先天性巨結(jié)腸早期診斷的研究進(jìn)展

鄭 懿 余家康

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心新生兒外科 （廣州 510623）

先天性巨結(jié)腸又被稱作為赫爾施普龍病（Hirschsprung’s disease，HSCR），是以消化道末端腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如為基本病理特征的消化系統(tǒng)先天性畸形，占兒童消化系統(tǒng)出生缺陷疾病譜的第二位，發(fā)病率約1∶5 000，是小兒外科臨床工作中的常見病與診療重點(diǎn)［1］。目前認(rèn)為HSCR主要的病理生理改變是在胚胎發(fā)育期間，來源于迷走神經(jīng)干的腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（enteric neural crest cells，ENCCs）遷移到結(jié)腸中形成被稱為肌間神經(jīng)叢（Auerbach叢）（在腸壁的平滑肌肌層之間）和黏膜下神經(jīng)叢（Meissner叢）（在腸壁的黏膜下層內(nèi)）的腸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，如果這一生理發(fā)育過程中ENCCs遷移障礙，則會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸為主的腸神經(jīng)叢發(fā)育缺陷，缺乏成熟的調(diào)節(jié)腸分泌和蠕動(dòng)功能的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，病變腸段持續(xù)痙攣失去收縮功能，導(dǎo)致長(zhǎng)期糞便潴留，近端腸管在壓力下代償性肥厚擴(kuò)張，造成患兒腹脹、便秘、腸炎、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育不良等腸梗阻的臨床癥狀［2］。對(duì)于新生兒期發(fā)病的患兒，多在出生后即出現(xiàn)胎便排出延遲、腹脹進(jìn)行性加重，嚴(yán)重者可發(fā)生巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎，甚至腸穿孔的風(fēng)險(xiǎn)，這也是HSCR患兒新生兒期致死的主要原因。根據(jù)HSCR的病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)學(xué)者將其分為：短段型、常見型（普通型）、長(zhǎng)段型和全結(jié)腸型，以及更為罕見的全腸型和特殊類型［3］，其中以長(zhǎng)段型及以上，即累及橫結(jié)腸及以上腸段的病理類型，具有更高的術(shù)前腸炎反復(fù)發(fā)作、甚至穿孔的風(fēng)險(xiǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，約5%新生兒期起病的患兒因結(jié)腸穿孔接受手術(shù)造瘺治療，而術(shù)前出現(xiàn)巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎的概率亦高達(dá)6%～60%［4-5］。因此早期進(jìn)行疾病的診斷并及時(shí)預(yù)防干預(yù)，對(duì)于降低并發(fā)癥的發(fā)生和圍術(shù)期病死率尤為重要。

1 傳統(tǒng)診斷方法在嬰幼兒患者中應(yīng)用

目前鋇灌腸是低日齡患兒尤其是新生兒期的主要診斷方法，相較于其它方法，鋇灌腸具有操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小、結(jié)果客觀、易于普及等優(yōu)點(diǎn)，典型影像特征表現(xiàn)為狹窄與擴(kuò)張交界的移行段腸管顯影、毛刺樣的黏膜形態(tài)、結(jié)腸袋結(jié)構(gòu)消失、24小時(shí)排泄相鋇劑潴留，但由于新生兒尤其是小于35周齡的早產(chǎn)兒腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚未完全，腸神經(jīng)節(jié)密度及形態(tài)存在日齡差異性，敏感度和特異度分別僅為70%和83%，遠(yuǎn)低于6月齡以上的嬰幼兒患者，而在長(zhǎng)段型及以上的患兒中，典型的影像學(xué)特征與腸神經(jīng)節(jié)缺如的病變范圍差異率甚至高達(dá)42%，且對(duì)于低日齡患兒，灌腸操作及鋇劑殘留也存在腸梗阻、腸穿孔等風(fēng)險(xiǎn)［6-7］。而肛門直腸測(cè)壓創(chuàng)傷相較更小，但技術(shù)本身具有一定人員及儀器設(shè)備要求，且有研究發(fā)現(xiàn)，在小于6個(gè)月嬰兒的診斷準(zhǔn)確性的亞組分析中，其敏感度和特異度僅為85%～89%，在新生兒患兒中直腸肛門抑制反射更是難以引出，經(jīng)過與直腸活檢這一金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩者差異也很大，因此并不是低日齡患兒的首選檢查方法［8］。當(dāng)然，隨著技術(shù)水平的進(jìn)步，亦有更精確、更靈敏的傳感器或圖像處理系統(tǒng)面世，也將提高肛門測(cè)壓的應(yīng)用年齡降低及準(zhǔn)確率［9］。

活組織檢查創(chuàng)傷較大，但此為疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，主要有直腸黏膜抽吸活檢和全層活檢兩種方法，直腸黏膜抽吸活檢操作相對(duì)簡(jiǎn)便，其特異度可高達(dá)95%，但敏感度波動(dòng)也較大，與患兒日齡密切相關(guān)，一項(xiàng)回顧性研究表明，小于39天的患者中，診斷敏感度僅為50%，而較大年齡組中可達(dá)88%，這可能與新生兒期腸神經(jīng)仍處于不斷發(fā)育成熟過程有關(guān)［10-11］。抽吸活檢往往無法充分暴露齒狀線，取材過程中有可能涉及直腸末端生理性無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞區(qū)，抽吸過程可能得不到足夠多的黏膜下層樣本，是影響診斷特異度的因素。為進(jìn)一步提高活檢陽(yáng)性檢出率，可采取全層腸活檢，能夠提供較多的腸管層次及組織量，但麻醉、創(chuàng)傷、出血及吻合口瘺的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)相應(yīng)升高，一般僅針對(duì)新生兒期急性腸梗阻需手術(shù)治療的病人，直腸上段的全層腸活檢可作為HSCR排除性診斷的有效方法［12］。另外，標(biāo)本的組織化學(xué)染色也是對(duì)病理診斷的補(bǔ)充，較為常用的為乙酰膽堿酯酶染色和calretenin化學(xué)染色，但二者也存在假陰性的可能性，因此也有越來越多的組化染色輔助診斷指標(biāo)被發(fā)現(xiàn)。膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體染色是較為常見的替代方案，有研究發(fā)現(xiàn)，異常的膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體染色貫穿整個(gè)無神經(jīng)節(jié)腸段，并進(jìn)入移行段，尤其在超短段型患兒的應(yīng)用中可以減低calretinin的假陰性率［13-14］。另外，亦有其它神經(jīng)元特異性標(biāo)記物，包括NCAM、PGP9.5、HuC/D、S-100等也應(yīng)用于輔助病理診斷，但神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否存在及其形態(tài)、肥大神經(jīng)叢的識(shí)別仍是病理診斷至關(guān)重要的特征［12，15-16］?；谏鲜?，傳統(tǒng)診斷方法在新生兒期HSCR疾病早期診斷中的應(yīng)用仍存在限制及不足。因此越來越多的研究聚焦于疾病早期、無創(chuàng)、且特異度相對(duì)較高的診斷指標(biāo)的挖掘及探索。

2 新型的可視化影像診斷技術(shù)

基于上述傳統(tǒng)常規(guī)診斷方法在低齡嬰幼兒尤其是新生兒期應(yīng)用的限制，如鋇灌腸及直腸肛門測(cè)壓的診斷效率較年長(zhǎng)兒低，病理活檢穿孔及出血等并發(fā)癥的發(fā)生率較年長(zhǎng)兒高［2］，新型的影像可視化技術(shù)也輔助優(yōu)化新生兒期HSCR的診斷。光譜成像技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于無創(chuàng)的采樣方法，經(jīng)過特殊的計(jì)算機(jī)算法，可以提高正常與無神經(jīng)節(jié)腸管的分辨率，動(dòng)物研究中已證實(shí)，HSCR小鼠模型可達(dá)到97%敏感度及94%特異度，陽(yáng)性診斷率為92%，此項(xiàng)技術(shù)有望在日后應(yīng)用于術(shù)中輔助手術(shù)醫(yī)生明確病變范圍［17］?；诠鈱W(xué)斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）技術(shù)開發(fā)的高分辨光學(xué)斷層顯微鏡，脫離了實(shí)驗(yàn)室特殊化學(xué)染色的限制，實(shí)現(xiàn)可視化深層組織中肌間神經(jīng)叢的分布，在小日齡HSCR小鼠模型中能夠清晰區(qū)分正常與無神經(jīng)節(jié)腸段［18］。激光共聚焦內(nèi)窺鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）是另一種可視化腸神經(jīng)叢的技術(shù)，具有可應(yīng)用于活體內(nèi)觀察的優(yōu)點(diǎn)，通過神經(jīng)元特異性結(jié)合染料，更直觀顯示結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢，對(duì)于活體內(nèi)神經(jīng)叢的術(shù)中診斷準(zhǔn)確率可達(dá)88%，但其技術(shù)限制在于共聚焦層面而對(duì)于結(jié)腸結(jié)構(gòu)的分層識(shí)別較困難，在不平整的活體腸道中將聚焦平面聚集在診斷層面是主要的技術(shù)挑戰(zhàn)［19］。另外，超聲在診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，超高頻超聲在HSCR診斷的研究中發(fā)現(xiàn)，HSCR患兒離體病理腸管標(biāo)本可以進(jìn)行正常和無神經(jīng)節(jié)段的超高頻超聲成像，對(duì)于解剖層次的識(shí)別比CLE更為清晰，可應(yīng)用于不同年齡段患兒腸神經(jīng)節(jié)數(shù)量及密度的評(píng)估，此項(xiàng)研究為肛門拖出先天性巨結(jié)腸根治術(shù)中診斷切除范圍奠定了臨床應(yīng)用基礎(chǔ)［20］。此類影像學(xué)檢查手段具有較高的技術(shù)要求，且仍需要更多的人體樣本驗(yàn)證，暫未得到廣泛應(yīng)用。

3 具有遺傳背景的基因診斷

由于HSCR產(chǎn)前診斷中缺乏典型胎兒篩查特征，且該病為非孟德爾遺傳，表型表達(dá)多樣，外顯率不完全，是多個(gè)遺傳基因座和表觀遺傳/環(huán)境因素之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果，因此單獨(dú)的基因診斷，尤其是產(chǎn)前診斷困難，但遺傳學(xué)分析可以幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)并識(shí)別高?；純?，例如長(zhǎng)段型較短段型患者后代中疾病發(fā)生的概率明顯增高，患兒兄弟姐妹中疾病風(fēng)險(xiǎn)根據(jù)病理類型及性別，最高可達(dá)33%［21］。非綜合征HSCR占受影響兒童的70%，約30%受HSCR影響的兒童具有相關(guān)的染色體（12%）和/或伴有其它系統(tǒng)的出生缺陷（18%）［22］。與HSCR相關(guān)的常見綜合癥包括唐氏綜合征、Waardenburg綜合征、Goldberg綜合征、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤2A、先天性中央通氣不足綜合征和Mowat-Wilson綜合征等，若圍生期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述綜合癥相關(guān)基因突變，則提示兒科醫(yī)生應(yīng)評(píng)估伴發(fā)腸神經(jīng)系統(tǒng)異常的可能，減低患兒巨結(jié)腸危象的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［23-25］。

截至目前，有關(guān)HSCR的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究表明常見的非編碼變異、罕見的編碼變異和影響腸神經(jīng)嵴細(xì)胞命運(yùn)的基因拷貝數(shù)變異均在HSCR 基因組研究中被發(fā)現(xiàn)，通過外顯子測(cè)序、功能基因組測(cè)序和單核苷酸多態(tài)性基因拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)可以在約50%具有明顯表型的嬰兒中鑒定出可能對(duì)巨結(jié)腸病易感的相關(guān)變異［26］。有文獻(xiàn)報(bào)道，HSCR的遺傳學(xué)背景是復(fù)雜的，涉及多個(gè)易感基因座，酪氨酸蛋白激酶受體（protooncogene tyrosine-protein kinase receptor，RET），位于染色體位點(diǎn)10q11，其相關(guān)通路是目前學(xué)界認(rèn)為與HSCR的發(fā)生發(fā)展最相關(guān)的變異，其基因變異檢出率最高（21.7%），其次是EDNRB、NRG1和NTRK1的突變（13%），L1CAM、CYP2B6和GEMIN2的突變（4.3%），它們加劇了與RET基因相關(guān)的遺傳易感性，而家族性病例的基因變異檢出率更是高達(dá)87.5%，明顯高于散發(fā)性病例的40%［27］。綜合癥型HSCR的圍產(chǎn)期遺傳咨詢，特別是對(duì)于已有明顯家族聚集性傾向、并在先證者中已檢測(cè)到已知有害突變的家系病例，應(yīng)被視為遺傳診斷管理的一部分［28］。但同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，RET突變相關(guān)HSCR患者的基因型和表型無直接關(guān)系，對(duì)具有家族遺傳背景的產(chǎn)前羊水樣本和臍帶血進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)胎兒存在RET突變，但在隨訪中發(fā)現(xiàn)未表現(xiàn)出典型的HSCR疾病表型特征，這表明該病是一種具有多種表型表達(dá)和不完全外顯的非孟德爾遺傳?。?8］。這也符合“基因-環(huán)境”相互作用學(xué)說的理論，在易感基因突變的遺傳背景條件下，孕期的環(huán)境因素，如葉酸的攝入、視黃醇合成的缺乏等因素均可導(dǎo)致神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)化異常及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能的缺失，最終表現(xiàn)為相似遺傳背景下的不同外顯率［29-30］。因此，單一的基因組層面檢測(cè)在臨床上對(duì)疾病診斷的幫助有應(yīng)用條件，更多的獲益存在于高危新生兒中的篩查和診斷提示，例如，研究發(fā)現(xiàn)父母中有一方為長(zhǎng)段型巨結(jié)腸，其新生兒有 20% 的患病風(fēng)險(xiǎn)［22］，所以在臨床工作中，對(duì)于一些遺傳和家族風(fēng)險(xiǎn)較高的新生兒，即使沒有典型的臨床癥狀，根據(jù)具體情況也可能進(jìn)行直腸病理活檢，進(jìn)一步避免延誤診斷和治療的風(fēng)險(xiǎn)，但在缺乏進(jìn)一步研究完整性的情況下，使用產(chǎn)前檢測(cè)進(jìn)行干預(yù)可能還為時(shí)過早。

4 血漿游離生物標(biāo)記物的早診指標(biāo)

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指一類不能翻譯為蛋白質(zhì)的功能性RNA分子，主要分為短鏈的siRNA、miRNA和piRNA，以及長(zhǎng)鏈的lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)嵴細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中的增殖、遷移和分化是多個(gè)基因共同調(diào)控的結(jié)果，基因的表達(dá)和抑制受到多種因素的影響。但miRNA在進(jìn)化過程中高度保守，在胚胎早期神經(jīng)發(fā)育過程中具有明顯的時(shí)序性，如與神經(jīng)可塑性相關(guān)的miRNA132和miRNA124，與神經(jīng)退行性病變相關(guān)的miRNA221和miRNA101［31-32］，研究亦證實(shí)lncRNA可以調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育中的關(guān)鍵基因，并通過多種方式影響神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，包括抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑和明顯的修飾［33］。因此在ncRNA領(lǐng)域的研究中，miRNA和lncRNA均有研究證實(shí)與HSCR的發(fā)病密切相關(guān)，近些年也被應(yīng)用于疾病的無創(chuàng)性早期診斷中。

外周血miRNA在循環(huán)中相對(duì)穩(wěn)定，檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單。它最早被用于腫瘤疾病的早期診斷。研究發(fā)現(xiàn)外周血miRNA可以反映早期腫瘤的存在，與腫瘤的晚期侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、化療敏感有關(guān)。例如，miR-1246、miR-21和miR-155通過miRNA芯片檢測(cè)與食管癌的侵襲和復(fù)發(fā)相關(guān)，可作為一種新的疾病診斷和預(yù)后標(biāo)志物［34］；外周血外泌體中檢測(cè)的miRNA包括let-7a，miR-1229，miR-1246，miR-150，miR-21，miR-223、miR-23a和miR-378的表達(dá)與結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后密切相關(guān)［35］。因此，在HSCR早期診斷領(lǐng)域的研究，也聚焦于循環(huán)miRNA在該疾病早期診斷及預(yù)后的應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，在患者和正常對(duì)照的血清標(biāo)本中，miR-133a、miR-218-1、 miR-92a、miR-25 和 miR-483-5P 與疾病的發(fā)生正相關(guān)，可以作為HSCR新的無創(chuàng)性早期篩查血清標(biāo)志物［36］。鑒于miRNA的豐富性以及miRNA與靶基因之間的非單一配對(duì)關(guān)系，在HSCR復(fù)雜的遺傳背景下，一些學(xué)者篩選了不同miRNAs組合的表達(dá)譜芯片，用于疾病的早期診斷或巨結(jié)腸相關(guān)腸炎的檢測(cè)，而血漿外泌體中存在更穩(wěn)定的內(nèi)源性miRNAs，通過外泌體的提取和表達(dá)譜的鑒定，發(fā)現(xiàn)miR-494-3p、miR-668-3p、miR-323a-3p和miR605-3p的高表達(dá)與miR-5701的低表達(dá)和疾病的發(fā)生有關(guān)，可用于早期無創(chuàng)診斷［37］。LncRNA在HSCR診斷方面的研究相對(duì)較少，這主要是因?yàn)樵缙谡J(rèn)為L(zhǎng)ncRNA為轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，生物學(xué)效應(yīng)不明，隨著研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子、組蛋白等特定區(qū)域也可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后修飾的作用，具有調(diào)控功能基因表達(dá)的作用，例如lncRNA-MDl通過結(jié)合miR-133和miR-135影響MAMLl和MEF2CE基因的表達(dá)，參與肌細(xì)胞的分化功能［38］。在腸神經(jīng)早期分化與發(fā)育過程中，lncRNA也發(fā)揮重要作用，如lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)HSCR擴(kuò)張與狹窄腸管發(fā)現(xiàn)，ENST00000467240.1、ENST00000479039.1、ENST00000485020.1、TCONS00007196和NR034126.1有明顯差異表達(dá)；lncRNA-HAll7可能通過DPF3調(diào)控神經(jīng)增殖與分化成熟［39-40］。雖然目前尚沒有LncRNAs用于HSCR早期診斷的臨床效能評(píng)估研究，但這仍是疾病輔助診斷的備選之一。

5 不足與展望

HSCR仍然是兒童外科、胃腸病和遺傳學(xué)面臨的臨床挑戰(zhàn)，盡管過去十幾年來，疾病的診斷和圍術(shù)期管理取得了很多診療進(jìn)展，但在改善該疾病兒童的長(zhǎng)期預(yù)后方面仍任重道遠(yuǎn)。疾病早期特異性高的診斷方法可以避免消化系統(tǒng)發(fā)育不良、嚴(yán)重便秘甚至危及生命的小腸結(jié)腸炎的發(fā)生，對(duì)于降低漏診率、改善預(yù)后至關(guān)重要。隨著病理學(xué)、遺傳學(xué)和新型影像技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，未來必定可以提高絕大多數(shù)病例快速、無創(chuàng)和準(zhǔn)確的診斷效率。其次，為更好地體現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度和不同亞型神經(jīng)元比例的病理特征，對(duì)于患者“正常神經(jīng)節(jié)”的定義也需進(jìn)一步規(guī)范。描繪不同年齡層次和不同取材部位的大數(shù)據(jù)疾病組織圖譜將是推進(jìn)我們研究的關(guān)鍵。最后，手術(shù)仍然是基于切除無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段為目的，術(shù)式的選擇在過去十幾年間并沒有明顯變化，希望隨著早期診斷和無創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，能夠?qū)膊∵M(jìn)行更早的評(píng)估和干預(yù)，降低圍術(shù)期并發(fā)癥，改善患兒預(yù)后，并對(duì)干細(xì)胞治療等多樣化的綜合治療方法進(jìn)行研究和臨床轉(zhuǎn)化，這將是未來疾病診療研究的重要方向。