NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆葉、根蔗糖代謝的調(diào)控效應(yīng)

李 星,孟 飛,郝佳奇,王 聰

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028042)

近年來我國(guó)農(nóng)業(yè)用地鹽漬化問題尤為突出,各種類型鹽漬土總量約占全國(guó)耕地面積的20%[1],鹽脅迫已是現(xiàn)階段影響植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫之一[2]。豆科植物可與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮,培肥地力、增加產(chǎn)量并改善品質(zhì),同時(shí),還可減少化肥氮施用量。然而,豆科植物與根瘤菌共生關(guān)系的建立會(huì)受到鹽脅迫等逆境因子的限制。李梅等[3]研究發(fā)現(xiàn),隨著鹽濃度的升高,蒺藜苜蓿的根瘤數(shù)不斷減少,根瘤不斷變小,固氮區(qū)的細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)減少。王聰?shù)萚4]研究表明,NaCl脅迫導(dǎo)致菜用大豆根瘤數(shù)、根瘤鮮質(zhì)量、植株含氮量顯著下降,植株生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)瘤過程對(duì)植物本身來說是一個(gè)高度耗能的過程,需要消耗大量的碳源和能源。研究顯示,大豆根瘤每固定1 g氮,需消耗15～20 g碳水化合物,大豆光合產(chǎn)物的16%會(huì)被根瘤消耗[5]。而光合產(chǎn)物主要是以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)健皫?kù)”端[6],與蔗糖代謝密切相關(guān)的酶主要包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和轉(zhuǎn)化酶[7]。蔗糖的合成、向根部轉(zhuǎn)運(yùn)及其在根部的積累狀況對(duì)豆科植物根瘤形成、生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn),大豆根瘤的形成和固氮作用主要依賴于蔗糖的輸入和代謝[8]。而且,蔗糖不僅為豆科植物結(jié)瘤固氮提供碳源和能源,還可作為信號(hào)分子抑制或激活結(jié)瘤相關(guān)基因表達(dá)[9]。大豆 MADS-Box 家族轉(zhuǎn)錄因子GmNMHC5能夠促進(jìn)大豆結(jié)瘤,而GmNMHC5的表達(dá)受到蔗糖的調(diào)控,內(nèi)源蔗糖水平提高會(huì)誘導(dǎo)GmNMHC5的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)大豆結(jié)瘤[10]。然而,鹽脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的蔗糖代謝。NaCl脅迫可使植物葉片SPS活性下降,蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性升高,導(dǎo)致蔗糖含量下降[11]。因此,增強(qiáng)鹽脅迫下葉片蔗糖合成及向根系的運(yùn)輸能力,對(duì)促進(jìn)豆科植物的結(jié)瘤固氮具有重要意義。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮玫降囊环N聚氨基葡萄糖,是一種廉價(jià)清潔的化學(xué)物質(zhì),其能夠增強(qiáng)植物抗逆性的觀點(diǎn)已得到普遍證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)四葉期的番茄幼苗進(jìn)行殼聚糖處理,可通過提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性,誘導(dǎo)番茄幼苗產(chǎn)生對(duì)早疫病的抗病性[12]。干旱脅迫下,殼聚糖處理后的大豆幼苗保護(hù)酶活性增強(qiáng),提高了抗旱性[13]。外源殼聚糖可通過提高辣椒幼苗體內(nèi)可溶性糖含量,降低丙二醛(MDA)含量,提高辣椒幼苗抗冷性[14]。鹽脅迫下,外源殼聚糖可提高小麥種子α-淀粉酶活性,增強(qiáng)幼苗抗氧化能力、滲透調(diào)節(jié)能力及根系活力,誘導(dǎo)小麥種子及幼苗提高耐鹽性[15]。前期的研究也發(fā)現(xiàn),殼聚糖可顯著提高鹽脅迫下菜用大豆的根瘤數(shù)、根瘤鮮質(zhì)量和固氮量[4],但鹽脅迫下殼聚糖對(duì)豆科植物,特別是對(duì)菜用大豆結(jié)瘤調(diào)控機(jī)制的研究尚屬空白。為此,本研究探討NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆蔗糖代謝及其在根部積累的影響,以期為深入研究鹽逆境下殼聚糖誘導(dǎo)豆科植物結(jié)瘤的生理機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

菜用大豆選用主栽品種日本青,接種與其共生匹配性較好的快生型根瘤菌HH103[16](購(gòu)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材培育 播種缽準(zhǔn)備:選口徑和高度都為 10 cm且底部有小孔的塑料苗缽,引紗布條穿過(所有紗布條的長(zhǎng)、寬規(guī)格一致),裝入蛭石,蛭石中均勻加入用無菌水配制的無氮營(yíng)養(yǎng)液,以抓緊不滴水、松開不抱團(tuán)為宜,然后將塑料缽置于口徑10 cm、裝有 1/4 Fahraeus無氮營(yíng)養(yǎng)液的組培瓶上方,但塑料缽底部不接觸到營(yíng)養(yǎng)液,紗布條浸入營(yíng)養(yǎng)液用于吸取液體,以維持塑料缽中營(yíng)養(yǎng)液濃度和 NaCl 濃度。

播種:將經(jīng)過消毒的種子播入塑料缽中,每缽2粒,每缽定苗1株。

幼苗培養(yǎng):幼苗在人工氣候箱中培養(yǎng),白天光強(qiáng)為150 μmol/(m2·s),光周期為14 h光照/10 h黑暗,晝夜溫度保持在25 ℃/18 ℃。

所有試驗(yàn)用具和蛭石高溫高壓滅菌20 min。

1.2.2 試驗(yàn)處理 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理:葉面噴施無菌水,根部澆灌無氮營(yíng)養(yǎng)液(CK);葉面噴施殼聚糖水溶液,根部澆灌無氮營(yíng)養(yǎng)液(T1);葉面噴施無菌水,根部澆灌溶有NaCl的無氮營(yíng)養(yǎng)液(T2);葉面噴施殼聚糖水溶液,根部澆灌溶有NaCl的無氮營(yíng)養(yǎng)液(T3)。每處理12株,3次重復(fù),完全隨機(jī)排列。殼聚糖處理的適宜濃度為200 mg/L,NaCl處理的適宜濃度為50 mmol/L。

1.2.3 殼聚糖誘導(dǎo)和NaCl處理 待2片真葉完全展開后進(jìn)行殼聚糖處理。用手持小型噴霧器將殼聚糖溶液均勻噴灑在幼苗葉片上,以量足但不下滴為宜,CK和T2處理噴灑無菌水。殼聚糖誘導(dǎo)處理5 d后進(jìn)行NaCl處理,NaCl溶于1/4濃度Fahraeus無氮營(yíng)養(yǎng)液,均勻澆入基質(zhì)中。CK和T1處理僅澆灌無氮營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.4 接種 NaCl處理后隨即接種。將根瘤菌懸浮液稀釋至OD600值為0.1,用移液槍取搖勻的菌懸液噴注到幼苗根部周圍,每株接種1 mL,然后再覆蓋1層1 cm左右蛭石保濕。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

蔗糖代謝指標(biāo)分別在接種后0,2,5,10,20,30 d測(cè)定,根瘤數(shù)以及根瘤鮮質(zhì)量在接種后10,20,30 d測(cè)定。

蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)參考趙智中等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定;蔗糖含量采用間苯二酚法測(cè)定[18],葡萄糖和果糖含量采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0與Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,多重比較采用Duncan′s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆結(jié)瘤的影響

由表1可知,NaCl脅迫(T2)導(dǎo)致菜用大豆的根瘤數(shù)與根瘤鮮質(zhì)量均顯著下降,各時(shí)期平均降幅達(dá)36.06%和29.91%。而殼聚糖處理(T3)后,菜用大豆的結(jié)瘤數(shù)與根瘤鮮質(zhì)量在整個(gè)處理期間均較T2顯著升高,平均增幅分別為T2的26.87%和25.63%。無鹽條件下,外源殼聚糖(T1)使菜用大豆的結(jié)瘤數(shù)與根瘤鮮質(zhì)量在各處理時(shí)期均較CK顯著升高。說明NaCl脅迫會(huì)抑制菜用大豆結(jié)瘤,而殼聚糖處理在鹽脅迫和無鹽條件下均能顯著促進(jìn)菜用大豆根瘤的形成與生長(zhǎng)。

2.2 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖含量的影響

由圖1可知,NaCl脅迫(T2)下菜用大豆葉片蔗糖含量的變化較平緩,CK為先降低后升高再降低趨勢(shì),其他條件下整體呈上升趨勢(shì);根的蔗糖含量在CK和T2條件下整體呈先升后降的趨勢(shì),而殼聚糖誘導(dǎo)后整體呈上升趨勢(shì)。T2處理使葉片的蔗糖含量在整個(gè)處理期間均較CK顯著升高,其中第30 天的增幅達(dá)CK的1.12倍;根的蔗糖含量在脅迫10 d顯著降低,其余時(shí)期均顯著高于CK。殼聚糖處理(T3)后,葉、根的蔗糖含量在各脅迫時(shí)期均較T2顯著升高,平均增幅分別為11.32%和21.32%,其中根在30 d的增幅高達(dá)43.89%。無鹽條件下,外源殼聚糖(T1)使葉、根的蔗糖含量均顯著高于CK。表明無論是在鹽脅迫還是無鹽條件下,外源殼聚糖均可誘導(dǎo)菜用大豆葉片蔗糖的合成,促進(jìn)根部蔗糖的積累。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2—6同。

2.3 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根還原糖含量的影響

由圖2可知,隨時(shí)間延續(xù),各處理葉片還原糖含量整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),而根的還原糖含量變化較平緩。NaCl脅迫(T2)導(dǎo)致菜用大豆葉、根的還原糖含量在各脅迫階段均顯著下降,尤其是根在脅迫中、后期的降幅較大,10,20,30 d的降幅分別達(dá)22.43%,21.92%,24.23%。殼聚糖處理(T3)后,葉、根的還原糖含量在各處理時(shí)期均顯著高于T2,平均增幅分別為10.22%,11.11%。T1條件下,菜用大豆葉、根的還原糖含量在整個(gè)處理期間均顯著高于CK。

圖2 NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆還原糖含量的影響

2.4 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖合成酶(SS)活性的影響

由圖3可知,NaCl脅迫(T2)使菜用大豆葉片和根的SS活性在整個(gè)處理期間均大幅升高,平均增幅分別達(dá)CK的1.15,1.17倍。殼聚糖處理(T3)后,葉片SS活性在脅迫10,20,30 d較T2顯著升高,增幅分別達(dá)T2的25.03%,25.59%,23.55%,其余時(shí)期無顯著差異;根的SS活性在各處理時(shí)期均顯著高于T2,在脅迫2,5,10,20,30 d較T2增幅分別為77.76%,35.41%,31.48%,45.97%,26.73%。T1條件下,葉片和根的SS活性在各處理時(shí)期均較CK顯著升高。

圖3 NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆蔗糖合成酶活性的影響

2.5 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的影響

由圖4可知,NaCl脅迫(T2)下,菜用大豆葉片SPS活性在處理第10,20,30天較CK顯著升高,其余時(shí)期無顯著差異;根的SPS活性在整個(gè)脅迫期間均顯著高于CK。與T2相比,T3處理使葉片SPS活性在脅迫第2,5,10天顯著升高,平均增幅達(dá)19.36%,其余時(shí)期差異不顯著;根的SPS活性在脅迫第2天時(shí)無顯著差異,在第5,10,20,30天均顯著升高,平均增幅為14.28%。T1條件下,葉片與根的SPS活性在各處理時(shí)期均顯著高于CK。

圖4 NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆蔗糖磷酸合成酶活性的影響

2.6 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性的影響

由圖5可知,NaCl脅迫(T2)下,菜用大豆葉和根的NI活性均較CK顯著降低;殼聚糖處理(T3)后,葉和根的NI活性在整個(gè)脅迫期間均顯著高于T2,平均增幅分別為7.37%和9.48%,其中,葉在10,30 d、根在2,5,10 d接近CK水平。T1條件下,葉片NI活性在整個(gè)處理期間均顯著高于CK;根在10 d與CK相比差異不顯著,其余時(shí)期均較CK顯著升高。表明殼聚糖處理在鹽脅迫和無鹽條件下均能有效提高NI活性。

圖 5 NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

2.7 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性的影響

由圖6可知,NaCl脅迫(T2)使菜用大豆葉和根的AI活性在各脅迫階段均顯著降低;殼聚糖處理(T3)后,葉、根的AI活性均較T2顯著升高,其中,葉片在20,30 d的酶活性接近CK水平;根在5,10,30 d接近CK水平,2,20 d顯著高于CK,增幅達(dá)9.74%,9.99%。T1處理后,葉片在5,20 d、根在第2天酶活性與CK相比差異不顯著,其余時(shí)期均顯著高于CK?？梢?NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆的AI活性,而殼聚糖處理則在鹽脅迫和無鹽條件下對(duì)葉、根的AI活性均產(chǎn)生了顯著的誘導(dǎo)作用。

圖 6 NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆酸性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆葉片蔗糖代謝的影響

蔗糖作為光合作用的重要產(chǎn)物和長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)闹饕问絽⑴c代謝,光合器官中蔗糖含量的多少直接影響其向“庫(kù)”端的轉(zhuǎn)移和積累,進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)豆科植物而言,還會(huì)直接影響根瘤的形成與生長(zhǎng),最終影響產(chǎn)量。而葉片蔗糖代謝水平對(duì)“源”端的供應(yīng)能力至關(guān)重要。本研究中,NaCl脅迫提高了菜用大豆葉片的SS和SPS活性,降低了NI和AI活性,導(dǎo)致葉片蔗糖含量升高,還原糖含量下降,而殼聚糖處理使NaCl脅迫下菜用大豆葉片SS、SPS和NI、AI活性均顯著升高,這與鹽脅迫下外源NO調(diào)控玉米葉片蔗糖代謝的結(jié)果相近[20]。作為早期的光合產(chǎn)物,葉片蔗糖含量的變化與光合效率密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),外源殼聚糖顯著提高了NaCl脅迫下菜用大豆的凈光合速率(Pn)[21],這就為葉片蔗糖的合成奠定了良好基礎(chǔ)。同時(shí),葉片蔗糖含量變化還要受到蔗糖代謝途徑中關(guān)鍵酶綜合作用的影響。本研究中,菜用大豆蔗糖合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡受SS、SPS和NI、AI共同作用,殼聚糖通過誘導(dǎo)其活性整體升高,增強(qiáng)蔗糖合成和分解能力,促使蔗糖代謝高效運(yùn)轉(zhuǎn),這可能是NaCl脅迫下菜用大豆葉片蔗糖、還原糖含量升高的主要原因。此外,葉片蔗糖含量變化還與蔗糖向根部運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān),這需要在根中進(jìn)一步說明。

3.2 NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆根系蔗糖代謝及結(jié)瘤的影響

根在生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成過程中需要積累大量的碳化物,蔗糖是從“源”到“庫(kù)”的主要運(yùn)輸形式?！皫?kù)”器官蔗糖的積累來自“源”端的轉(zhuǎn)運(yùn)、自身合成及降解[22]。本研究發(fā)現(xiàn),NaCl脅迫使菜用大豆根中NI、AI活性顯著下降,而殼聚糖處理顯著提高了其在NaCl脅迫下的NI和AI活性。NI、AI作為蔗糖從韌皮部卸出的主要驅(qū)動(dòng)力,能夠在“源”端和“庫(kù)”端形成蔗糖梯度,加速蔗糖向“庫(kù)”端運(yùn)輸和分配[23-24]。根中NI和AI活性升高,勢(shì)必增加“庫(kù)”強(qiáng),進(jìn)而增強(qiáng)蔗糖從葉片向根的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,促進(jìn)蔗糖向根部的運(yùn)輸;再者,由于殼聚糖處理顯著提高了NaCl脅迫下根系的SS、SPS活性,促使蔗糖分解、合成高效循環(huán),致使根中蔗糖、還原糖含量整體升高。需要說明的是,“庫(kù)”強(qiáng)的增加反過來也可促進(jìn)葉片蔗糖的合成[25],這也可能是殼聚糖促使葉片蔗糖代謝高效運(yùn)轉(zhuǎn)的另一重要方面。糖類是根瘤在形成、生長(zhǎng)過程中主要的碳源和能源。本研究中,外源殼聚糖使NaCl脅迫下菜用大豆根中蔗糖、還原糖含量升高,一方面為菜用大豆根系生長(zhǎng)和結(jié)瘤提供了充足的碳源和能源,另一方面,蔗糖含量升高還可誘導(dǎo)結(jié)瘤基因表達(dá),促進(jìn)結(jié)瘤;同時(shí),蔗糖、還原糖等可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其含量升高還可緩解鹽脅迫對(duì)根系的傷害,這可能是殼聚糖提高NaCl脅迫下菜用大豆結(jié)瘤能力的重要原因之一。值得注意的是,盡管NaCl脅迫使根中蔗糖含量升高,但根瘤數(shù)、根瘤鮮質(zhì)量均顯著降低,這可能與還原糖含量下降有關(guān),同時(shí)也說明還原糖可能是根瘤形成與生長(zhǎng)過程中直接的碳源和能源。

豆科植物結(jié)瘤過程中會(huì)受到多種因素的影響,如根毛生長(zhǎng)發(fā)育狀況,大豆異黃酮、生長(zhǎng)素等結(jié)瘤信號(hào)物質(zhì)代謝及其在根部積累等。鹽脅迫下,殼聚糖如何調(diào)控根毛生長(zhǎng)發(fā)育和信號(hào)物質(zhì)代謝及其在根部積累,還有待于進(jìn)一步研究。

殼聚糖通過誘導(dǎo)NaCl脅迫下菜用大豆葉、根蔗糖代謝高水平運(yùn)轉(zhuǎn),促進(jìn)蔗糖向根部轉(zhuǎn)移,進(jìn)而為根系生長(zhǎng)和根瘤形成及生長(zhǎng)提供較充足的碳源和能源,同時(shí),高水平蔗糖也可促進(jìn)結(jié)瘤基因表達(dá);此外,蔗糖、還原糖等含量升高也有效緩解了鹽脅迫對(duì)根系的傷害,這可能是殼聚糖提高NaCl脅迫下菜用大豆結(jié)瘤能力的重要原因之一。