肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機制的研究進展

汪慧華, 鄒映雪

(1. 天津醫(yī)科大學 研究生院, 天津, 300350; 2. 天津市兒童醫(yī)院 呼吸科, 天津, 300350)

肺炎支原體(MP)是兒童呼吸道感染最常見的病原體之一, MP肺炎占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的10%～40%, 每3～7年出現(xiàn)周期性爆發(fā)現(xiàn)象[1-3]。MP是能夠進行自我復制且能夠在體外不依靠活體細胞生存的最小微生物[4], 缺乏細胞壁使得MP對作用于細胞壁的青霉素類、頭孢菌類抗生素天然耐藥,目前兒童MP感染首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療[5]。近年來, MP感染率逐年升高,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床使用頻繁,世界范圍內(nèi)MP耐藥情況嚴重,中國的MP耐藥率亦高達90%以上[6-7],故臨床重癥和難治性MP感染隨之增多。MP感染可導致多系統(tǒng)受累,其中以呼吸系統(tǒng)損傷最為常見,輕癥患者多數(shù)表現(xiàn)為自限性,但MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥會造成治療效果欠佳。與對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感的MP菌株相比,耐藥菌株會引起更為嚴重的肺外并發(fā)癥[8], 甚至導致不可逆的遠期損傷[9-10]。鑒于此,探討MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制具有重要的臨床意義,現(xiàn)將MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制綜述如下。

1 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機制

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是具有大環(huán)內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的一類藥物,其中紅霉素是最早被發(fā)現(xiàn)的天然大環(huán)內(nèi)酯類抗生素; 第2代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為紅霉素的半合成衍生物,包括阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等; 第3代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是酮內(nèi)酯類藥物,以泰利霉素為代表[11]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機制包括抗菌作用和非抗菌作用。

1.1 抗菌作用

對于每一個細胞而言,蛋白質(zhì)的合成都是不可或缺的。核糖體是細胞蛋白質(zhì)合成的場所,由30S小亞基與50S大亞基組成,其中30S小亞基介導信使核糖核酸(mRNA)密碼子與轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)反密碼子之間的相互作用,決定了翻譯的保真性; 50S大亞基有助于蛋白質(zhì)合成的起始、延長和終止,由23S rRNA、5S rRNA和蛋白質(zhì)組成; 23S rRNA又可以分為6個結(jié)構(gòu)域[12-13], 其中結(jié)構(gòu)域V與肽基轉(zhuǎn)移酶活性密切相關。核糖體通過啟動、延伸、終止和核糖體循環(huán)4個步驟引導蛋白質(zhì)的合成。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以靶向作用于細菌核糖體的23S rRNA,干擾核糖體的功能,阻斷蛋白質(zhì)的合成,抑制細菌的生長,從而起到抗菌作用[14]。

氨基酸在核糖體50S大亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心(PTC)處形成肽鍵,合成多肽鏈,再通過新生多肽的出口隧道(NPET)離開[11, 13]。既往研究[13, 15-16]認為,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以結(jié)合在NPET處,縮短隧道直徑,阻礙新生多肽的延長,對核糖體合成的所有蛋白質(zhì)均有抑制作用,但后期越來越多的研究[17-18]發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不是翻譯的全局抑制劑,而是翻譯的調(diào)節(jié)劑,可以防止特定氨基酸序列聚集,抑制肽鍵形成,選擇性地干擾蛋白質(zhì)的合成,這被稱為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的“上下文特異性”。此外有研究[19]認為,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素還能夠誘導編碼錯誤,影響翻譯結(jié)果。

1.2 非抗菌作用

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的非抗菌作用主要包括抑制炎癥反應、減少氣道黏液分泌和調(diào)節(jié)免疫平衡等。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以通過影響炎癥細胞、炎性因子、氣道上皮等而抑制過度和有害的炎癥反應。中性粒細胞是主要的抗菌效應細胞,也是炎癥反應的重要環(huán)節(jié),通過脫顆粒、吞噬、產(chǎn)生活性氧以及釋放中性粒細胞胞外陷阱(NETs)殺滅病原菌,但嗜中性粒細胞在持續(xù)炎癥時可能會釋放過量的NETs,對宿主產(chǎn)生損傷[20-22]。研究[23]發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類藥物對中性粒細胞具有抑制或穩(wěn)定作用,可影響NETs釋放,表現(xiàn)為濃度依賴性。粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)等為促炎因子,對炎癥反應的發(fā)生具有重要促進作用,而大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以抑制這些炎癥因子的表達[24-25]。阿奇霉素可以抑制多種促炎途徑,但并非完全抑制,而是以調(diào)節(jié)為主要特征。研究[26]發(fā)現(xiàn),阿奇霉素還可以保護呼吸道黏膜上皮,減輕氣道炎癥反應所致?lián)p傷。

慢性氣道炎癥的重要特點之一是氣道黏液高分泌,大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以通過調(diào)節(jié)氯離子通道、抑制杯狀細胞增生肥大與抑制黏液分泌基因表達而減輕氣道水分和黏液的高分泌狀態(tài)[27-28]。也有研究[29]認為,大環(huán)內(nèi)酯類藥物是通過抑制鈉離子通道而減少氣道黏液分泌。

目前,關于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對肺部疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張癥和肺囊性纖維化等[25, 30])免疫調(diào)節(jié)作用的研究已廣泛開展,其作用方式主要表現(xiàn)為抑制微生物黏附、阻斷毒性因子、抑制生物膜形成以及抑制細胞群體感應[31],例如阿奇霉素能夠抑制銅綠假單胞菌對上皮細胞的黏附以及調(diào)節(jié)上皮細胞的pH值[32]。雖然大環(huán)內(nèi)酯類藥物似乎可以加快恢復免疫平衡的速度,并且可能對增強抗菌能力具有一定作用,但是長期使用可能導致耐藥以及其他損害。

2 MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制

2.1 藥物作用靶點的基因突變

轉(zhuǎn)肽酶環(huán)的突變: 自紅霉素被應用于臨床后,相關耐藥菌株亦在臨床中相繼出現(xiàn),研究人員發(fā)現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的細菌核糖體50S大亞基23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)的中心環(huán)上出現(xiàn)了特定位置的點突變。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與核糖體的結(jié)合僅發(fā)生于50S大亞基23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)[33],因此當該處某些結(jié)合位點發(fā)生突變時,可能會使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與細菌核糖體結(jié)合困難,無法有效阻止細菌蛋白合成,從而導致耐藥的發(fā)生。1995年LUCIER T S等[34]對耐藥MP菌株進行研究發(fā)現(xiàn),耐藥菌株的23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)中存在A2063G和A2064G突變位點,分別表現(xiàn)為對14元環(huán)和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性,由此提出藥物作用靶點的基因突變可能是出現(xiàn)耐藥的原因。此后日本的一項研究[35]證實, 23S rRNA的基因突變與耐藥有關,主要為2063和2064位點發(fā)生A到G的突變,少許菌株存在A到C的突變。目前研究[35-37]已發(fā)現(xiàn)的位點包括2062、2063、2064、2067、2611和2617位點,其中存在2063、2064位點突變的MP菌株對14元環(huán)、15元環(huán)和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均有耐藥性,存在2067位點突變的菌株主要對16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥,而存在2611、2617位點突變的菌株更傾向于對14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)A2063和A2064位點的突變頻率最高,其產(chǎn)生的耐藥性也是最強的[7, 38], 是MP耐藥的主要標志,亦是目前的研究重點。

核糖體蛋白的突變: 該突變主要表現(xiàn)為核糖體50S大亞基上L4蛋白和L22蛋白的突變。L22蛋白是50S大亞基的核心蛋白,可以與23S rRNA所有結(jié)構(gòu)域的RNA序列發(fā)生相互作用[12]。L4蛋白和L22蛋白共同成為50S大亞基的“支架”,參與NPET收縮位點的構(gòu)成,形成隧道的最窄部分,并對其具有調(diào)節(jié)作用[39]。兩者發(fā)生突變會引起隧道的變化,一方面使大環(huán)內(nèi)酯類藥物的結(jié)合位點遠離該通道而表現(xiàn)為大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥,另一方面會影響新生多肽的延伸,使核糖體的翻譯率降低[40]。核糖體L4蛋白發(fā)生的突變主要表現(xiàn)為H70R、H70L的替換,在60～62位點處插入1～3個甘氨酸; L22蛋白出現(xiàn)連續(xù)3次的突變,最終導致泰利霉素的活性完全喪失,而其他大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈霉素類抗生素和酮內(nèi)酯類抗生素的活性不變[36]。研究[41]發(fā)現(xiàn),臨床分離出的MP耐藥菌株與紅霉素體外誘導產(chǎn)生的MP耐藥菌株在核糖體蛋白L22處存在相同的基因突變,提示使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物誘導體內(nèi)產(chǎn)生MP耐藥菌株的可能性。中國學者[42]發(fā)現(xiàn),大多數(shù)耐藥菌株的L4蛋白和L22蛋白基因中存在C162A、A430G、T279C和T508C突變,但未能明確該突變與MP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的相關性。也有研究[43-44]認為L4蛋白和L22蛋白突變與MP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性無關,但會引起其他病原菌的耐藥,例如肺炎鏈球菌[45]、大腸桿菌[46]。因此,關于L4蛋白和L22蛋白對MP產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的影響有待進一步研究。

核糖體靶點的修飾: 該過程也稱為RNA的甲基化修飾,由Erm編碼的rRNA-甲基轉(zhuǎn)移酶可通過催化23S rRNA上A2058(大腸桿菌編號,對應MP的A2063位點)位點發(fā)生二甲基化而引起核糖體靶點的變化,進而使大環(huán)內(nèi)酯類藥物失去對MP的抑制作用[47-48]。ErmB是常見的引起甲基化的基因[49]。14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可誘導大多數(shù)Erm基因改變,但目前的研究對該基因的檢測樣本較少,未來需擴大檢測量深入探討。

2.2 藥物主動外排增加

藥物的主動外排是耐藥的常見原因之一, MP可通過改變細胞膜的成分形成一種特殊的膜蛋白,并通過各種外排泵將藥物從細胞內(nèi)泵出,以降低胞內(nèi)藥物濃度,阻止其作用于靶部位,影響抗生素發(fā)揮抑菌作用。這種外排機制并非作用于特定藥物,而是對多種抗生素、多種作用機制均有效,在介導多藥耐藥方面具有重要意義。

對于原核生物而言,外排轉(zhuǎn)運蛋白家族主要有5個,分別為ATP結(jié)合盒(ABC)家族、主要易化因子超家族(MFS)、小多耐藥家族(SMR)、多重藥物與有毒化合物外排家族(MATE)和耐藥結(jié)節(jié)化細胞分化家族(RND)[50]。其中, ABC家族依賴ATP水解供能,其余家族則依賴質(zhì)子泵功能。與支原體耐藥高度相關的是ABC家族,但目前相關研究較少。

ABC轉(zhuǎn)運家族是目前發(fā)現(xiàn)的最大的轉(zhuǎn)運蛋白家族之一,幾乎存在于所有生物體中,依靠水解ATP提供能量,可將底物進行跨膜運輸,在多種生理過程中發(fā)揮重要作用,當其底物為藥物時,會導致耐藥,因而也被稱為多藥耐藥蛋白。迄今為止,臨床已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種ABC轉(zhuǎn)運蛋白,目前結(jié)構(gòu)已知的ABC轉(zhuǎn)運蛋白均屬于Ⅳ型和Ⅴ型,Ⅳ型按基因型可分為ABCA～ABCH 8個亞家族,其中ABCB、ABCC亞家族與耐藥高度相關[51]。有研究[52]將利血平作為外排泵抑制劑,基于體外藥代動力學/藥效學分析探究托拉霉素對豬MP的抗菌作用,發(fā)現(xiàn)豬MP可通過調(diào)節(jié)不同的ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達而達到降低藥物敏感性的目的。

由于在抗生素耐藥中具有重要作用,外排泵被作為有效的抗菌靶點,相關外排泵抑制劑的的開發(fā)將有助于改善微生物的耐藥情況。

2.3 藥物失活(抗生素酶解)

病原體能夠合成某些酶來修飾或降解抗生素,通過改變其結(jié)構(gòu)使其失去活性,這些酶包括β-內(nèi)酰胺酶、四環(huán)素羥化酶、酯酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶等[53]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可被病原體合成的磷酸轉(zhuǎn)移酶、酯酶、甲酰還原酶和糖基轉(zhuǎn)移酶滅活。

對大環(huán)內(nèi)酯磷酸轉(zhuǎn)移酶(MPHs)的研究始于1989年, MPHs能夠?qū)TP或GTP的γ-磷酸基團轉(zhuǎn)移至大環(huán)內(nèi)酯類底物上,取代大環(huán)內(nèi)酯的羥基,從而使藥物喪失活性。已被報道的MPHs類型包括MPH(A)～MPH(O)共15種亞型,其中MPH(A)編碼的磷酸基團以GTP為磷酸基團供體,會導致細菌對14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥, MPH(B)編碼的磷酸基團也偏向于以GTP作為供體,對14元環(huán)、15元環(huán)、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均耐藥[54]。

紅霉素酯酶(EREs)能夠作用于大環(huán)內(nèi)酯酯鍵,切斷大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。ERE(A)是EREs中最常見也是最早被發(fā)現(xiàn)的,ERE(C)是其同源相似物,兩者具有高度序列同源性和相似性,作用方式亦類似。研究[55]發(fā)現(xiàn),紅霉素能夠緊密結(jié)合在ERE(C)的活性中心上,兩者結(jié)合時該活性中心關閉,反應結(jié)束后打開,為下一次催化反應做準備。ERE(A)和ERE(C)對14元環(huán)酮內(nèi)酯、15元環(huán)阿奇霉素和16元環(huán)交沙霉素、麥迪霉素發(fā)揮開環(huán)作用,而ERE(B)、ERE(D)對14元環(huán)非酮內(nèi)酯類抗生素和15元環(huán)阿奇霉素起效。

3 小結(jié)與展望

在MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機制相關研究中, 23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)基因突變是目前的研究熱點,眾多研究發(fā)現(xiàn)2063位點和2064位點突變率最高,被廣泛用于MP耐藥檢測,但耐藥基因突變與臨床表現(xiàn)的相關性尚有待進一步研究。研究[37]認為,大環(huán)內(nèi)酯類藥物的使用可能誘導體內(nèi)MP耐藥性的出現(xiàn),但也可能機體本身感染的是耐藥菌株,只是由于數(shù)量少未被檢測出,此后使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物促進了耐藥菌株的增殖,耐藥菌株成為優(yōu)勢菌株后才被檢測出。值得注意的是,體外耐藥性試驗與體內(nèi)實際耐藥情況存在一定差異,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機制復雜多樣,目前尚未完全闡明,未來需要進一步深入研究?？傊?耐藥菌株的出現(xiàn)會大大增加臨床治療的難度,在日常工作中,醫(yī)務人員應規(guī)范化使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,以減少耐藥情況的發(fā)生,還應盡早識別耐藥情況并及時調(diào)整與優(yōu)化治療方案,從而有效提高兒童MP感染的臨床療效。