2-磺酸-4-硫代丁酸類抗體-藥物偶聯(lián)物連接子的合成

楊麗萍 曹小冬

摘 要： 設(shè)計并合成成本低廉但功能相近的Sulfo-SPDB類似物2-磺酸基-4-（三甲苯基硫代）丁酸，以降低抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugate， ADC）親水性連接子2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）丁酸（Sulfo-SPDB）的制備成本。以4-巰基丁酸為起始原料，通過取代、磺?；?、還原、巰基保護等四個步驟制得Sulfo-SPDB類似物。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，目標產(chǎn)物的總產(chǎn)率可達85%；采用質(zhì)譜、紫外、¹H-NMR對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征和分析，結(jié)果顯示產(chǎn)物確為目標產(chǎn)物。該合成路線具有原料易得、反應(yīng)條件溫和、操作簡便、能耗低等特點，對Sulfo-SPDB衍生物的合成具有借鑒意義。

關(guān)鍵詞：抗體-藥物偶聯(lián)物；連接子；2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）丁酸；2-磺酸基-4-（三甲苯基硫代）丁酸；巰基保護；磺?；?/p>

中圖分類號：O622.6

文獻標志碼：A

文章編號：1673-3851 （2023） 05-0374-05

引文格式：楊麗萍，曹小冬. 2-磺酸-4-硫代丁酸類抗體-藥物偶聯(lián)物連接子的合成［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（3）：374-378.

Reference Format： YANG? Liping，CAO? Xiaodong. Synthesis of 2-sulfonic acid-4-thiobutanoic acid antibody-drug conjugate linker［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（3）：374-378.

Synthesis of 2-sulfonic acid-4-thiobutanoic acid antibody-drug conjugate linker

YANG Liping， CAO Xiaodong

（School of Science， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： In order to reduce the preparation cost of antibody-drug conjugate （ADC） hydrophilic linker 2-sulfo-4-（2-pyridinyldithio）-butanoic acid （Sulfo-SPDB）， we designed and synthesized the Sulfo-SPDB analogue 2-sulfo-4-trytylthio-butanoic acid with the characteristics of lower cost and similar function. The synthesis started from 4-mercaptobutyric acid， and went through substitution， sulfonylation， reduction， and then protection reaction. By optimizing the reaction conditions， the Sulfo-SPDB analogue was prepared in four steps with a total yield of 85%. The structure of the product was characterized by mass spectrometry， ultraviolet and¹H-NMR. The results show that the product is the target product. The synthetic route has the characteristics of few synthetic steps， mild reaction conditions， simple operation， and low energy consumption， and has reference significance for the synthesis of Sulfo-SPDB derivatives.

Key words：ADC; linker; 2-sulfo-4-（2-pyridinyldithio）-butanoic acid; 2-sulfo-4-trytylthio-butanoic acid; mercaptyl protection; sulfonylation

0 引 言

親水性連接子在抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody drug conjugate， ADC）的合成過程中起著至關(guān)重要的作用。2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）丁酸（Sulfo-SPDB）是一種可降解的ADC親水性連接子，由單克隆抗體與細胞毒性藥物共價連接形成，具穩(wěn)定性和選擇性高、表達精準等特點^［1-3］。隨著ADC開發(fā)技術(shù)的迭代和臨床試驗的積累，偶聯(lián)連接子已被公認是整個ADC設(shè)計的關(guān)鍵要素^［4-6］。此外，已有研究表明，在連接子中引入極性親水性基團，是改善某些ADC藥物代謝動力學的有效方法^［7］。例如，以葉酸受體α（Folate receptor-α， FR-α）為靶點的ADC藥物索星-米妥昔單抗，其連接子Sulfo-SPDB中含有極性親水性磺酸基，因而可克服早期研發(fā)藥物在血漿循環(huán)中不夠穩(wěn)定的缺點^［8］。2022年11月1日，索星-米妥昔單抗作為全球首個針對FR-α陽性卵巢癌的ADC藥物，獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準，并成功上市。

2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸（3）是合成Sulfo-SPDB類似物的關(guān)鍵中間體，其合成收率和成本會直接影響偶聯(lián)藥物的成本和收率。目前大多數(shù)文獻報道的Sulfo-SPDB中間體2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸（3）均以2，4-二溴丁酸甲酯為起始原料，經(jīng)過兩次硫代乙酸酯取代引入巰基，經(jīng)過氧化氫和乙酸氧化巰基得到磺酸基，再在強堿條件下水解便可得到羧酸^［9］。然而，此合成路線經(jīng)過5步反應(yīng)，存在很多不利因素：首先，二溴原料價格昂貴，取代溴需在-20 ℃低溫下反應(yīng)，且容易產(chǎn)生副產(chǎn)物，導(dǎo)致后處理及純化困難；其次，引入磺酸基是通過巰基氧化實現(xiàn)，反應(yīng)用到雙氧水和乙酸，且需要過夜，存在較大的安全隱患；最后，水解反應(yīng)的產(chǎn)物極性大、親水性強，難以純化?？傊摵铣煞椒ú僮鲝?fù)雜，反應(yīng)時間長，成本高，并且存在安全隱患，在放大反應(yīng)中應(yīng)用受限。通過重新設(shè)計Sulfo-SPDB的關(guān)鍵中間體2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸的合成路線，優(yōu)化新路線的反應(yīng)條件和工藝，并進一步衍生2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸，以制備巰基用三苯甲基保護的Sulfo-SPDB類似物，有望拓展Sulfo-SPDB衍生物在ADC藥物研發(fā)中的應(yīng)用。

本文以4-巰基丁酸為起始原料，通過取代、磺酰化、還原、巰基保護制得Sulfo-SPDB類似物。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，得到最佳合成路線，并利用質(zhì)譜、紫外和1H-NMR對所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征。該合成路線操作簡便、耗時短、成本低，易于放大生產(chǎn)。

1 實驗部分

1.1 實驗主要材料

N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、二氯乙烷（DCE）、甲醇（MeOH）和四氫呋喃（THF）均為分析純，購于上海炎澤化工有限公司；N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）和氯磺酸均為分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2，2′-二硫二吡啶和4-巰基丁酸均為分析純，購于上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；三甲基磷（PMe₃）和三苯基氯甲烷（TrtCl） 均為分析純，購于上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 實驗主要儀器

AVANCE AV400 MHz型核磁共振波譜儀；Micromass Quattro Micro型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀；Biotage Isolera Prime型快速制備液相色譜；UV-2600型紫外分光光度儀。

1.3 Sulfo-SPDB類似物的合成

Sulfo-SPDB類似物的合成路線如圖1所示。以4-巰基丁酸為起始原料，通過取代、磺?；频?-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸，隨后經(jīng)還原、巰基保護制得Sulfo-SPDB類似物2-磺酸基-4-（三甲苯基硫代）丁酸。

1.3.1 中間體（2）的合成

在100 mL的圓底燒瓶中加入11.0 g （50 mmol）2，2′-二硫二吡啶，加入MeOH （30 mL） 使2，2′-二硫二吡啶溶解，攪拌0.5 h后，加入5.0 g （41 mmol）4-巰基丁酸，將混合物在室溫下攪拌12 h^［10］。隨后將反應(yīng)溶液通過反向硅膠色譜柱純化（CH₃CN/H₂O=2/3），凍干，得到7.7 g白色固體產(chǎn)物，經(jīng)計算產(chǎn)率為82%。LCMS ［M+H］⁺=230.0。

1.3.2 中間體（3）的合成

將2.7 g （11 mmol）4-（2-吡啶二硫代）-丁酸溶于DCE（40 mL）中，加入6.8 g （58 mmol） ClSO₃H和3.0 g （23 mmol）DIPEA，接著將混合物在75 ℃攪拌40 min，隨后將混合物濃縮并倒入冰水中，并用Na₂CO₃將混合物pH調(diào)至7。將濃縮后的混合物通過反向硅膠色譜柱純化 （MeOH/5‰AcOH=1/3），得到3.4 g黃色油狀產(chǎn)物，經(jīng)計算產(chǎn)率為88％。LCMS ［M-H］+=308.0。

¹H NMR （400 MHz， D₂O） δ 8.36 （d， J=5.1 Hz， 1H）， 7.87 （q， J=8.1 Hz， 2H）， 7.32 （t， J=6.0 Hz， 1H）， 3.77 （dt， J=24.5， 12.2 Hz， 1H）， 3.70-3.55 （m， 3H）， 3.11 （q， J 7.4 Hz， 3H）， 2.83 （dd， J=28.4， 13.8， 7.0 Hz， 2H）， 2.30-2.15 （m， 2H）， 1.25 （d， J=6.6 Hz， 14H）.

1.3.3 中間體（4）的合成

將2.0 g （6.45 mmol） 2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸溶于THF（20 mL）中，接著加入PMe₃（19 mL），并將混合物在室溫下攪拌30 min直到溶液變得清澈，然后經(jīng)濃縮溶液得到油狀物^［11］，隨后加入乙醚（50 mL）并洗滌3次，倒出乙醚層，烘干，便可得到1.2 g黃色油狀產(chǎn)物，經(jīng)計算產(chǎn)率為92%。LCMS ［M-H］⁺ = 199.0。

1.3.4 Sulfo-SPDB類似物（5）的合成

將4-巰基-2-磺基丁酸粗品溶于DMF中，并且加入至2.9 g （10 mmol） TrtCl中，然后將混合物在室溫下攪拌1.5 h。接著將反應(yīng)液濃縮，通過反相硅膠色譜柱純化（CH₃CN/H₂O=2/3），得到2.4 g黃色固體產(chǎn)物，經(jīng)計算產(chǎn)率為85％。LCMS ［M-H］⁺=441.0。

¹H NMR （400 MHz， DMSO） δ 7.34 （s， 1H）， 7.33 （d， J=1.4 Hz， 4H）， 7.31 （s， 2H）， 7.29 （d， J=1.8 Hz， 5H）， 7.27 （t， J=1.5 Hz， 2H）， 7.26-7.22 （m， 4H）， 3.65-3.54 （m， 1H）， 3.29 （dd， J=9.7， 4.4 Hz， 1H）， 3.14 （dd， J=7.4， 4.3 Hz， 1H）， 2.12-1.99 （m， 3H）.

1.4 測試與表征

1.4.1 質(zhì)譜法

用乙腈作為流動相，采用Micromass Quattro Micro 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀測試Sulfo-SPDB類似物合成過程中中間體（2）、（3）、（4）以及目標產(chǎn)物Sulfo-SPDB類似物（5）的質(zhì)譜。

制樣方法：取待測樣品5 mg于離心管中，加入乙腈1 mL，超聲助溶，用濾頭過濾制得濾液樣品，待測試。

1.4.2 薄層層析法（TLC）

以硅膠 GF254與羧甲基纖維素鈉制成薄層板。待分析樣品溶解于乙腈或甲醇后用毛細管點樣。以石油醚和乙酸乙酯配置一定比例的展開劑，并上行展開。在254 nm紫外燈下找出展層板上的吸收斑點。

2 結(jié)果與討論

2.1 中間體（2）、（3）、（4）和Sulfo-SPDB類似物（5）的質(zhì)譜分析

對中間體（2）、（3）、（4）和Sulfo-SPDB類似物（5）進行質(zhì)譜分析測試，結(jié)果如圖2所示。圖2（a）展示了中間體（2）在質(zhì)譜ESI正模式下測試所得的譜圖；由圖2（a）可知，在質(zhì)譜正離子模式下中間體（2）出現(xiàn)較強的［M+H］+分子離子峰m/z 230.3，與中間體（2）的理論分子量229.02相吻合。圖2（b）展示了中間體（3）在質(zhì)譜ESI負模式下測試所得的譜圖；由圖2（b）可知，在質(zhì)譜負離子模式下中間體（3）出現(xiàn)較強的［M-H］+分子離子峰m/z 308.1，與中間體（3）的理論分子量309.37相吻合。圖2（c）展示了中間體（4）在質(zhì)譜ESI負模式下測試所得的譜圖；由圖2（c）可知，在質(zhì)譜負離子模式下中間體（4）出現(xiàn)較強的［M-H］+分子離子峰m/z 199.0，與中間體（4）的理論分子量199.98相吻合。圖2（d）是Sulfo-SPDB類似物（5）在質(zhì)譜ESI負模式下測試所得的譜圖；由圖2（d）可知，在質(zhì)譜負離子模式下出現(xiàn)較強的［M-H］+分子離子峰m/z 441.1，與Sulfo-SPDB類似物（5）的理論分子量442.09相吻合。

2.2 Sulfo-SPDB類似物的合成過程分析

本文直接嘗試在氯磺酸中進行中間體（3）的合成。待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)冰水淬滅，采用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)合成物的pH，直至pH為5。然而，在濃縮后用反相柱層析純化得到產(chǎn)物的收率僅為10%?？紤]到直接在氯磺酸中進行磺?；磻?yīng)，反應(yīng)過于劇烈，反應(yīng)溫度不易控制，會引起很多副反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)收率和純化效率都很低，因此本文優(yōu)化后的反應(yīng)是在二氯乙烷溶劑、氯磺酸和DIPEA混合物中進行。這樣大大降低了反應(yīng)液的強酸性以及氯磺酸濃度，使得磺?；磻?yīng)更溫和、更干凈。反應(yīng)結(jié)束后冰水淬滅，用碳酸鈉調(diào)節(jié)合成物的pH為5，采用同樣的柱層析純化處理得到產(chǎn)物，收率為77.7%。

針對第三步將中間體（3）的二硫鍵還原為巰基，本文嘗試用還原劑三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP·HCl）、二硫蘇糖醇（DTT）、PMe₃以及β-巰基乙醇（β-ME）還原二硫鍵，結(jié)果如表1所示。采用這幾種還原劑都得到了較好的收率（80%～95%）。相比之下，β-ME還原性較差，揮發(fā)性強，且有惡臭味，穩(wěn)定性也不佳，在空氣中會被氧化為二硫化物，影響其還原效果；DTT的還原性強于β-ME，并且刺激性和毒性也低于β-ME，但其穩(wěn)定性也較差，在空氣中易被氧化；TCEP·HCl和PMe₃的還原性和穩(wěn)定性均強于DTT和β-ME，TCEP·HCl后處理需要將大量水相凍干，耗時耗能，不利于放大生產(chǎn)；PMe₃作還原劑，可在有機溶劑中進行，反應(yīng)時間短，后處理只需乙醚打漿后過濾即可。綜合考慮，本文選擇PMe₃為還原劑。

為了在新型連接子中繼續(xù)使用化合物（4），需要對化合物（4）中的巰基進行保護，保留羧基官能團用于后續(xù)反應(yīng)。以DMF作溶劑、DIPEA作堿的條件下，用TrtCl保護巰基^［12］，反應(yīng)經(jīng)后處理純化后，收率只有10%。通過¹H-NMR和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)中間體（3）中還含有DIPEA。這可能是化合物（4）中的強酸基團磺酸基跟DIPEA形成了鹽，影響了巰基反應(yīng)，且通過后處理、純化過程難以去除。本文嘗試在無堿的條件下，DMF溶劑中只加入TrtCl進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液直接濃縮，通過反相柱層析純化得到產(chǎn)品Sulfo-SPDB類似物（5），產(chǎn)率提高至85%。

3 結(jié) 論

本文以4-巰基丁酸為起始原料，通過取代、磺酰化制得Sulfo-SPDB連接子的關(guān)鍵中間體2-磺酸基-4-（2-吡啶二硫代）-丁酸，然后經(jīng)還原和巰基保護后制得Sulfo-SPDB類似物，對合成工藝進行優(yōu)化，并對Sulfo-SPDB類似物進行表征，得出以下主要結(jié)論：

a）合成了Sulfo-SPDB類似物，通過¹H-NMR和質(zhì)譜證明了目標產(chǎn)物的成功合成，總產(chǎn)率為85%，在水中有較好的溶解度，且具有很好的穩(wěn)定性。

b）確定合成工藝中磺?；臈l件為二氯乙烷作溶劑、DIPEA作堿；還原二硫鍵的條件為以THF作溶劑、PMe₃為還原劑；保護巰基的條件為以DMF作溶劑、TrtCl作保護基。

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（責任編輯：劉國金）