三種浙產(chǎn)鐵皮石斛多糖的結(jié)構(gòu)及免疫功效探究

李鏡銳,陶文揚(yáng),楊 穎,周萬(wàn)怡,陸勝民,*,王陽(yáng)光,*

(1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山 316022; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥,享有中國(guó)“九大仙草之首”的美譽(yù)[1],傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載其具有延緩衰老、滋陰美容等生理功能。鐵皮石斛含有多糖、多酚、類黃酮、生物堿等多種生物活性成分[2-4],其中多糖占比高達(dá)20%～40%(m/m干重),是鐵皮石斛中含量最高、最受關(guān)注的生理活性成分[5],具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗炎及保護(hù)胃腸道等多種生理功效[5-9],其免疫調(diào)節(jié)因作用顯著且藥效溫和,從而備受關(guān)注。

雁蕩山地區(qū)雨量充沛,氣候溫暖濕潤(rùn),得天獨(dú)厚的生態(tài)環(huán)境特別適合鐵皮石斛生長(zhǎng),是鐵皮石斛的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū),浙江省的首家鐵皮石斛藥食同源試點(diǎn)加工企業(yè)即落戶雁蕩山地區(qū),加工需求量很大,由此也帶動(dòng)了當(dāng)?shù)氐姆N植業(yè)的發(fā)展,發(fā)展前景十分廣闊[10]。但目前本地的石斛品種混雜栽培,既有當(dāng)?shù)匾吧Z化種,也有其他地區(qū)的馴化種。前期研究發(fā)現(xiàn),石斛多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性會(huì)因其品種和產(chǎn)地不同而異[11-12]。浙江雁蕩山地區(qū)不同附生樹(shù)種鐵皮石斛多糖含量存在顯著差異[13],但對(duì)于主栽品種并無(wú)梳理,不同品種之間多糖結(jié)構(gòu)和生理活性的差異從未有過(guò)報(bào)道,給其精準(zhǔn)應(yīng)用帶來(lái)很大困擾。

為了比較研究雁蕩山基地不同種鐵皮石斛多糖(Dendrobiumofficinalepolysaccharide,DOP)的結(jié)構(gòu)和免疫功能,本文選擇雁蕩山地區(qū)的3個(gè)主栽品種,對(duì)其多糖進(jìn)行提取純化,通過(guò)HPLC、硫酸苯酚法、HPGPC、FT-IR等方法對(duì)其多糖樣品進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)表征,并通過(guò)RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型初步評(píng)估3種多糖的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性,為功能評(píng)價(jià)及精準(zhǔn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雁斛1號(hào)石斛莖、雁斛3號(hào)石斛莖、圣蘭8號(hào)石斛莖采自浙江省溫州市雁蕩山;透析袋、脂多糖(LPS)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;FBS(胎牛血清)購(gòu)自浙江天杭生物科技技術(shù)有限公司;青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司;CCK-8溶液、NO試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;中性紅購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞株購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

SHJ-2AB多孔恒溫磁力攪拌水浴鍋購(gòu)自常州金壇良友儀器有限公司;SCIENTZ-1ON冷凍干燥機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司;VERTEX70紅外光譜儀購(gòu)自德國(guó)布魯克分析儀器公司;Herocell 180 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自海潤(rùn)度生物科技有限公司;FTMX4R倒置顯微鏡購(gòu)自深圳市方特科技有限公司;ELX800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIOTEK公司。

1.2 方法

1.2.1 DOP的提取純化

目前多糖主要的提取分離手段是通過(guò)水提醇沉法獲得水溶性多糖[14]。取鐵皮石斛鮮莖500 g,加入7.5 L水勻漿,于70 ℃恒溫水浴鍋中振蕩提取40 min后經(jīng)粗紗布過(guò)濾,4 000 r·min-1離心10 min收集上清液后加入30 L乙醇,4 ℃靜置醇沉12 h后經(jīng)2 000目濾布過(guò)濾得到沉淀。將沉淀復(fù)溶于蒸餾水,用8 000～14 000 u透析袋透析72 h,期間每4 h換水。透析結(jié)束后將樣品真空冷凍干燥72 h。

1.2.2 DOP單糖組成測(cè)定

分別取1 mL 1 mg·mL-1的巖藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、半乳糖醛酸(GalA)和葡萄糖醛酸(GlcA)標(biāo)準(zhǔn)品置入安瓿瓶,獲得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取5 mg DOP樣品置于安瓿瓶,加入1 mL 2 mol·L-1鹽酸甲醇溶液,于80 ℃下水解10 h后,氮吹至干。再加入1 mL 2 mol·L-1三氟乙酸(TFA)完全酸水解,于121 ℃水解2 h后,氮吹除去TFA。

向裝有DOP樣品的安瓿瓶中加入1 mL 3 mol·L-1NaOH和1 mL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-甲醇溶液,混合均勻。從瓶中吸取200 μL混合液,于70 ℃水浴0.5 h。水浴結(jié)束后,加入200 μL 0.3 mol·L-1HCl溶液混勻,再加入1.4 mL CH3Cl充分振蕩反應(yīng)。反應(yīng)液去除多余的PMP-甲醇試劑和CH3Cl溶液后,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,用于高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.2.3 DOP總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖樣品中的總糖含量[15]。稱取Glc和Man 0.050 g,定容至250 mL,得到濃度為0.2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、2、4、6、8、10 mL,定容至10 mL。

分別量取1 mL 0.5 mg·mL-1待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸,振蕩搖勻。沸水浴10 min后在冰水中冷卻10 min,在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量吸光度。石斛多糖多為葡甘聚糖,結(jié)合其葡甘比,可通過(guò)以下方程計(jì)算DOP樣品中Glc和Man含量。

iCG+nCM=iCG′=nCM′。

其中CG表示每g DOP樣品中含有的Glc量;CM表示每g DOP樣品中含有的Man量;CG和CM的比值為DOP樣品中Glc和Man的摩爾比;CG′表示每g DOP樣品通過(guò)Glc標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的百分含量;CM′表示每g DOP樣品通過(guò)Man標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的百分含量;i表示每g DOP樣品中Glc可反應(yīng)的吸光度值;n表示每g DOP樣品中Man可反應(yīng)的吸光度值。

1.2.4 DOP分子量測(cè)定

分別取10 mg重均分子量(Mw)為180、2 700、9 750、36 800、135 350的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶解于2 mL去離子水,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用于高效凝膠滲透色譜測(cè)定分子量,進(jìn)樣量為5 μL。高效凝膠滲透色譜檢測(cè)條件:采用Waters1525 HPGPC;色譜柱使用UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm內(nèi)徑,2根色譜柱串聯(lián));檢測(cè)器為2414示差折光檢測(cè)器;柱溫為45 ℃。流動(dòng)相為0.1 mol·L-1NaNO3;流速為0.9 mL·min-1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間及分子量繪制葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到擬合方程。

稱取一定量DOP樣品溶解于0.1 mol·L-1NaNO3中,配置成濃度為5 mg·mL-1的樣品溶液,經(jīng)0.45 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè),進(jìn)樣量為5 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中的分子量。

1.2.5 DOP的紅外光譜分析

分別取1.0 mg DOP樣品與150.0 mg KBr混合,研磨并壓片,壓片應(yīng)透明無(wú)顆粒。在4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描FT-IR吸收。

1.2.6 RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)

RAW 264.7細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)。小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中,在含有5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(細(xì)胞貼壁面積占培養(yǎng)瓶底部的80%～90%)傳代。細(xì)胞傳代三代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

DOP處理后的細(xì)胞增殖率測(cè)定。于96孔板中每孔接種100 μL濃度為3×105mL-1的RAW 264.7細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后去除上清液,加入含有不同濃度DOP(0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,450 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞增殖率為實(shí)驗(yàn)組在450 nm的吸光度與對(duì)照組在450 nm的吸光度的比值。

DOP處理后細(xì)胞NO產(chǎn)生量測(cè)定。于96孔板中每孔接種100 μL濃度為3×105mL-1的RAW 264.7細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后去除上清液,加入含有不同濃度DOP(0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)置1 μg·mL-1的LPS陽(yáng)性對(duì)照組,每組設(shè)置8個(gè)平行。處理24 h后,每孔吸取50 μL上層培養(yǎng)液于新的96孔板,參照NO試劑盒說(shuō)明書測(cè)定NO生成量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件分析,使用單向方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù),試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖組成

單糖是決定多糖結(jié)構(gòu)和特性的基本單位[16]。多糖經(jīng)酸水解后可利用HPLC研究其單糖組成。結(jié)果如圖1所示。通過(guò)與相同條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較來(lái)確定峰的歸屬。結(jié)果表明,DOP1、DOP2和DOP3均由Ara、Gal、Glc和Man這4種單糖組成,但3種石斛多糖的單糖比例不同。選定Gal的物質(zhì)的量為1,計(jì)算得到Ara、Glc和Man的摩爾比。DOP1中Ara、Gal、Glc、Man的比例為0.73∶1∶179∶274;DOP2中為0.56∶1∶332∶292;DOP3中為0.44∶1∶121∶190。3種多糖均為雜多糖,且均為葡甘聚糖,其中Glc和Man質(zhì)量分?jǐn)?shù)均占多糖的99.9%左右,本結(jié)果與之前的報(bào)道一致[17]。

1,Ara;2,Gal;3,Glc;4,Man.圖1 三種石斛莖多糖DOP1、DOP2和DOP3的單糖組成Fig.1 The monosaccharide composition of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1, DOP2 and DOP3

2.2 總糖含量

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖樣品中的總糖含量,根據(jù)2.1節(jié)結(jié)果可知,DOP樣品中Glc和Man質(zhì)量分?jǐn)?shù)均占多糖的99.9%左右,故Ara和Gal的比例可以忽略不計(jì)。根據(jù)DOP樣品中Glc和Man的摩爾比,計(jì)算DOP樣品中甘露糖和葡萄糖的含量,結(jié)果如表1所示。測(cè)得3種DOP的純度較高,尤其是DOP2的總糖含量達(dá)到94.78%。

表1 DOP總糖含量Table 1 Total sugar content in DOP

2.3 分子量

分子量可以反映多糖的分子鏈長(zhǎng)度,是多糖生物活性的主要影響因素之一,多糖的生物活性通常隨著分子量的變化而變化[16]。DOP1、DOP2和DOP3的高效凝膠滲透色譜圖分析結(jié)果如圖2所示,根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,利用分析軟件求得多糖分子量。

圖2 三種石斛莖多糖DOP1、DOP2和DOP3高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 High performance gel permeation chromatogram of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1, DOP2 and DOP3

在HPGPC色譜圖中,3種多糖均含3個(gè)峰。DOP1的3個(gè)峰在色譜中的保留時(shí)間分別為13.52 min、17.40 min和19.20 min;DOP2的保留時(shí)間分別為13.60 min、17.25 min和19.19 min;DOP3的保留時(shí)間分別為13.93 min、17.55 min和19.23 min。DOP1由3個(gè)峰組成,峰分子量(Mp)分別為1.85×106u、1.27×104u和1.28×103u;DOP2的Mp分別為1.95×106u、1.95×104u和1.40×103u;DOP3的Mp分別為1.70×106u、1.30×104u和1.33×103u。3種多糖均包含一個(gè)低分子量組分,可能由于黏度過(guò)大,各個(gè)糖鏈相互糾纏,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的透析仍然無(wú)法將其去除?，F(xiàn)有的研究報(bào)道,不同來(lái)源、不同提取分離純化方法得到的鐵皮石斛分子量差異很大[14],本實(shí)驗(yàn)獲得的多糖分子量符合現(xiàn)有報(bào)道范圍。3種多糖的分子量差異較小,DOP2分子量略高于另外兩種多糖。

2.4 紅外光譜

圖3 三種石斛莖多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c)

2.5 RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)

2.5.1 DOP處理后的細(xì)胞增殖率測(cè)定

作為機(jī)體免疫的第一道防線,巨噬細(xì)胞是多糖的關(guān)鍵靶細(xì)胞,可以作為抗原呈遞細(xì)胞,與T淋巴細(xì)胞相互作用,調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[23]。多糖的免疫調(diào)節(jié)作用始于巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的活化[24]。這個(gè)過(guò)程不僅可以促進(jìn)各種細(xì)胞因子的釋放,還可以刺激免疫細(xì)胞的增殖[25]。DOP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的作用結(jié)果如圖4所示,RAW 264.7細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力均大于90%,表明鐵皮石斛多糖對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用。此外,DOP1和DOP2在640、1 280 μg·mL-1濃度條件下能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖;DOP3在320、640、1 280 μg·mL-1濃度條件下都對(duì)細(xì)胞有增殖作用,且濃度為640、1 280 μg·mL-1時(shí)增值效果顯著(P<0.000 1)。結(jié)果表明,3種DOP都參與了RAW 264.7細(xì)胞的活化,而DOP3在較低濃度時(shí)即對(duì)RAW 264.7細(xì)胞發(fā)揮增殖作用,其增殖效果在3種DOP中最好。

****,P<0.000 1。圖4 三種石斛莖多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖作用的影響Fig.4 Effects of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c) on proliferations rate in RAW 264.7 cell

2.5.2 DOP處理后的細(xì)胞NO產(chǎn)生量測(cè)定

NO是活性氮的中間產(chǎn)物,是具有氧化性質(zhì)的自由基[26],能有效地起到免疫調(diào)節(jié)劑的作用[27]。免疫刺激性多糖與細(xì)胞受體相互作用,在細(xì)胞中觸發(fā)不同的信號(hào)響應(yīng),反過(guò)來(lái)又促進(jìn)下游效應(yīng)分子(NO)的分泌,增強(qiáng)宿主的免疫功能[28]。結(jié)果如圖5所示,DOP1對(duì)于RAW 264.7細(xì)胞的免疫應(yīng)答無(wú)影響,1 600 μg·mL-1DOP2能夠促進(jìn)NO釋放,800 μg·mL-1DOP3能夠促進(jìn)NO釋放,且在1 600 μg·mL-1濃度時(shí)產(chǎn)生顯著差異(P<0.05)。3種DOP的免疫調(diào)節(jié)功能差別較大,DOP3最強(qiáng),DOP2效果不顯著,而DOP1沒(méi)有效果。該結(jié)果與上述2.5.1節(jié)巨噬細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

*,P<0.05。圖5 三種石斛莖多糖DOP1 (a)、DOP2 (b)和DOP3 (c)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響Fig.5 Effect of three polysaccharides from Dendrobium stem including DOP1 (a), DOP2 (b) and DOP3 (c) on NO release from RAW 264.7 cells

綜上所述,DOP1、DOP2和DOP3可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖以及巨噬細(xì)胞NO的釋放,并且DOP3在高濃度下效果顯著,表明DOP3的免疫調(diào)節(jié)活性優(yōu)于其他兩種DOP。導(dǎo)致3種DOP免疫調(diào)節(jié)活性不同的原因可能是其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的差異,包括分子量和單糖組成比例。即不同種鐵皮石斛多糖在結(jié)構(gòu)性質(zhì)上的明顯不同,導(dǎo)致其生理活性產(chǎn)生顯著差異,這與他人的研究結(jié)果一致[7]。此外,已有研究報(bào)道50 μg·mL-1的鐵皮石斛水溶性多糖(DOPW)就具有顯著的免疫效果[1],而本實(shí)驗(yàn)的3種多糖需要在較高濃度條件下展現(xiàn)出細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性,其可能原因DOP的品種、提取過(guò)程、純度以及作用機(jī)理等差異會(huì)影響鐵皮石斛多糖的細(xì)胞免疫功效。另一方面,可能不同來(lái)源、結(jié)構(gòu)的多糖,其免疫調(diào)節(jié)的作用途徑不同[11],我們將進(jìn)一步深入研究其他免疫調(diào)節(jié)途徑,系統(tǒng)闡述浙產(chǎn)石斛多糖的功效及構(gòu)效機(jī)理。

3 結(jié)論

本文提取了雁蕩山基地的3個(gè)不同品種鐵皮石斛的莖多糖,初步比較了3種石斛多糖的結(jié)構(gòu)差異,并初步評(píng)價(jià)了其免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果表明,DOP2的3個(gè)組分峰分子量均高于另外兩種多糖,且甘露糖含量少于葡萄糖含量,其余兩種多糖甘露糖占比更高。紅外光譜表明這3種多糖均是以β構(gòu)型為主的吡喃雜多糖。在3個(gè)不同種鐵皮石斛的免疫活性比較中,3種多糖在高劑量下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞都具有一定的增殖作用,其中圣蘭8號(hào)鐵皮石斛莖多糖的增殖效果最好。且圣蘭8號(hào)鐵皮石斛莖多糖樣品對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放也有顯著作用。3種石斛多糖在分子量、單糖組成和單糖連接方式上差異不大,但其免疫活性不同。其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果可為鐵皮石斛生理活性研究提供參考,為石斛多糖的精準(zhǔn)開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。