新疆小麥白粉病菌群體遺傳多樣性分析

來漢林,沈煜洋,李 月,陳 利,李廣闊,崔燕華,高海峰

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物科學(xué)觀測實驗站,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場,新疆烏魯木齊 830012)

由專性寄生菌Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的小麥白粉病是一種典型的氣傳病害,是我國小麥生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害之一,嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。20世紀(jì)70年代以來,由于矮稈品種、密植技術(shù)的推廣和氮肥使用量的增加,導(dǎo)致小麥白粉病的危害呈現(xiàn)逐年加重的趨勢[3]。近年來,受菌源變異、氣候變化、種植條件改變及部分主栽品種抗病性喪失等多種因素的影響,新疆地區(qū)小麥白粉病嚴(yán)重發(fā)生[4]。培育和選用抗病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)、有效的措施[5],研究小麥白粉菌群體遺傳多樣性對選育抗病品種和病害防治具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA分子標(biāo)記在小麥白粉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮著重要作用[6]。用于白粉病菌研究的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(random amplified of polymorphic DNA,RAPD)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間(simple repeat sequence intervals,ISSR)、擴增片段長度多態(tài)分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析等[7-8]。雷 雨等[9]在2013年利用RAPD分子標(biāo)記對四川西南部小麥白粉病菌群體遺傳多樣性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的遺傳多態(tài)性豐富,毒性多樣性與遺傳多樣性不存在線性關(guān)系。曹志強等[10]利用AFLP技術(shù)對2009—2015年安徽省各地區(qū)小麥白粉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)不同年份的白粉病菌群體遺傳多樣性水平存在一定的遺傳變異。馬原里等[11]用SNP結(jié)合SSR分子標(biāo)記對小麥抗白粉病基因進(jìn)行了定位。ISSR技術(shù)具有操作簡單、重復(fù)性高、無需同位素、精準(zhǔn)度高、能高程度揭示DNA多態(tài)性等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于分子檢測中[12]。賈少鋒等[13]構(gòu)建了小麥白粉病菌ISSR-PCR體系,并首次將其應(yīng)用到小麥白粉病菌遺傳多樣性分析中。劉 娜等[14]采用ISSR和SRAP分子標(biāo)記對四川省小麥白粉病菌野生群體遺傳多樣性進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)這兩種標(biāo)記均可用于研究小麥白粉病菌的遺傳多樣性。李 瑩等[15]和李 強等[16]用ISSR技術(shù)分析了陜西省不同年份小麥群體的遺傳多樣性。有關(guān)新疆小麥此方面的研究未見報道。為此,本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對2020年喀什、阿克蘇、和田、昌吉、塔城小麥白粉病菌群體進(jìn)行遺傳多樣性研究,以期為新疆小麥白粉病流行監(jiān)測、抗病育種及病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:2020年5月初至6月中旬小麥白粉病發(fā)病高峰期,分別從新疆5個地區(qū)13個縣市采集小麥白粉病菌樣品,地點為:和田地區(qū)的墨玉縣(1)和洛浦縣(2),喀什地區(qū)的澤普縣(2)和葉城縣(2),阿克蘇地區(qū)的溫宿縣(7)、拜城縣(2)和阿瓦提縣(3),塔城地區(qū)的額敏縣(6)、塔城市(5)和托里縣(6),昌吉州的阜康市(8)、木壘縣(5)和奇臺縣(5),經(jīng)分離純化,共獲得54株白粉病菌菌株(表1)。

表1 采樣位置信息Table 1 Isolates location information

擴繁小麥品種:感病品種新春6號,由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取

將獲得的54株菌株用新春6號擴繁,收集葉片上小麥白粉病菌分生孢子,稱取10～15 mg,用天根微生物基因組DNA提取試劑盒DP302(中國)提取基因組DNA,用Nano Drop 610檢測DNA濃度,OD260/OD280為1.65～1.85之間,4°C保存待用。

1.2.2 ISSR-PCR檢測

對小麥白粉病菌利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測,預(yù)試驗從P1～P18[15]中篩選出8條擴增條帶明顯且多態(tài)性穩(wěn)定的引物P3、P5、P7、P9、P15、P16、P17和P18(表2),引物由上海生工合成,目標(biāo)片段在100～2 000 bp之間。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×PCR Mix 12.5 μL,菌株DNA模板1 μL,上下游引物各0.25 μL,ddH2O 11 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,50～54 ℃退火35 s,72 ℃ 延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃延伸3 min,4 ℃保存。擴增結(jié)果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 ISSR引物序列Table 2 Sequence of ISSR primers

1.2.3 遺傳多樣性分析

根據(jù)54個小麥白粉病菌菌株的擴增條帶結(jié)果,有條帶的記為1,無條帶的記為0,表示等位基因的有或無。將轉(zhuǎn)換的0/1數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS pc(2.10e,WIB,CAS)統(tǒng)計軟件進(jìn)行遺傳相似性分析,通過Normalized Mantel Statistic進(jìn)行遺傳距離和地理距離相關(guān)性分析。采用非加權(quán)類平均法(unweight pairgroup method using arithmetic averages,UPGMA)構(gòu)建小麥白粉病菌遺傳多態(tài)性聚類分析樹狀圖。用popgene(1.32, UA, CIFOR)軟件對菌株群體進(jìn)行等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、遺傳距離、遺傳一致度和基因流Nm群體遺傳分化系數(shù)的計算。

2 結(jié)果分析

2.1 ISSR擴增結(jié)果分析

供試菌株ISSR-PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1,表2)顯示,引物P3擴增出了22條清晰條帶,數(shù)目最多;引物P5擴增出3條清晰帶,數(shù)目最少;引物P7、P9、P15、P16、P17和P18擴增條帶數(shù)分別為10、12、9、9、7和5條。共擴增出條帶77條,其中多態(tài)條帶68條,多態(tài)性比率為88.31%。

2.2 群體間分子遺傳多樣性分析

由表3可知,新疆不同區(qū)域小麥白粉病菌群體遺傳多樣性存在差異。5個群體的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)介于0.146 1～0.260 9之間,塔城群體最高,其次是阿克蘇群體(0.246 7),二者顯著高于和田群體,與昌吉群體和喀什群體之間無顯著性差異;昌吉群體和喀什群體分別為0.223 4和0.210 7,均高于和田群體,但差異不顯著;和田群體遺傳多樣性最低。塔城群體的等位基因數(shù)為1.805 2,多態(tài)位點數(shù)和多態(tài)位點百分比為62和80.52%,均高于其他4個群體。表明塔城群體的遺傳多樣性水平最高,其次是昌吉群體,和田群體最低。當(dāng)Nm< 1時,表明不同群體間基因交流水平低,僅具有遺傳分化的潛力;當(dāng)基因流1≤Nm≤4時,表明不同群體間存在一定的基因交流,并且遺傳分化較小[17]。本研究的基因流Nm為2.749 0,表明新疆不同地區(qū)小麥白粉病菌群體存在一定的基因交流。

表3 新疆5個小麥白粉病菌群體遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of five Blumeria graminis f. sp. tritici populations in Xinjiang

2.3 群體間的遺傳距離和一致度分析

昌吉、塔城、阿克蘇、喀什和和田群體間的遺傳距離和一致度分析結(jié)果(表4)表明,其遺傳距離介于0.031 7～0.094 5之間,遺傳一致度介于0.909 8～0.968 8之間,其中,塔城與阿克蘇群體的遺傳距離最近,和田與喀什的遺傳距離最大;遺傳一致性則與對應(yīng)的遺傳距離相反。說明塔城與阿克蘇群體親緣關(guān)系更近。

表4 新疆5個小麥白粉病菌群體遺傳距離與遺傳一致度Table 4 Genetic distance and genetic consistency of five Blumeria graminis f. sp. tritici populations in Xinjiang

2.4 群體遺傳變異分析

新疆5個區(qū)域小麥白粉病菌群體總Nei’s多樣性指數(shù)為0.257 1,群體內(nèi)Nei’s多樣性指數(shù)為0.217 5,群體遺傳分化系數(shù)為0.153 9,群體內(nèi)的遺傳變異占總體變異的84.60%。由此表明,遺傳變異主要來源于群體內(nèi),群體間存在較大的分化。

2.5 群體遺傳聚類分析

UPGMA聚類分析結(jié)果(圖2)表明,當(dāng)遺傳距離為0.932時,可將5個群體分為三大分支,第一大分支包含昌吉、塔城、阿克蘇共3個亞群,其中塔城和阿克蘇群體歸為一小分支;第二大分支是喀什;第三大分支是和田群體。建立群體間的遺傳距離和地理位置距離矩陣,通過Normalized Mantel Statistic檢驗分析,相關(guān)系數(shù)為r= 0.170 0,表明新疆5個小麥白粉病菌群體的遺傳距離與地理距離相關(guān)性不顯著。

圖2 基于非加權(quán)組平均法的新疆5個小麥白粉病菌群體聚類分析Fig.2 Cluster analysis of five Blumeria graminisf. sp. tritici populations from Xinjiang based on unweighted pair-group method with arithmetic means

3 討論

前人對新疆地區(qū)小麥白粉病的研究主要集中在藥效評價、抗病品種鑒定、毒性監(jiān)測和田間發(fā)生流行規(guī)律研究方面。趙海燕等[18]和李廣闊等[19]研究發(fā)現(xiàn),核桃小麥套種有利于白粉病的發(fā)生。高海峰等[20]篩選出新紫1號和14/8329兩個品種(系)對小麥白粉病具有明顯抗性。王振花等[21]對新疆小麥白粉病菌群體毒性進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)大部分基因乃存在抗性。高海峰等[22]發(fā)現(xiàn)新冬60號和新冬57號田間發(fā)生危害程度顯著低于新冬20號。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記對新疆不同區(qū)域5個群體54株小麥白粉病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明,不同地區(qū)白粉病菌群體之間遺傳多樣性存在差異,遺傳變異主要來源于群體內(nèi)部,且不同群體之間存在一定的基因交流。這與李 瑩等[15]、李 強等[16]、趙紫慧等[23]和石 琳等[24]對陜西、山東、河北、四川、甘肅等地區(qū)的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn),新疆小麥白粉病菌群體遺傳距離與地理距離的相關(guān)不顯著,這與李 瑩等[15]對2016年陜西省小麥白粉病菌遺傳多樣性研究的結(jié)果相似,而李 強等[16]和Zeng等[25]研究發(fā)現(xiàn),小麥白粉病菌群體遺傳距離與地理距離顯著相關(guān),結(jié)果不同可能是由于不同區(qū)域之間因地形特征引起的環(huán)境不同。

北疆地區(qū)的昌吉和塔城之間白粉病菌群體遺傳一致度較高,這可能是由于塔城和昌吉位于準(zhǔn)噶爾盆地兩緣,中間無山脈阻礙,白粉病菌在高空氣流作用下便于基因交流。南疆地區(qū)的喀什與和田白粉病菌群體遺傳一致度最低,這可能是由于喀什與和田位于塔克拉瑪干沙漠邊緣,白粉病菌很難通過沙漠在兩地之間進(jìn)行基因交流。整體分析表明,北疆和南疆小麥白粉病菌群體遺傳一致度較低,原因可能是天山山脈把昌吉、塔城與阿克蘇、喀什、和田分開,且南疆有我國最大的塔克拉瑪干沙漠,阻礙了南、北疆小麥白粉病菌基因交流。新疆面積大,南、北疆小麥主產(chǎn)區(qū)相距較遠(yuǎn),種植制度不同,且有高山、沙漠阻隔,易造成小麥白粉病菌群體遺傳差異大,因此,在下一步研究中應(yīng)擴大樣本采集區(qū)域和數(shù)量,進(jìn)一步明確南、北疆小麥白粉病菌群體遺傳特征,為新疆小麥白粉病的科學(xué)防控提供依據(jù)。