缺血性骨壞死動(dòng)物模型研究進(jìn)展

占澤銘 黃仁泰 陳云豐

缺血性骨壞死又稱無菌性骨壞死、骨梗塞，其發(fā)病與許多因素相關(guān)，包括創(chuàng)傷、使用糖皮質(zhì)激素、酗酒、沉箱病、戈謝病、風(fēng)濕性疾病等[1]。目前，各類骨壞死疾病的病理生理機(jī)制尚待研究，其診斷、治療及預(yù)防仍是臨床醫(yī)生的難題。合適的動(dòng)物模型可以反映病理?xiàng)l件下體內(nèi)微環(huán)境的變化，在一定程度上反映人類疾病的進(jìn)展。然而，由于研究目的和實(shí)驗(yàn)條件的差異，對于不同骨壞死部位仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物建模方法。本文回顧相關(guān)文獻(xiàn)，對各類缺血性骨壞死動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 創(chuàng)傷性造模方法

1.1 手術(shù)造模

創(chuàng)傷性因素是引起骨壞死的最主要原因，因股骨頸骨折等創(chuàng)傷性因素導(dǎo)致骨折處周圍血供破壞并引起血液循環(huán)受阻﹐則會(huì)發(fā)展為股骨頭壞死[2]。有學(xué)者為研究肝細(xì)胞生長因子（HGF）基因修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性骨壞死的效果，建立了一種兔早期骨壞死模型[3-4]。他們通過后側(cè)切口切斷股骨頭圓韌帶并剝離周圍軟組織，從根部切斷股骨頭后再縫合關(guān)節(jié)囊，術(shù)后行CT、磁共振成像（MRI）檢查發(fā)現(xiàn)，3 周后造模動(dòng)物明顯出現(xiàn)符合國際骨微循環(huán)研究協(xié)會(huì)（ARCO）壞死分期的一期或二期特征。Zhang 等[5]使用類似方法進(jìn)行動(dòng)物造模。他們在骨槽刀造成股骨頸骨折的基礎(chǔ)上，將骨折端分離2～3 min 后再用縫線固定，術(shù)后2周MRI 圖像即可見股骨頭塌陷征象。此類造模方法的優(yōu)點(diǎn)是考慮了骨壞死的生物力學(xué)因素，能夠模擬骨折導(dǎo)致的創(chuàng)傷性骨壞死發(fā)病機(jī)制；缺點(diǎn)是操作難度較高，動(dòng)物死亡率高。

Perthes 病是僅見于兒童的特發(fā)性髖關(guān)節(jié)缺血性壞死綜合征，發(fā)病率為0.4/10 萬～29.0/10 萬[6]。兒童因骨骼發(fā)育尚未成熟，且股骨頭血供與成人不同，學(xué)者們常采用手術(shù)方式阻斷骨周圍血供來建立Perthes 病動(dòng)物模型，其中通過股骨頸結(jié)扎法建立的仔豬Perthes 病模型最常用且最成熟。自2001 年起Kim 等[7]采用仔豬建立Perthes 病模型。他們以手術(shù)方式切斷仔豬股骨頭韌帶，并用不可吸收縫合繃帶結(jié)扎同側(cè)股骨頸以阻斷血供，術(shù)后行影像學(xué)、組織學(xué)和大體標(biāo)本檢查，證實(shí)成功誘導(dǎo)仔豬股骨干骺端缺血性壞死，并與Perthes 病的病理生理表現(xiàn)相似。之后此方法成為經(jīng)典的Perthes病動(dòng)物造模方法，至今學(xué)者們?nèi)灾饕捎么朔椒ㄟM(jìn)行Perthes 病診斷和防治的研究[8-9]。不過該方法存在不足之處，如動(dòng)物體積較大、不適合集中飼養(yǎng)、價(jià)格較貴等，其適合經(jīng)費(fèi)充足的研究。

2015 年，Kamiya 等[10]選用5 周齡雄性C57 小鼠，通過微血管造影技術(shù)確定了供應(yīng)小鼠股骨遠(yuǎn)端骨骺的4 組血管，經(jīng)顯微鏡輔助，通過后內(nèi)側(cè)入路灼燒腘動(dòng)脈骨骺分支，通過內(nèi)側(cè)髕骨旁入路切開膝關(guān)節(jié)以灼燒供應(yīng)右股骨遠(yuǎn)端骨骺的膝外側(cè)上動(dòng)脈、膝內(nèi)側(cè)上動(dòng)脈和膝下動(dòng)脈。同時(shí)，他們將左股骨遠(yuǎn)端骨骺作為對照組進(jìn)行研究。術(shù)后組織學(xué)檢查證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組骨骺出現(xiàn)骨壞死后吸收及新骨形成過程，術(shù)后4 周HE 染色顯示，空骨陷窩和核固縮骨細(xì)胞數(shù)占骨陷窩總數(shù)的78%±15%，術(shù)后1周原位末端標(biāo)記法（TUNEL）染色見死亡骨細(xì)胞數(shù)占骨細(xì)胞總數(shù)的98%±3%，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色見破骨細(xì)胞數(shù)顯著下降，隨后逐漸上升，至術(shù)后6 周達(dá)到與對照組水平相近。經(jīng)微CT 圖像評估骨體積百分比、骨小梁厚度發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組均較對照組降低，術(shù)后6 周小鼠骨骺可見塌陷畸形，僅1 只小鼠死亡。該方法造模效果明確，骨壞死發(fā)生率為100%，許多學(xué)者均采用此造模方法進(jìn)行Perthes 病后續(xù)研究。Yamaguchi 等[11]采用上述方法造模，研究年齡對缺血性骨壞死修復(fù)過程的影響，他們分別選取5 周、12 周、22 周和52 周齡的雄性C57 小鼠，于造模術(shù)后2 d 或4 周處死小鼠。TUNEL 染色顯示，各年齡組均可見廣泛的骨細(xì)胞死亡，證實(shí)該造模方法適用于不同年齡段小鼠。此方法可模擬臨床上因創(chuàng)傷后骨骺周圍血供破壞導(dǎo)致的缺血性骨壞死，其成模效果可靠，已逐漸成為常用的造模方式。該方法的缺點(diǎn)是顯微操作較復(fù)雜，手術(shù)切口多，對動(dòng)物造成損傷較大，且遠(yuǎn)端骨骺不能完全模擬其他部位（如股骨頭等）的骨壞死病理生理過程。

1.2 液氮造模

液氮造模的原理是通過液氮低溫造成骨細(xì)胞及骨間充質(zhì)細(xì)胞的損傷以及骨周圍血管痙攣，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血，血管通透性增加，繼而發(fā)生出血和復(fù)溫后缺血再灌注損傷，進(jìn)一步誘發(fā)血栓形成，冷凍區(qū)域血供減少，加重骨細(xì)胞損傷、骨質(zhì)壞死，導(dǎo)致缺血性骨壞死[12-13]。

Wang 等[14]采用新西蘭大白兔進(jìn)行造模。他們橫切兔股骨頭圓韌帶，然后立即用浸泡液氮的克氏針接觸股骨頭表面，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而影響血管的正常功能。術(shù)后1 個(gè)月大體觀察、微CT 及MRI 檢查均證實(shí)發(fā)生股骨頭壞死。Li 等[15]使用成年雌性小尾寒羊進(jìn)行造模。他們在股骨頭-頸交界處的股骨頭負(fù)重區(qū)域鉆孔，將冷凍探針插入隧道，誘導(dǎo)股骨頭血管發(fā)生低溫?fù)p傷，1 個(gè)月后行組織學(xué)檢查見大量空骨陷窩出現(xiàn)，成功建立了股骨頭壞死的羊模型。

液氮造模的主要優(yōu)點(diǎn)是造模周期短、動(dòng)物死亡率低，具有良好的可重復(fù)性，能夠快速穩(wěn)定地制備大量動(dòng)物模型。缺點(diǎn)在于，該方法不是導(dǎo)致骨壞死的正常病因，不能用于骨壞死發(fā)病機(jī)制的研究，只能用于治療和預(yù)后的研究。

1.3 化學(xué)方法造模

化學(xué)方法造模是通過化學(xué)物質(zhì)（通常為乙醇）直接作用于骨骼局部，對骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)滅活而形成病變，國內(nèi)外學(xué)者大多將該方法應(yīng)用于股骨頭壞死的造模研究。

顧江江等[16]采用青腳麻雞為模型動(dòng)物﹐對其股骨頭中心鉆孔﹐并在孔內(nèi)注射乙醇灼燒骨質(zhì)，破壞骨內(nèi)血供后再植入原骨，1 個(gè)月后通過微CT圖像觀察﹐發(fā)現(xiàn)骨體積分?jǐn)?shù)、平均小梁間距、平均骨小梁數(shù)量與對照組及未處理組相比均有顯著性不同﹐表明成功建立了股骨頭壞死模型。Yuan等[17]采用羊?yàn)槟Ｐ蛣?dòng)物﹐將無水乙醇注入羊距骨中，分別于術(shù)后2 周、4 周、12 周、24 周取材觀察股骨頭缺血性壞死情況，通過X 線、CT 檢查及組織學(xué)觀察確定距骨骨壞死模型成功建立﹐證實(shí)該方法可應(yīng)用于股骨頭以外部位的骨壞死造模，為距骨壞死干預(yù)研究創(chuàng)造了模型基礎(chǔ)。

化學(xué)方法造模的優(yōu)點(diǎn)是可重復(fù)性高，操作簡易。它的缺點(diǎn)是缺乏統(tǒng)一的化學(xué)物質(zhì)用量標(biāo)準(zhǔn)，骨內(nèi)可能殘留化學(xué)物質(zhì)，從而破壞骨組織結(jié)構(gòu)。此外，該方法也不是導(dǎo)致骨壞死的正常病因，不適用于骨壞死發(fā)病機(jī)制的研究。

1.4 介入栓塞造模

近年來，血管介入栓塞造模方法逐漸興起﹐該方法可以減少手術(shù)創(chuàng)傷法導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷過大、死亡率高的問題。其方法主要分為兩類：①骨內(nèi)注射栓塞材料導(dǎo)致骨內(nèi)壓升高，靜脈回流障礙，引起局部骨組織缺血壞死；②將栓塞材料直接注入動(dòng)脈，使動(dòng)脈栓塞導(dǎo)致相應(yīng)的骨組織壞死。

張開放等[18]以介入栓塞法制作兔動(dòng)物模型。他們以骨穿刺針穿入股骨頸中央，注射醫(yī)用-氰基烯酸酯類膠導(dǎo)致骺板缺血，然后將動(dòng)物置于定制的高籠中飼養(yǎng)，迫使動(dòng)物飲食時(shí)以后肢負(fù)重。術(shù)后造模動(dòng)物出現(xiàn)跛行，關(guān)節(jié)周圍腫脹，關(guān)節(jié)間隙增寬，骨密度下降，骨小梁內(nèi)壞死細(xì)胞增多。廖勇[19]使用聚乙烯醇(PVA)、明膠海綿顆粒、栓塞彈簧圈等不同栓塞材料，采用山羊?yàn)樵炷?dòng)物﹐對比不同栓塞材料對造模的影響，術(shù)后6 周行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組空骨陷窩百分比、骨小梁面積百分比均明顯低于對照組﹐并發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用栓塞材料時(shí)，PVA 的造模效果最佳，而聯(lián)合應(yīng)用3 種栓塞材料較單獨(dú)應(yīng)用1 種材料的造模效果更好。

血管栓塞造模法效果明確，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷小，但手術(shù)精細(xì)，操作難度較大，通常需選用大型動(dòng)物建模，且目前對栓塞劑的選擇并未取得共識(shí)。

1.5 物理加熱造模

物理加熱法也是新的造模方法。該方法通過物理方法（如微波、高強(qiáng)度聚焦超聲）對股骨頭加熱造成骨壞死，可形成與人類股骨頭壞死相似的病理表現(xiàn)，具有造模方法簡單、周期較短、造模穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但需要特定設(shè)備，有一定局限性。

彭吾訓(xùn)等[20]對微波加熱制作兔股骨頭壞死模型的設(shè)定溫度及時(shí)間開展研究。他們分別以50℃10 min、50℃20 min、55℃10 min、60℃10 min的條件造模，然后行組織學(xué)檢查及MRI 檢查。研究結(jié)果顯示，以55℃10 min 進(jìn)行造模，4 周后即出現(xiàn)骨壞死及修復(fù)現(xiàn)象，12 周時(shí)可出現(xiàn)股骨頭壞死塌陷表現(xiàn)，塌陷率為75%。他們認(rèn)為，55℃10 min為最適宜造模的微波溫度和時(shí)長。徐燕等[21]對高強(qiáng)度聚焦超聲建立骨壞死模型的可行性進(jìn)行探索，他們以80 W/cm2強(qiáng)度超聲照射兔股骨頭，并于照射后1 d、7 d、14 d、21 d 分別行大體形態(tài)觀察及組織學(xué)檢查。研究結(jié)果顯示，此方法形成的骨壞死具有清晰的病理演變特征，顯示出高強(qiáng)度聚焦超聲應(yīng)用于骨壞死造模的可行性。

2 非創(chuàng)傷性造模方法

2.1 激素誘導(dǎo)

激素是導(dǎo)致股骨頭壞死的第二大病因[22]，許多學(xué)者通過激素誘導(dǎo)的方法來建立動(dòng)物模型，以模擬人激素性股骨頭壞死[23]。該造模方法操作方便，對動(dòng)物創(chuàng)傷小，但不同學(xué)者采用的激素種類不同，劑量和給藥途徑也存在差異，方法較難標(biāo)準(zhǔn)化。此外，單獨(dú)應(yīng)用激素還存在壞死部位不集中、動(dòng)物死亡率高、造模成功率低等缺點(diǎn)[24]。為避免其不足，一些學(xué)者采用間斷性給藥，以降低動(dòng)物死亡率，達(dá)到穩(wěn)定建模的效果。Liu 等[25]采用健康雌性小鼠造模。他們給予小鼠肌內(nèi)注射甲基強(qiáng)的松龍20 mg/kg，每周前3 d 注射3 次后停4 d，連續(xù)使用3 周后停3 周，用時(shí)共6 周。他們發(fā)現(xiàn)，造模小鼠全數(shù)存活，微CT 檢查顯示其股骨頭軟骨面變薄，骨小梁稀疏，HE 染色見骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞減少。

2.2 激素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)

脂多糖（LPS）為外源性致熱源，其可通過介導(dǎo)一系列炎癥因子表達(dá)誘導(dǎo)血管中的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并可通過內(nèi)源性凝血途徑引起機(jī)體的高凝狀態(tài)。LPS 與激素合用可造成血管內(nèi)凝血﹐影響血液循環(huán)。臨床中多數(shù)骨壞死患者系患有免疫系統(tǒng)疾?。ㄈ缦⑾到y(tǒng)性紅斑狼瘡），這些免疫系統(tǒng)疾病導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生微循環(huán)障礙，在大量、長期的激素治療后發(fā)展為激素性骨壞死[26]。因此，激素聯(lián)合LPS的造模方法逐漸為廣大學(xué)者所用。

Lv 等[27]采用SD 大鼠造模，于第1 天、第2天肌內(nèi)注射LPS 1.0 mg/kg，然后連續(xù)3 d 注射甲基強(qiáng)的松龍40 mg/kg，4 周后通過組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，造模大鼠出現(xiàn)股骨頭的骨小梁斷裂、骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞減少，TUNEL 法檢測顯示實(shí)驗(yàn)組股骨頭骨細(xì)胞凋亡率高于對照組。Jin 等[28]則選用雌性C57小鼠進(jìn)行造模研究，他們于第1 天、第2 天給予小鼠腹腔注射LPS 20 μg/kg，2 d 后每天肌內(nèi)注射甲基強(qiáng)的松龍 40 mg/kg，并提高喂養(yǎng)槽高度以強(qiáng)迫小鼠站立進(jìn)食，同時(shí)每天將小鼠置于旋轉(zhuǎn)籠中，鼓勵(lì)活動(dòng)2 h，4 周后通過組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，成模率為80%，小鼠死亡率為16.7%。

2.3 激素聯(lián)合異種動(dòng)物血清誘導(dǎo)

類似于LPS，異種動(dòng)物血清（如馬血清）能誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)超敏免疫反應(yīng)，使血管內(nèi)皮受損，形成血管炎癥。使用激素聯(lián)合馬血清則可導(dǎo)致微血管栓塞，從而提高建模成功率。王小龍等[29]使用靜脈注射馬血清加腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍的方法對新西蘭大白兔進(jìn)行造模，4 周后模型大體標(biāo)本及MRI 圖像均可見骨壞死表現(xiàn)，造模成功率為84.62%，動(dòng)物死亡率為13.33%。

2.4 酒精誘導(dǎo)

酒精性骨壞死常發(fā)生于中青年過量飲酒者，在男性股骨頭壞死病因中占30.68%[26]。近年來，酒精性骨壞死的發(fā)病率不斷升高。因此，學(xué)者們采用酒精灌胃、含酒精飲食等方法進(jìn)行骨壞死動(dòng)物造模，以模仿過量攝取酒精導(dǎo)致的骨壞死。

楊云等[30]使用酒精灌胃法給予Wistar 大鼠46°白酒，并采用抬高喂養(yǎng)槽的方法使其進(jìn)食時(shí)下肢承重，以更接近人類的生物力學(xué)作用，6 個(gè)月后造模成功率達(dá)89.48%，但未出現(xiàn)股骨頭變形塌陷及髖臼磨損改變，大鼠死亡率為10%。Yang 等[31]使用酒精對大鼠進(jìn)行6 周喂養(yǎng)，初始酒精濃度為5%，以后每周增加5%，最后酒精濃度穩(wěn)定于30%。該方法比灌胃法更人道，操作更簡單。6 周后經(jīng)微CT 和組織病理學(xué)檢查證實(shí)，大鼠股骨頭軟骨下區(qū)出現(xiàn)多發(fā)彌漫性空腔隙及骨髓壞死，10 只大鼠中8 只出現(xiàn)嚴(yán)重股骨頭壞死。

高濃度酒精灌胃法的成模率高，但動(dòng)物死亡風(fēng)險(xiǎn)也隨之增高，且存在乙醇濃度無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，壞死部位不集中等缺點(diǎn)。目前大部分有關(guān)酒精建模的研究都無法進(jìn)展至股骨頭塌陷階段[32]，造模方案還需進(jìn)一步改良。

2.5 減壓誘導(dǎo)

減壓性骨壞死屬于比較罕見的骨壞死類型，主要發(fā)生于一些特殊工作人員（如潛水作業(yè)員、沉箱作業(yè)員等），他們在高氣壓環(huán)境下突然下降至正常氣壓后，原溶解于血液中的氮?dú)忉尦?，并在骨髓中大量堆積，最終導(dǎo)致骨壞死。建立減壓性骨壞死動(dòng)物模型可用于研究其病理機(jī)制、診治及預(yù)防等[33]。

目前用于減壓性骨壞死的造模動(dòng)物主要有羊和豬，而豚鼠、狗等不適用。李慈等[34]進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，他們用加壓艙將小型豬置于0.45 MPa壓力環(huán)境下6 h，然后于1 min 內(nèi)將壓力減至正常大氣壓水平，如此處理每周重復(fù)2～3 次，共持續(xù)6 個(gè)月。隨后通過骨掃描及骨病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肱骨頭、股骨頭血流淤滯，股骨頭壞死變形。Sobakin 等[35]則使用綿羊進(jìn)行研究，他們將綿羊置于0.28 MPa 壓力環(huán)境下24 h，隨后以每分鐘下降0.09 MPa 的速率減壓，通過骨掃描檢查可見近端或遠(yuǎn)端長骨均出現(xiàn)骨修復(fù)現(xiàn)象﹐提示發(fā)生了骨壞死。

減壓誘導(dǎo)造模的優(yōu)點(diǎn)是骨壞死部位不局限于股骨頭，還可出現(xiàn)其他部位如肱骨、橈骨等壞死，這對于其他部位骨壞死模型的研發(fā)和應(yīng)用有啟發(fā)作用。而其缺點(diǎn)也十分明顯，此類動(dòng)物模型僅能用于減壓性骨壞死的相關(guān)研究，且造模周期長，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高。

3 結(jié)語

不同的骨壞死動(dòng)物造模方法各有優(yōu)劣，適合于對骨壞死不同方向的研究，目前尚無與人類骨壞死發(fā)病機(jī)制完全一致的動(dòng)物模型。激素造模法符合臨床股骨頭壞死的發(fā)病過程，研究意義大，但對于采用激素的種類、劑量、給藥方式等尚未有統(tǒng)一結(jié)論。對于創(chuàng)傷及手術(shù)后恢復(fù)不良導(dǎo)致的骨壞死研究，手術(shù)造模為最佳選擇。對于酒精導(dǎo)致骨壞死的研究，可選用局部注射無水乙醇、含酒精飲食喂養(yǎng)等方式誘導(dǎo)造模。液氮造模對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損傷小，造模方法簡便，建模效果穩(wěn)定，是目前使用較多的方法，適用于對骨壞死治療的研究。

在骨壞死造模領(lǐng)域，大部分研究集中于股骨頭壞死、Perthes 病，尚缺乏對其他部位骨壞死如肱骨頭壞死、距骨壞死、舟骨缺血性壞死等造模的研究。動(dòng)物模型的研究能為相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、防治方案等后續(xù)研究提供基礎(chǔ)，因此不同部位骨壞死模型的研究還需進(jìn)一步探索。