松等[4]總結除草劑分子靶標類型和功能的基礎上，回顧了近30 年來發(fā)現(xiàn)的除草劑分子靶標，并重點介紹分子靶標的生理功能、除草劑作用機制、除草劑作用范圍以及靶標分子結構的研究進展；同時簡單介紹當前新靶標發(fā)現(xiàn)的困境、靶標發(fā)現(xiàn)的新技術以及對未來除草劑靶標發(fā)現(xiàn)的展望。

圖1 代表性除草劑及代表性作用靶點的抗性統(tǒng)計Fig.1 The chart of resistance for representative targets and herbicides

1 近30 年的除草劑分子靶標匯總

除草劑的作用靶標多為植物生命活動代謝途中的各種酶，如解偶聯(lián)蛋白是二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP) 氧化磷酸化過程的催化酶，原卟啉原氧化酶催化亞鐵血紅素和葉綠素的合成，這些酶均為植物生長必需酶，若缺失或阻斷這些酶的合成途徑，將會導致植物出現(xiàn)不同癥狀的死亡。按照除草劑作用機制的不同，可將除草劑分為：光合作用抑制劑、呼吸作用抑制劑、生物合成抑制劑、纖維素合成相關、生長抑制劑、核苷酸合成相關和其他7 類(表1)。本文重點介紹除草劑作用機制對應的分子靶標的生理功能、除草劑的作用機制和代表性品種(防治對象和應用范圍)。

表1 除草劑靶標的分類及其代表性除草劑品種Table 1 Classification of herbicide molecular targets and their representative herbicides

2 除草劑分子靶標的生理功能和三維結構研究

本節(jié)擬從除草劑施用后，影響雜草光合作用、呼吸作用、生物合成、纖維素合成、生長抑制、核苷酸合成相關和其他7 類出發(fā)，詳細介紹除草劑分子靶標的生理功能、除草劑施用對象及施用范圍，為了解現(xiàn)有除草劑分子靶標以及同一分子靶標不同種屬蛋白空間活性的差異性，對每個靶標不同種屬的蛋白制作了相應的A 鏈三維疊合圖。

2.1 光合作用抑制劑

2.1.1 光系統(tǒng)I 電子傳遞 光合作用是綠色植物(包括某些細菌)將光能轉化為自身所需的糖類等有機物的生化過程。光合作用又分為兩個過程：光系統(tǒng)I 和光系統(tǒng)II。光系統(tǒng)I 較多分布于類囊體膜基質膜區(qū)，是由蛋白亞基組成的色素蛋白復合物，其主要作用為：在光合電子傳遞鏈中，將電子從類囊體膜內轉移到膜外鐵氧還蛋白，在鐵氧還蛋白——輔酶II(NADP) 還原酶作用下，將NADP+還原為還原型輔酶II(NADPH)[5]。抑制光系統(tǒng)I 的除草劑是阻斷植物的光電子傳遞，破壞還原型輔酶II 的形成，進而阻斷植物進行光合作用。百草枯(paraquat)是這類除草劑的代表，其作用機理為：在一定條件下，植物光合膜產(chǎn)生的電子與百草枯離子反應生成自由基，該自由基被植物體內的氧氣還原，產(chǎn)生活性氧(ROS)，高活性ROS 不僅能攻擊細胞膜的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂自由基，還能迅速打開并分解細胞膜及組織，導致植物體內細胞組織嚴重失水，最后植物因失水過多而枯萎死亡[6]。

2.1.2 光系統(tǒng)II 的D1 蛋白 光系統(tǒng)II 是植物將電子從水中轉移到質體醌中，質體醌再與D1 蛋白結合[7]。D1 蛋白是光系統(tǒng)II 反應中心一種重要的亞基蛋白，該蛋白可為各種輔助因子提供結合位點，與原初電荷分離和傳遞有關，如果D1 蛋白被破壞，會導致光合電子傳遞受阻進而影響光系統(tǒng)II 反應中心，而影響光合作用[8]。抑制光系統(tǒng)II 的除草劑是一類與質體醌競爭D1 蛋白的藥劑，通過與D1 蛋白結合，阻斷電子從QA位點傳到QB位點，抑制光合作用的發(fā)生[9]。莠去津(atrazine)是這類除草劑的代表，主要用于玉米、甘蔗、高粱等地的芽前、芽后化學除草。施用莠去津后，雜草通過根部吸收莠去津并向上傳導，莠去津會與質體醌競爭D1 蛋白。當莠去津與D1 蛋白結合后，將導致質體醌與D1 蛋白的結合和電子傳遞受阻，這些電子就會與細胞膜中的油脂反應，破壞細胞膜，最終導致雜草死亡[10]。

2.1.3 八氫番茄紅素去飽和酶 類胡蘿卜素參與植物光合作用，其是類囊體膜上光合元件關鍵結構的組成部分。八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的一個限速酶[11]，八氫番茄紅素通過PDS 兩步脫氫，形成ζ-胡蘿卜素，ζ-胡蘿卜素在ζ-胡蘿卜素脫氫酶的作用下，最終形成番茄紅素[12]。呋草酮(flurtamone)是這類除草劑的代表，其通過抑制雜草中的PDS，阻礙類胡蘿卜素的合成而達到除草效果[13]。

本文選取了菠蘿泛菌Pantoea ananatis(PDB編號：4DGK，分辨率：2.35 ? (1 ? = 0.1 nm) )和水稻Oryza sativaL.(PDB 編號：5MOG，分辨率：2.77 ?) PDS A 鏈[14-15]制作蛋白結構疊合圖(圖2)，運用pymol 軟件疊合，得出均方根偏差(RMSD)約為10.034 ?，水稻蛋白(藍色)結構和菠蘿泛菌蛋白(綠色) 結構相同點：兩者都有3 個結構域，蛋白折疊相似；其不同點：菠蘿泛菌的活性空腔比水稻的略大。

圖2 水稻和菠蘿泛菌蛋白A 鏈三維結構疊合圖Fig.2 Tthree-dimensional structure superposition of Oryza sativa L.and Pantoea ananati protein A chain

2.1.4 番茄紅素環(huán)化酶 番茄紅素環(huán)化酶包括番茄紅素β-環(huán)化酶和番茄紅素ε-環(huán)化酶[16]，二者都是類胡蘿卜素生物合成途徑的酶。抑制番茄紅素環(huán)化酶的除草劑代表有殺草強(amitrole)[17]，該除草劑用于控制一年生雜草和水草(但不能用于糧食作物田雜草的防除[18])。

2.1.5 原卟啉原氧化酶 原卟啉原氧化酶(PPO)是植物體內四吡咯生物合成途徑中最后一個酶。PPO 通過催化原卟啉原IX 生成原卟啉IX[19]，原卟啉IX 是葉綠素和血紅素合成途徑中物質。抑制PPO 的除草劑主要作用機制是：除草劑抑制PPO，造成原卟啉原IX 的積累，導致原卟啉原IX 外泄到細胞質中，在細胞質中迅速被氧化成原卟啉IX，而細胞質中的原卟啉IX 不能被利用，導致植物光合作用受到影響[20]。抑制PPO 的除草劑代表有雙唑草腈(pyraclonil)，雙唑草腈是觸殺型除草劑，通過抑制PPO 發(fā)揮藥效作用，能有效抑制各類雜草，如稗草、闊葉雜草和莎草以及耐磺酰脲類除草劑的雜草等[21]。

本文選取了枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(PDB 編號：3I6D，分辨率：2.90 ?)、煙草Nicotiana tabacumL.(PDB 編號：1SEZ，分辨率：2.90 ?)、黃色粘球菌Myxococcus xanthus(PDB 編號：2IVD，分辨率：2.30 ?)和人Homo sapiens(PDB編號：3NKS，分辨率：1.90 ?)的PPO A 鏈[22-25]制作蛋白結構疊合圖，見圖3。由圖3 可知枯草芽孢桿菌蛋白(紫色)和煙草蛋白(藍色)疊合程度較好，黃色粘球菌(綠色)、人(棕黃色)的蛋白結構與枯草芽孢桿菌和煙草蛋白相似度不高，但兩者活性空腔略大。

圖3 PPO 不同種屬A 鏈三維結構疊合Fig.3 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of protoporphyrinogen oxidase

2.2 呼吸作用抑制劑——解偶聯(lián)蛋白

解偶聯(lián)是指生物呼吸鏈與氧化磷酸化的偶聯(lián)遭到破壞的現(xiàn)象。解偶聯(lián)劑(抑制解偶聯(lián))作用于植物氧化磷酸化部位后，由ADP 生成ATP 的反應受到抑制，導致ADP 濃度升高，雖然可以增強植物呼吸作用，卻因不能生成ATP 來滿足植物生長發(fā)育的需求，最終導致植物代謝過程損壞。如草不隆(neburon)和環(huán)草隆(siduron)是馬鈴薯塊莖線粒體中氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑[26]。

2.3 生物合成抑制劑

2.3.1 乙酰輔酶A 羧化酶 植物脂肪酸是油脂以及磷脂的重要組成部分，是重要的能源物質以及信號傳導分子。乙酰輔酶A 羧化酶(ACCase)催化丙二酰輔酶A 的合成，丙二酰輔酶A 在質體中用于脂肪酸合成[27]。氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是芳氧基苯氧基丙酸酯中唯一對水稻安全性高的除草劑，通過抑制雜草ACCase 的活性，使脂肪酸合成停止，細胞生長和分裂不能正常進行，最終導致雜草死亡，此外氰氟草酯對中華鉤端草也有較好的防治效果[28]。

本文選取了大腸桿菌Escherichia coli(PDB 編號：2F9Y，分辨率：3.20 ?)、嗜熱毛殼菌變種DSM 1495 (Chaetomium thermophilumvar.thermophilumDSM 1495)(PDB 編號：5I6I，分辨率：8.40 ?)和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae(PDB 編號：5CSA，分辨率：3.00 ?)的 ACCase A 鏈[29-31]制作蛋白結構疊合圖 (圖4)，運用pymol 軟件疊合，從圖中可以看出這3 類蛋白相似度不高，嗜熱毛殼菌變種DSM 1495(粉紅色) 和釀酒酵母蛋白(藍色)結構比大腸桿菌蛋白(綠色)結構大。

圖4 ACCase 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.4 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of ACCase

2.3.2 脂肪酸硫酯酶 脂肪酸硫酯酶(FAT)是脂肪酸合成過程中控制鏈長，促使脂肪酸從?；d體蛋白釋放的酶。抑制FAT 的除草劑會通過與FAT 結合，抑制脂肪酸的釋放[32]。環(huán)庚草醚(cinmethylin) 可抑制FAT 活性，作為苗前除草劑，已被引入澳大利亞谷物種植，用于控制一年生黑麥草[33]。甲硫唑草啉(methiozolin)是一種新型除草劑，用于控制幾種暖季和冷季草坪草中的一年生藍草[34]。

2.3.3 茄尼基焦磷酸合酶 質體醌脂質尾的組成部分是二磷酸茄醇，它是通過茄尼基焦磷酸合酶(SPS)的活性獲得的，SPS 催化七異戊烯基二磷酸依次加成形成香葉基二磷酸[35]。SPS 是2020 年被Kahlau 等[35]證實為除草劑苯草醚(aclonifen)的作用靶標，是一種全新的除草劑作用模式。SPS 被抑制，能引起雜草體內質體醌水平急劇下降，最終導致雜草被漂白[36]。

2.3.4 尿黑酸茄尼酯轉移酶 尿黑酸茄尼酯轉移酶(HST)是質體醌生物合成途徑中對羥基苯基丙酮酸雙加氧酶的下游酶。HST 催化尿黑酸的異戊烯化和脫羧形成2-甲基-6-茄烷基-1,4 苯并喹醇，這是質體醌生物合成中的第一個中間體[35]。Shin 等[37]在2018 年證實，除草劑環(huán)噠嗪草酯(cyclopyrimorate)的靶位點是HST，HST 被認為是一種新型的商業(yè)除草劑分子靶標。

2.3.5 乙酰羥酸合成酶 乙酰乳酸合酶，也稱為乙酰羥基酸合酶(AHAS)[38]。AHAS 是支鏈氨基酸生物合成途徑中的一個關鍵酶，支鏈氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，若植物缺乏這3 種氨基酸，將影響蛋白質合成，抑制細胞分裂，導致雜草組織失綠、黃化、生長受阻，最后雜草逐漸死亡[35]。除草劑五氟磺草胺(penoxsulam)作用靶點是AHAS，為苗后除草劑，用于水稻田雜草防治。五氟磺草胺可與雜草中AHAS 的結合部位競爭性結合，從而影響雜草體內氨基酸的合成，抑制雜草生長，雜草生長點因失綠而逐漸壞死[39]。本文選取了哈茨木霉Trichoderma harzianum(PDB 編號：7EGV，分辨率：2.54 ?)、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae(PDB 編號：1OZG，分辨：2.30 ?)、海棲熱袍菌MSB8Thermotoga maritimaMSB8 (PDB 編號：2FGC，分辨率：2.30 ?)和枯草芽孢桿菌B.subtilis(PDB 編號：4RJI，分辨率：3.20 ?)的AHAS A 鏈[40-43]制作蛋白結構疊合圖，見圖5。蛋白疊合圖以枯草芽孢桿菌蛋白(藍色)為主體進行疊合，可以看出，除了海棲熱袍菌蛋白(綠色)結構與其他不同，其余蛋白結構相似。

圖5 AHAS 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.5 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of AHAD

2.3.6 二羥基酸脫水酶 二羥基酸脫水酶(DHAD)是支鏈氨基酸生物合成途徑中一種常見酶，在不同的植物物種中高度保守。研究證明，DHAD 是一個良好的除草劑分子靶標，作用于DHAD 的除草劑不會對哺乳動物造成影響，因為哺乳動物體內并不存在支鏈氨基酸生物合成途徑[35]。加州大學洛杉磯分校一個課題小組使用抗性基因為導向的基因組挖掘技術，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物天冬氨酸(aspterric acid)可以靶向作用于DHAD，從而起到抑制植物生長的作用[44]。

本文選取了集胞藻Synechocystissp.(PDB 編號：6NTE，分辨率：2.33 ?)和擬南芥Arabidopsis thaliana(PDB 編號：5YMO，分辨率：1.84 ?)的DHAD A 鏈[45]制作蛋白結構疊合圖 (圖6)，得出RMSD 約為1.123 ?，表明兩者蛋白結構相似，但集胞藻(綠色)的活性空腔比擬南芥(藍色)的活性空腔大。

圖6 DHAD 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.6 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of DHAD

2.3.7 5 -烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是葉綠體中的一種酶，它催化莽草酸合成途徑的倒數(shù)第2 步反應，是合成芳香族氨基酸以及部分次生代謝物過程的關鍵酶[46]。抑制EPSPS，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化，使蛋白質合成受到干擾，導致植物死亡[35]。草甘膦(glyphosate)作用于雜草分子靶標的EPSPS，雜草通過莖葉吸收后傳導到植物各部位，可防除單子葉、雙子葉、一年生、多年生、草本和灌木等40 多科植物[47]。

本文選取了大腸桿菌E.coli(PDB 編號：1MI4，分辨率：1.70 ?)、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae(PDB 編號：1RF4，分辨率：2.20 ?)和白假絲酵母Candida albicans(PDB 編號：7TBU，分辨率：1.85 ?) EPSPS A 鏈[48-50]制作蛋白結構疊合圖 (圖7)。運用pymol 軟件以大腸桿菌蛋白(綠色) 結構為主體進行疊合后發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母蛋白(粉紅色)結構活性空腔比大腸桿菌和肺炎鏈球菌蛋白(藍色)活性空腔大。

圖7 EPSPS 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.7 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of EPSPS

2.3.8 絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶 絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶催化結構域在動物、植物和原生動物中高度保守。但張曉晨等[35]認為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶是斑蝥素(水泡甲蟲和西班牙蒼蠅的天然產(chǎn)物)及其類似物作用于木霉菌的靶標。絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶是茵多酸(endotha)的靶標，茵多酸誘導嚴重的生長抑制，用于管理水生環(huán)境中的雜草。

本文選取了釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae(PDB 編號：3ICF，分辨率：2.30 ?)、人H.sapiens(PDB 編號：3H67，分辨率：1.65 ?)、白假絲酵母Candida albicans(PDB 編號：5JPE，分辨率：2.61 ?)、埃希氏菌病毒λ(Escherichiavirus lambda)(PDB 編號：1G5B，分辨率：2.15 ?)、褐家鼠Rattus norvegicus(PDB 編號：4JA7，分辨率：2.00 ?)和擬南芥A.thaliana(PDB 編號：5JJT，分辨率：2.10 ?) 的絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶A鏈[51-54]制作蛋白結構疊合圖 (圖8)。運用pymol 軟件，以人(藍色) 的蛋白結構為主體疊合后發(fā)現(xiàn)，埃希氏菌病毒λ(綠色)和擬南芥(墨綠色)的蛋白結構活性空腔較其他蛋白活性空腔大。

圖8 絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.8 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of Serine-threonine protein phosphatase

2.3.9 咪唑甘油磷酸脫水酶 咪唑甘油磷酸脫水酶也是一種良好的除草劑靶標，動物體內不存在咪唑甘油磷酸脫水酶[55]。咪唑甘油磷酸脫水酶催化植物和微生物中組氨酸生物合成的重要步驟，在組氨酸生物合成途徑中催化咪唑甘油磷酸酯轉化為咪唑乙酰醇磷酸酯。已經(jīng)證實咪唑甘油磷酸脫水酶抑制劑具有廣譜苗后除草活性，3 種三唑磷酸顯著抑制咪唑甘油磷酸脫水酶的活性，細胞培養(yǎng)中顯示很強的抑制作用[35]。

2.3.10 對羥苯基丙酮酸雙加氧酶 對羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)是生物體內酪氨酸代謝過程中重要的酶，酪氨酸在酪氨酸氨基轉移酶的作用下生成對羥基苯丙酮酸，在氧氣的參與下HPPD 能夠將對羥基苯丙酮酸催化轉化成尿黑酸。在植物體內，尿黑酸能夠被進一步轉化成質體醌和生育酚。當HPPD 的活性被抑制，雜草體內酪氨酸正常代謝將被阻斷，導致雜草體內類胡蘿卜素的缺乏，從而使葉綠素光氧化作用減弱，影響植物的光合作用，進而使雜草白化而死亡[56]。硝磺草酮(mesotrione)為獨特的玉米田除草劑，對玉米田一年生闊葉雜草和部分禾本科雜草 (如苘麻、莧菜、藜、蓼、稗草、馬唐等) 有較好的防治效果，而對鐵莧菜和一些禾本科雜草防治效果較差。

本文選取了玉米Zea maysL.(PDB 編號：1SP8，分辨率：2.00 ?)、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens(PDB 編號：1CJX，分辨率：2.40 ?)、阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis(PDB 編號：1T47，分辨率：2.50 ?)、人H.sapiens(PDB 編號：6ISD，分辨率：2.40 ?)和擬南芥A.thaliana(PDB 編號：1SP9，分辨率：2.13 ?) 的HPPD A 鏈[57-60]制作蛋白疊合圖 (圖9)。運用pymol 軟件以熒光假單胞菌蛋白(綠色)為主體進行疊合后發(fā)現(xiàn)，以上5 個蛋白中有一處疊合情況不好。

圖9 HPPD 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.9 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of HPPD

2.3.11 谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺合成酶(GS)在微生物及植物體中參與谷氨酰胺合成和氮的循環(huán)[61]。谷氨酰胺合成是高等植物氮同化的第一步，在GS 催化下，氨摻入谷氨酰胺。氨參雜的產(chǎn)生的谷氨酰胺易于代謝，為后續(xù)含氮化合物生物合成的提供基礎。草銨膦(glufosinate-ammonium)[62]以GS 為靶標，通過抑制GS 的活性，造成雜草體內氮代謝紊亂和氨過量積累，導致葉綠體解體，破壞雜草光合作用，達到除草效果。

本文選取了玉米Z.mays(PDB 編號：2D3A，分辨率：2.63 ?)、青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis(PDB 編號：4S17，分辨率：2.30 ?)、結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis(PDB 編號：1HTO，分辨率：2.40 ?)、人H.sapiens(PDB編號：2OJW，分辨率：2.05 ?)的GS A 鏈[63-65]制作蛋白結構疊合圖 (圖10)。運用pymol 軟件以結核分枝桿菌蛋白(綠色) 為主體進行疊合后發(fā)現(xiàn)，以上4 個蛋白疊合程度并不是很好，一些結構域也沒有相似性。

圖10 GS 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.10 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of GS

2.3.12 超長鏈脂肪酸合酶 超長鏈脂肪酸合酶在代謝途徑負責合成蠟、角質素和木栓素[66]。砜吡草唑(pyroxasulfone)屬超長鏈脂肪酸合成酶抑制劑除草劑，主要作為芽前封閉處理劑，以封殺禾本科為主、闊葉草為輔，具有諸多優(yōu)勢。適用作物范圍廣，可以用于小麥、玉米、花生、水稻、大豆和棉花等作物[67]。

2.4 纖維素合成相關

2.4.1 微管組裝 植物微管具有重要的生物學功能，如維持植物細胞形態(tài)結構、參與細胞運動、細胞內物質運輸、信號傳導、細胞分裂等，可參與形成紡錘體、基粒、中心粒、軸突、神經(jīng)管、纖毛、鞭毛等結構。抗微管類除草劑是通過作用于細胞微管而影響紡錘體形成，并抑制細胞有絲分裂。二硝基苯胺類除草劑是抑制微管的典型代表，可與微管蛋白結合并抑制其聚合，造成紡錘體微管喪失，使雜草細胞有絲分裂停留于前期或中期，產(chǎn)生異常的多形核[68]。由于雜草細胞極性喪失，液泡形成能力增強，故在伸長區(qū)進行放射性膨脹，結果造成根尖腫脹。

2.4.2 微管組織 微管組織中心是真核細胞中形成微管的結構，有兩個主要的功能：1) 組織真核細胞中鞭毛和纖毛的形成；2) 組織真核細胞減數(shù)分裂或有絲分裂過程中紡錘體的形成[69]。抑制微管組織的除草劑通常為氨基甲酸酯類，有燕麥靈(barban)和氯苯胺靈(chlorpropham)，它們通過破壞雜草微管的穩(wěn)定性來破壞有絲分裂而達到除草作用[70]。

2.4.3 纖維素合成 植物纖維是纖維素與各種營養(yǎng)物質結合生成的絲狀或絮狀物[71]，對植物具有支撐、連接、包裹和充填等作用。茚嗪氟草胺(indaziflam)為抑制纖維素合成的除草劑[72]，可抑制各向異性細胞擴增，導致嚴重腫脹和發(fā)育遲緩的生長表型。

2.5 生長抑制劑

2.5.1 生長素模擬物 植物生長素是由具有分裂和增大活性的細胞區(qū)產(chǎn)生調控植物生長速度和方向的激素。生長素使植物細胞壁松弛，從而使細胞生長伸長，在許多植物中還能增加核糖核酸和蛋白質的合成[73]。因生長素的兩重性，生長模擬物對某類型雜草具有殺害作用。如2,4-滴(2,4-D)[74]，它是一種選擇性除草劑，闊葉除草劑，在不影響單子葉植物的情況下殺死雙子葉植物，并在分子水平上模仿天然生長素。

2.5.2 生長素轉運抑制劑 生長素轉運是植物生長和發(fā)育過程所必需的，包括重力影響和側根生長。TIBA (2,3,5-triiodobenzoic acid) 和NPA(naphthylphthalamic acid)[75]是兩種最常用的生長素轉運除草劑，其在雜草生長過程中阻礙生長素的轉運，進而殺死雜草。

2.5.3 脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是甲羥戊酸(MEP)途徑的第一個限速酶，也是該途徑的關鍵調控酶[76]，對單萜和雙萜類香氣化合物以及類胡蘿卜素、葉綠素等重要物質的合成具有關鍵調控作用。抑制DXS 的除草劑有二氯異噁草酮(bixlozone)和異噁草酮(clomazone)。

本文選取了大腸桿菌E.coli(PDB 編號：2O1S，分辨率：2.40 ?)、耐輻射奇球菌Deinococcus radiodurans(PDB 編號：2O1X，分辨率：2.90 ?)和擬南芥A.thaliana(PDB 編號：7BZX，分辨率：4.00 ?)的DXS A[77-78]鏈制作蛋白結構疊合圖(圖11)。運用pymol 軟件以擬南芥(粉色)為主體疊合后發(fā)現(xiàn)，三者蛋白結構相似，僅有一處蛋白不相似。

圖11 DXS 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.11 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of DXS

2.6 其他

2.6.1 二氫乳清酸脫氫酶 嘧啶從頭生物合成由6 個酶促步驟組成，其中第4 步由二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)催化。該酶將泛醌介導的二氫乳清酸氧化為乳清酸，所有雜草DHODH 都是位于線粒體內膜外表面的黃素蛋白，由于核苷酸的核心作用，該途徑的抑制對大多數(shù)生物都是致命的[35]。目前開發(fā)的通用化學名稱被臨時批準為tetflupyrolimet的除草劑對水稻田的雜草控制具有選擇性。tetflupyrolimet 競爭DHODH 上的泛醌結合位點，用tetflupyrolimet 處理的敏感植物沒有萎黃，但會發(fā)展出獨特的發(fā)育遲緩表型，表明它們缺乏生長的關鍵分子(嘧啶)。

本文選取了人H.sapiens(PDB 編號：1D3G，分辨率：1.60 ?)、黑鼠Rattus rattus(PDB 編號：1UUM，分辨率：2.30 ?)、布氏錐蟲Trypanosoma brucei(PDB 編號：2B4G，分辨率：1.95 ?)和乳酸乳球菌Lactococcus lactis(PDB 編號：2BX7，分辨率：2.04 ?) 的DHODH A 鏈[79-82]制作蛋白結構疊合圖 (圖12)。運用pymol 軟件以布氏錐蟲(粉色)為主體進行疊合后發(fā)現(xiàn)，人(綠色)和黑鼠(藍色)的蛋白結構與其他兩個蛋白部分結構不相似。

圖12 DHODH 不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.12 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of DHODH

2.6.2 二氫蝶酸合成酶 葉酸是植物生長發(fā)育所需的重要功能因子，包括四氫葉酸及其衍生物，屬于水溶性B 族維生素(B9)。葉酸缺乏和葉酸穩(wěn)態(tài)變化會嚴重影響植物胚胎發(fā)育、幼苗生長、開花和結實等過程。抑制葉酸的除草劑黃草靈(asulam)用于棉田、大豆、谷物、甜菜等作物中防除狗尾草、冰草、田薊、馬唐、稗草等[35]。

本文選取了大腸桿菌E.coli(PDB 編號：1AJ0，分辨率：2.00 ?)、嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus(PDB 編號：2DQW，分辨率：1.65 ?)、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae(PDB 編號：2VEF，分辨率：1.80 ?)和新洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderia cenocepacia(PDB 編號：2Y5S，分辨率：1.95 ?)的二氫蝶酸合成酶A 鏈[83-85]制作蛋白結構疊合圖 (圖13)。運用pymol 軟件以新洋蔥伯克霍爾德氏菌(粉色)為主體進行疊合后發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌蛋白(黃色)結構活性空腔比其他3 個蛋白的大。

圖13 二氫蝶酸合成酶蛋白不同種屬A 鏈三維疊合圖Fig.13 Three-dimensional superposition of the A-chains of different species of DHPS

3 除草劑分子靶標發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)狀和展望

3.1 除草劑分子靶標發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)狀

目前除草劑分子靶標發(fā)現(xiàn)面臨很多問題：1)草甘膦和抗草甘膦作物的協(xié)同使用在很大程度上減弱了除草劑靶標發(fā)現(xiàn)的驅動力。2)除草劑開發(fā)公司的合并、減少等，也導致從事此類研究的科學家數(shù)量大幅減少，進而減少除草劑靶標發(fā)現(xiàn)。3)隨著環(huán)保要求的提高以及新農(nóng)藥登記制度更加嚴格，新型除草劑靶標發(fā)現(xiàn)的成本也顯著增加。一個典型表現(xiàn)是近些年將合成農(nóng)藥推向市場的成本增至2.86 億美元[35]，新除草劑靶標發(fā)現(xiàn)和新藥創(chuàng)制難度越來越大。

3.2 除草劑分子靶標發(fā)現(xiàn)的新技術及展望

除草劑新分子靶標的發(fā)現(xiàn)是目前解決除草劑抗性問題最好方法之一。這里介紹幾種發(fā)現(xiàn)新分子靶標的方法：一是以基因組學為代表的新生物技術，Duke 等通過對微生物基因簇編碼，來生產(chǎn)倍半萜天蝶酸的生物合成途徑和其靶酶抗性酸形式的基因，證明了基因組方法為發(fā)現(xiàn)具有新模式作用的除草劑提供了一種新的策略[86]。二是人工智能技術，基于計算機篩選和大型分子數(shù)據(jù)庫的過濾，體外選擇分子靶標，確定有可行的新除草劑分子靶標。三是多學科推進發(fā)展，如Sukhoverkov等驗證了抑制葉綠體的翻譯，可作為新除草劑靶標[87]。Hall 等發(fā)現(xiàn)在氨基酸生物合成中有尚未商業(yè)化開發(fā)的潛在除草劑靶標[88]。近些年，有一些新作用方式的除草劑被發(fā)現(xiàn)：HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶)是真核生物甲羥戊酸途徑上的限速酶，用于治療人類高膽固醇血癥，Haywood 等證明，可修飾HMGR 抑制性特點，使其有望成為除草劑靶標[89]；科羅拉多州立大學雜草研究實驗室報告了關于導致草銨膦接觸活性的因素的新見解，發(fā)現(xiàn)草銨膦因觸發(fā)活性氧物種(ROS)快速、大量產(chǎn)生，導致細胞膜災難性脂質過氧化和細胞快速死亡，其效果與除草劑的吸收成正比[90]。這些發(fā)現(xiàn)啟發(fā)我們可以在原有的靶標上開發(fā)新除草劑，或者在植物體生長代謝途中再去尋找新的除草劑靶標位點。

本文描述了近些年除草劑靶標的生理功能、除草劑的作用原理以及適用范圍，在此基礎上提出了新除草劑靶標發(fā)現(xiàn)的困境，也簡單介紹了近些年一些新作用方式的除草劑和靶標發(fā)現(xiàn)的新技術，可為繼續(xù)開發(fā)新的除草劑靶標提供參考。