動物源性食品中β2-受體激動劑殘留檢測技術研究進展

黃笑晨，李國俊，邢麗麗，紀春景

河北省體育科學研究所 河北省神經肌肉功能與力量訓練實驗室（石家莊 050011）

β2-受體激動劑，又稱為β2-興奮劑，是一類合成的苯乙醇胺類化合物，最初主要應用于治療支氣管哮喘和高血壓等疾病[1-2]。也因為β2-受體激動劑具有降低動物體脂率、促進蛋白質合成等作用，故也被稱為“瘦肉精”[3]。自20世紀80年代開始，β2-受體激動劑就作為飼料添加劑被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。隨著該類物質的應用不斷增多，毒性研究表明，人類攝入含有β2-受體激動劑的食物可引起急性食物中毒，并會導致心血管和神經系統的嚴重不良反應發(fā)生，嚴重危害人體健康[4-6]。因此，世界上大多數國家都對β2-受體激動劑在農業(yè)生產活動中的使用有極其嚴格的規(guī)定[7-9]。2020年，農業(yè)農村部《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》規(guī)定β2-受體激動劑及其鹽和酯為禁止使用的藥物，在動物源性食品中不得檢出[10]。但2021年央視“3·15”晚會曝光河北青縣的“瘦肉精羊”事件，又使“瘦肉精”重新進入公眾視野中。此外，β2-受體激動劑也是世界反興奮劑組織（World Anti-Doping Agency，WADA）禁用清單上的重點監(jiān)控物質[11]。運動員如果誤服含有該類物質的動物源性食品后，可能導致尿檢結果陽性。因此，為保障我國廣大人民的舌尖上的安全、避免運動員誤服事件的發(fā)生，開展動物源性食品中β2-受體激動劑高通量多殘留檢測研究意義重大。

本文主要從樣品前處理方法和檢測技術兩個方面對其研究現狀進行綜述，為動物源性食品中β2-受體激動劑的殘留檢測研究的開展奠定基礎。

1 樣品前處理技術

1.1 液液萃取

液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）是發(fā)展最早的提取技術之一，原理是利用相似相溶原理，實現目標物在不同極性的溶劑中轉移和富集。Li等[12]利用乙腈溶劑提取，正己烷脫脂兩次，實現對牛奶樣品的凈化。結果顯示5種β2-受體激動劑的基質效應較小，回收率為75.6%~100.3%。

1.2 固相萃取

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）的原理是將固相萃取柱進行活化后上樣，淋洗去除雜質后，通過洗脫液將柱上富集的目標物洗脫收集[13]。Guo等[14]利用MCX柱提取凈化豬肉和豬肝中的22種β2-受體激動劑，采用5%氨水甲醇洗脫，加標回收率為74.6%~111.7%。Yikilmaz等[15]采用固相萃取-液相色譜-串聯質譜法對牛組織中的4種β2-受體激動劑殘留進行測定，選用C18柱凈化，各物質的相關系數均大于0.99，回收率為84.3%~119.1%。通過式固相萃取是當前高通量檢測中常用的新技術，該萃取柱無需活化，樣品可直接過柱收集，凈化效果好且環(huán)保[16-17]。Wang等[18]利用PRiME HLB柱快速凈化，實現了畜禽食品中155種獸藥的高通量分析。關學農等[19]采用酸化乙腈處理牛乳樣品，選用PRiME HLB柱凈化，收集流出液，濃縮后復溶上機。結果表明，19種受體激動劑在不同加標濃度下，回收率為70.6%~104.5%，SRSD為1.1%~11.7%，顯示出較好的準確度和精密度。

相比于液液萃取，固相萃取可同步實現對樣品的富集和凈化，大幅提升工作效率。但固相萃取柱一般不可重復利用，前處理成本較高。

1.3 磁性固相萃取

磁性固相萃取（magnetic solid phase extraction，MSPE）是一種新型的樣品預富集方法，常選擇具有磁性或可磁化的材料吸附目標物以達到分離目的。該方法的特點是可直接將合成的磁性材料加入到溶液中吸附目標物，通過強磁體將其轉移，選擇合適的洗脫溶劑洗脫目標物，實現富集和分離[20-21]。Wang等[22]以制備涂覆SiO2/Fe3O4的MIL-101(Cr)-NH2和氧化石墨烯磁性顆粒作為吸附劑，開發(fā)高效液相色譜-串聯質譜法測定20種β-受體阻滯劑和8種β2-受體激動劑的分析方法，方法的檢出限為0.002~0.007 μg/L，SRSD為3.0%~8.3%。Zhang等[23]以金屬-有機骨架（MOF）MIL-100（Fe）為碳前驅體制備3D磁性多孔碳（MPCK），并將其用于羊肉樣品中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺的磁性固相萃取的吸附劑。結果顯示，2種目標物在0.05~40 μg/L范圍內具有良好線性（r≥0.997 2），SLOD為0.13和0.15 μg/kg，回收率為95.64%~114.65%。

與固相萃取不同，MSPE具有試劑用量少、萃取時間短、提取效率高和抗干擾能力好的特點，越來越受到廣泛關注。而且磁性材料可在洗脫后反復回收利用，經濟且環(huán)保。

1.4 QuEChERS

QuEChERS是根據不同基質采用不同的吸附劑進行搭配，加入溶液中對其中的雜質進行選擇性吸附，從而降低或消除基質效應[24]。該方法具有凈化效果好、回收率高等優(yōu)點。劉新輝等[25]建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜檢測動物源性食品中β2-受體激動劑類藥物殘留的方法。樣品經1%氨水乙腈提取，利用無水硫酸鎂脫水后，依次利用QuEChERS凈化管、反萃管凈化。結果顯示，17種受體激動劑在0.2~20 ng/mL范圍內線性關系良好（r≥0.99），平均回收率為80.2%~108.5%，SRSD為2.9%~12.4%。Zhang等[26]利用0.1%甲酸-乙腈提取豬肉中的26種β2-受體激動劑，采用含有150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18的多功能過濾器進行凈化，結果表明，26種受體激動劑的平均回收率為71.2%~118.6%，日間、日內精密度均小于20%，具有良好的精密度和可重復性，且凈化效果好，不存在基質效應干擾。

1.5 分子印跡技術

分子印跡技術（molecular imprinting technology，MIT）是源于抗原-抗體特異性結合的想法，通過合成對模板分子具有極強識別能力的分子印跡聚合物進行目標物的分離和純化。模板分子是被選擇作為印跡的目標分子，可以是特定的分析物或藥物分子，或其類似物[27]。Tang等[28]以克倫特羅衍生物為功能單體，通過共價印跡法合成一種高效從豬肉中分離和濃縮克倫特羅的新型分子印跡聚合物。Wang等[29]以苯乙醇胺A為印跡分子，對乙烯基苯甲酸為功能單體，合成一種新型分子印跡聚合物微球，可選擇性吸附克倫特羅等物質。并基于此建立超高效液相色譜-串聯質譜檢測豬肉中5種β2-受體激動劑的靈敏測定方法。5種受體激動劑的SLOD均小于0.02 μg/kg。

雖然分子印跡聚合物可以根據需求進行設計，具有高度的專一性，但其存在制備成本較高和分子印跡相關理論和研究還有待發(fā)展等缺點，應用范圍有待拓寬。

1.6 其他前處理技術

肖志明等[30]利用液相色譜-串聯質譜法檢測豬、牛、羊肌肉和肝臟中22種β2-受體激動劑殘留。該方法采用超聲探針技術輔助酶解，大幅提升酶解效率。前處理采用全自動固相萃取技術，在0.5 h內即可處理36份樣品。結果表明，22種受體激動劑的回收率為81.2%~100.7%，SRSD為0.3%~7.9%，SLOD和SLOQ分別為0.3和1.0 μg/kg。

Cao等[31]首次制備4-苯乙烯磺酸鈉功能化納米纖維膜（SS/PAN NFM），并將其作為96孔板固相萃取的吸附劑用于豬肉中7種β2-受體激動劑殘留的定量測定。研究顯示，SS/PAN NFM可重復使用12次，且吸附能力不下降。通過液相色譜-串聯質譜分析，該類化合物的檢出限為0.006~0.24 μg/kg，加標回收率為87.2%~111%。

2 儀器分析檢測方法

2.1 氣相色譜-質譜法

氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）適用于熱穩(wěn)定性好、分子量小、易揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質的痕量分析。Karamolegou等[32]采用GC-MS法測定動物源性食品中的7種β2-受體激動劑殘留，樣品前處理后經衍生化后上機檢測，7種目標物的回收率為83.1%~118.0%。郭蓉等[33]建立熟肉及其制品中12種β2-受體激動劑含量的GC-MS/MS測定方法，12種分析物在低、中、高濃度下，平均回收率為65.5%~110.7%。曹忠波等[34]利用GC-MS/MS對熟肉制品中多種β2-受體激動劑殘留進行檢測。樣品經酶解后經MCX柱凈化，利用同位素內標法定量。結果表明，在0.05~1 mg/L內，9種分析物的線性關系良好，相關系數r＞0.999 4，回收率為80.3%~109.5%，SRSD均小于10%。雖然氣相色譜-質譜法具有高靈敏度和高選擇性等特點，但β2-受體激動劑類藥物屬于高沸點、難揮發(fā)的極性化合物，需要經衍生化后上機檢測。

2.2 高效液相色譜法

與氣相色譜相比，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是以液體代替氣體作為流動相的色譜分析方法，具有分離效果好、分析速度快等優(yōu)點。張楠等[35]通過2-（4-磺酰氯基苯基）苯并咪唑來增強熒光強度，建立動物源性食品中7種β2-受體激動劑的高靈敏HPLC檢測方法。結果顯示，7種待測物在1.0~100.0 ng/mL范圍內呈良好的線性關系（r＞0.999），回收率為80.2%~110.7%。Yuan等[36]利用石墨烯/碳納米管作為移液尖端固相萃取的吸附劑，結合HPLC技術，實現豬肉中的克倫特羅的快速凈化和測定?？藗愄亓_在3個加標水平下的回收率為92.2%~96.2%，SRSD≤9.2%。由于HPLC的檢出限較高，無法滿足痕量物質殘留測定，逐漸被高靈敏度的液相色譜-質譜聯用法替代。

2.3 液相色譜-串聯質譜法

液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）將HPLC的強分離能力和質譜的高靈敏度相結合，可以測定強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物[37]。關于動物源性食品中β2-受體激動劑殘留檢測的GB/T 22286—2008《動物源食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》和SN/T 1924—2011《進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特步他林殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》等均選用LC-MS/MS進行分析[38]。Liu等[39]采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定牛奶中16種β2-受體激動劑和9種合成類固醇，樣品經QuEChERS方法提取、凈化，最終各物質在其0.1~200 μg/L范圍內線性關系良好，加標回收率為63%~126%。史娜等[40]通過超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中35種β2-受體激動劑和11種β-受體阻斷劑殘留情況。該方法用MIP柱代替常用的MCX柱，并采用內標法校正，確保了檢測的準確性，平均回收率為62.31%~110.52%。張海超等[41]建立動物源性食品中46種食源性興奮劑同時測定的分析方法。樣品選用乙腈萃取、乙腈飽和正己烷除去脂質，QuEChERS法凈化。結果表明：46種食源性興奮劑的回收率為76.0%~111.9%，SRSD為2.3%~12.4%，檢出限為0.05~1.0 μg/kg。

2.4 酶聯免疫法

酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），也稱為酶免疫測定，是一種基于抗原抗體和酶催化反應特點而建立的方法，通常用于鑒定液體樣品中抗體或抗原的存在和濃度[42]。王瑞等[43]為了研究動物體內β2-受體激動劑類藥物殘留情況，以沙丁胺醇多克隆抗體為基礎，建立豬尿中12種β2-受體激動劑殘留檢測的方法。結果表明，各物質在0.1~20 μg/L范圍內線性關系良好，回收率為68.2%~114.2%。Wang等[44]基于克倫特羅單克隆抗體開發(fā)競爭抑制酶聯免疫吸附方法，以識別23種β2-受體激動劑和類似物。雖然該方法具有成本低、操作簡便、特異性強等優(yōu)點，但其存在重復性差、易出現假陽性等問題，不能滿足精準定量的要求。

2.5 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS），是指當待測分子位于貴金屬表面（如金和銀）上時，在電磁場和化學增強的作用下，造成拉曼散射信號的顯著增強的現象[45-46]。肖雄楓等[47]以金溶膠作為表面增強活性基底，運用快速溶劑提取技術減少基質干擾，對生鮮豬肉中的4種β2-受體激動劑進行檢測。在3個不同加標水平下，回收率為85.2%~101.5%，SRSD為2.3%~7.9%。Duan等[48]以Fe3O4@Au@Ag納米顆粒為底物，利用適體結合方法靈敏檢測豬肉中的鹽酸克倫特羅。研究通過Fe3O4@Au@AgNPs和AuNPs之間的耦合效應，使得SERS的強度和定量分析的靈敏度顯著提高，SLOD為0.003 ng/mL，回收率為90.7%~108.0%。

2.6 電化學法

由于β2-受體激動劑結構中包含電活性基團，因此可通過電化學法實現快速高效的檢測。其具有快速簡便、成本低、不需要技術人員等優(yōu)點，可被當作β2-受體激動劑殘留檢測的補充分析手段[49]。Ma等[50]制備由多孔硼摻雜金剛石（pBDD）和金納米顆粒（Au-NPs）組成的Au-pBDD電極，并將其應用于測定豬肉樣品中的克倫特羅，方法回收率為96.7%~106.0%，SRSD＜3.8%。

3 結語與展望

動物源性食品中有害物質殘留的準確、高通量檢測是食品行業(yè)亟待解決的問題之一。β2-受體激動劑雖然在我國已被禁用，但仍需防范非法添加問題。因此，開發(fā)更加準確、高效、重復性好的檢測方法十分必要。對于β2-受體激動劑的殘留檢測有待深入研究的開展。在樣品前處理技術方面，SPE、QuEChERS的應用較多；PRiME HLB和磁性固相萃取等作為新興技術，應用范圍在逐漸擴大。在檢測方法上，LCMS/MS依然是動物源性食品中β2-受體激動劑的殘留檢測的主要手段。隨著質譜技術的發(fā)展，近年來具有質量精度高、采集速率快等優(yōu)勢的Q-TOF/MS和Orbitrap MS多被應用于動物源性食品中獸藥殘留高通量檢測工作中。由于LC-MS/MS存在儀器昂貴、前處理時間較長和技術要求高等缺點，開發(fā)便捷、靈敏度高的ELISA和電化學法等檢測方法，有利于實現動物源性食品中β2-受體激動劑的快速現場篩查。加快β2-受體激動劑檢測方法的完善創(chuàng)新，可為提升動物源性食品的風險監(jiān)測能力和相關國家標準的完善、發(fā)展提供有力支持，從而更好地保證運動員“舌尖上的安全”和人民身體健康。