江浙地區(qū)菱品種遺傳多樣性的SLAF-seq分析

袁 曄,劉 睿,王凌云,沈 盟,葉雪蓮,權(quán)新華,王瑞森,姚祥坦,*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 嘉興 314016; 2.浙江大學(xué) 蔬菜研究所,浙江 杭州 310058; 3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(浙江省農(nóng)業(yè)機(jī)械研究院) 浙江省特色水生蔬菜育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 金華 321000)

菱屬(TrapaL.)為菱科(Trapaceae)一年生浮葉水生草本植物,生長(zhǎng)于淺水湖泊、河灣、池塘和水田中,在我國(guó)分布廣泛,尤其是在黑龍江流域和長(zhǎng)江中下游地區(qū)種類十分豐富[1-2]。菱屬植物是重要的水生蔬菜種類,其成熟果實(shí)淀粉含量高達(dá)80%,被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)列為重要的水生糧食作物,在中國(guó)和印度多年來(lái)被廣泛種植[3-4]。栽培菱品種具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn),在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)尤其是江蘇、浙江一帶作為特色水生蔬菜廣泛栽培[5]。

江浙地區(qū)菱的地方傳統(tǒng)品種資源豐富[6-7],依果實(shí)形態(tài)分為五角菱、兩角菱和四角菱3種類型,依果實(shí)顏色分為青菱和紅菱[8],其中無(wú)角菱品種少,南湖菱即是其中一個(gè)比較特殊的品種[9]。近年來(lái),受種植效益等因素影響,菱的種植面積急速下降,種質(zhì)資源面臨丟失風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),品種間混雜現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重,例如,在南湖菱群體中,出現(xiàn)了有角的個(gè)體,地方品種的特色和優(yōu)勢(shì)難以維持,因此亟須開(kāi)展種質(zhì)資源的保護(hù),并加以合理利用。種質(zhì)資源鑒定是保護(hù)和利用的前提,但目前對(duì)菱的相關(guān)研究甚少。丁炳楊等[10]曾根據(jù)菱屬植物花粉形態(tài),將浙江省內(nèi)的9個(gè)種菱屬植物分為野菱類、烏菱類和細(xì)果野菱類,并提出野菱類是較烏菱類原始的一個(gè)類群,南湖菱在菱屬植物中處在較高的進(jìn)化水平,并認(rèn)為南湖菱與四角菱親緣關(guān)系更近。胡仁勇等[11]用31個(gè)性狀將國(guó)內(nèi)菱屬37個(gè)居群分為3大類,其中9個(gè)栽培居群分在一類中,說(shuō)明栽培菱品種之間的親緣關(guān)系相對(duì)比較近;并將9個(gè)栽培品種分為3組,分別是四角菱一類,二角的烏菱和二角菱一類,無(wú)角的南湖菱單獨(dú)一類,指出南湖菱與四角菱的關(guān)系更近。最近,丁炳揚(yáng)等[12]把中國(guó)菱屬分為細(xì)果野菱和歐菱2個(gè)種,并將歐菱劃分為6個(gè)變種,將二角菱、烏菱統(tǒng)稱為菱變種,將四角菱和南湖菱統(tǒng)稱為四角菱變種。但以上分類,均是基于形態(tài)學(xué)的鑒定和分類結(jié)果,分子生物學(xué)的相關(guān)證據(jù)不足。

董晶萊等[13]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)江浙不同產(chǎn)地的5份菱屬植物進(jìn)行了分子鑒定,發(fā)現(xiàn)菱栽培種間具有較高的穩(wěn)定性。保曙琳等[14]利用rDNA ITS片段分析技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江中下游地區(qū)10個(gè)菱屬居群進(jìn)行DNA分子鑒別,表明菱屬各居群間rDNA ITS的差異百分率較小,其親緣關(guān)系較近,雖然根據(jù)ITS序列的特征可以較好地鑒定野生菱和栽培菱,但在栽培菱品種之間的親緣關(guān)系及遺傳距離仍未涉及。由于缺乏充分的基因組相關(guān)信息,目前對(duì)于菱屬植物的遺傳多樣性尤其是栽培菱品種之間的遺傳多樣性的認(rèn)識(shí)還是十分有限的,從而也限制了生產(chǎn)商對(duì)菱種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)相關(guān)理論和技術(shù)明確栽培菱品種之間的親緣關(guān)系,確定角的個(gè)數(shù)等形態(tài)學(xué)性狀在親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的決定及菱的分類中的貢獻(xiàn),對(duì)于菱種質(zhì)資源的保護(hù)、種質(zhì)創(chuàng)新利用等均具有十分重要的意義。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,它是可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種,由于其具有密度高、分布廣、富有代表性,易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等特點(diǎn),在遺傳學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用。SNP分子標(biāo)記技術(shù),也以其高通量的特征,在分子遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定、重要性狀相關(guān)基因的定位和分子標(biāo)記輔助選擇等領(lǐng)域發(fā)揮出巨大的優(yōu)勢(shì)。其中,簡(jiǎn)化基因組測(cè)序SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)是特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序技術(shù)的簡(jiǎn)稱,該技術(shù)降低了基因組的復(fù)雜度,并且不依賴參考基因組序列,成本低,成為SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)的首選[15]。通過(guò)SLAF-seq,在玉米[16]、沙冬青[17]、葡萄[18]、蘋(píng)果屬植物[19]、山西省地方梨的品種[20],以及高粱[21]等植物中,均已開(kāi)發(fā)獲得大量特異性SNP位點(diǎn),并以SNP進(jìn)行遺傳分析,獲得了種質(zhì)資源遺傳多樣性的相關(guān)信息,明確了不同種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系。

本研究通過(guò)SLAF-seq技術(shù),對(duì)江浙地區(qū)17份主要的菱栽培品種以及1份野生菱材料進(jìn)行高通量測(cè)序,鑒定SNP,并利用獲得的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行群體多樣性分析,包括進(jìn)化樹(shù)分析、群體結(jié)構(gòu)分析及群體特異SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā),并與其主要植物學(xué)性狀分類進(jìn)行相互驗(yàn)證,以期明確不同類型菱栽培品種之間的親緣關(guān)系,為菱種質(zhì)資源的鑒定保護(hù)和菱新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

18份菱材料均為嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院收集保存(表1)。于2020年上半年采用育苗移栽的方式種植,于3月初每個(gè)材料挑選10個(gè)健康菱種,進(jìn)行點(diǎn)播,株距20 cm,每個(gè)材料播種一行。將面積為48 m2的水泥池用漁網(wǎng)分隔成4個(gè)面積12 m2的小區(qū),于5月初每個(gè)材料選2株,分單株各種植2個(gè)小區(qū)。于8月下旬,菱結(jié)果期進(jìn)行取樣。

表1 供試菱資源及原產(chǎn)地明細(xì)Table 1 Resources and origin of Trapa L. in this study

1.2 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

菱生物學(xué)性狀以菱初花期進(jìn)行調(diào)查,菱果性狀于盛產(chǎn)期進(jìn)行調(diào)查。葉片于初花隨機(jī)取15個(gè)菱盤,于每個(gè)菱盤中選最大葉進(jìn)行測(cè)量,菱果數(shù)據(jù)為菱盛產(chǎn)期每種隨機(jī)取15個(gè)菱果進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行分析。

1.3 基因組DNA的制備

采用CTAB法提取菱樣品的DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,Nanodrop檢測(cè)DNA濃度,樣品純度D260/D280分布在1.8～2.0,所提取的樣品DNA滿足建庫(kù)要求。

1.4 Illumina HiSeq測(cè)序及產(chǎn)出數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析

1.4.1 設(shè)計(jì)酶切方案

根據(jù)菱基因組大小及 GC 含量等信息,使用Hae Ⅲ+HinC Ⅱ酶切,酶切片段長(zhǎng)度在364～464的序列定義為SLAF標(biāo)簽。

1.4.2 酶切片段測(cè)序分析

對(duì)得到的每一個(gè)樣本基因組的酶切片段(SLAF標(biāo)簽)進(jìn)行3簽端加A處理、連接Dual-index測(cè)序接頭[22]、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段,文庫(kù)質(zhì)檢合格后用Illumina平臺(tái)IlluminaCasava 1.8進(jìn)行測(cè)序。

1.5 SLAF 標(biāo)簽和SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

利用Dual-index對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別,得到各個(gè)樣品的reads。過(guò)濾測(cè)序reads的接頭后,進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量的評(píng)估。測(cè)序產(chǎn)生的reads來(lái)源于同一限制性內(nèi)切酶對(duì)不同樣品作用產(chǎn)生的長(zhǎng)度相同的酶切片段,根據(jù)序列相似性將各樣品的reads進(jìn)行聚類,聚類到一起的reads來(lái)源于一個(gè)SLAF片段(SLAF標(biāo)簽)。同一SLAF標(biāo)簽在不同樣品間的序列相似度遠(yuǎn)高于不同SLAF標(biāo)簽間的相似度;一個(gè)SLAF標(biāo)簽在不同樣品間序列有差異(即有多態(tài)性),即可定義為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。

SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是以每個(gè)SLAF標(biāo)簽中深度最高的序列類型作為參考序列,利用BWA[23]將測(cè)序reads比對(duì)到參考基因組上,并使用GATK[24]和Samtools[25]兩種方法開(kāi)發(fā)SNP,以兩種方法得到的SNP標(biāo)記交集作為最終可靠的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。

1.6 群體遺傳分析

針對(duì)篩選的SNP對(duì)測(cè)序樣本主要進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及群體遺傳多樣性分析,使用MEGA X[26]和Admixture軟件[27]軟件,對(duì)群體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和遺傳結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估

本實(shí)驗(yàn)中HaeⅢ+HinC Ⅱ?qū)α饣蚪M的酶切效率為90.59%。為保證分析質(zhì)量,采用讀長(zhǎng)126×2作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評(píng)估和分析數(shù)據(jù)。共獲得菱reads數(shù)54.34 Mb,測(cè)序平均Q30為91.68%,平均GC含量為41.32%。所測(cè)序列的Q30數(shù)據(jù)較高,說(shuō)明堿基出錯(cuò)率很低,測(cè)序結(jié)果可靠(表2)。

表2 菱各材料測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Reads statistics of Trapa L.

2.2 SLAF標(biāo)簽與SNP標(biāo)記的鑒定

本研究在18個(gè)菱材料中共開(kāi)發(fā)獲得445 594個(gè)SLAF標(biāo)簽,標(biāo)簽的平均測(cè)序深度為14.10×,鑒定到多態(tài)性SLAF標(biāo)簽有95 931個(gè)(表3)。以每個(gè)SLAF標(biāo)簽中深度最高的序列類型作為參考序列進(jìn)行SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā),得到的SNP標(biāo)記交集作為最終可靠的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集,共獲得269 338個(gè)SNP標(biāo)記(表4)。

表3 菱各材料的SLAF標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)Table 3 SLAF label statistics of Trapa L.

表4 菱各材料的SNP信息統(tǒng)計(jì)Table 4 SNP statistics of Trapa L.

2.3 遺傳進(jìn)化分析

基于過(guò)濾后得到的269 338個(gè)SNP,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)18份菱完成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、群體結(jié)構(gòu),從基因組水平揭示不同個(gè)體菱的遺傳分化關(guān)系。

2.3.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出(圖1),18種菱可以劃分為3個(gè)大類群:其中邵伯菱、南湖紅菱、無(wú)角青菱、南湖菱和南湖菱提純?cè)诖箢惾?;環(huán)菱1、環(huán)菱2、環(huán)菱3、野菱、蘇州青菱、兩角紅菱、兩角青菱、水果紅菱在大類群2;金華青菱、紹興水紅菱2、駝背白菱、嘉興水紅菱、紹興水紅菱1 在大類群3;同一大類群的菱品種之間有更近的親緣關(guān)系。在大類群1中,南湖紅菱、無(wú)角青菱在遺傳發(fā)育樹(shù)上的距離更短,親緣關(guān)系更近;南湖菱和南湖菱提純親緣關(guān)系更近。在大類群2中,環(huán)菱1、環(huán)菱3和環(huán)菱2的親緣關(guān)系更近,環(huán)菱2與環(huán)菱3的親緣關(guān)系又近于環(huán)菱1;野菱、蘇州青菱、兩角紅菱、兩角青菱、水果紅菱的親緣關(guān)系更近。在大類群3中,紹興水紅菱2 與駝背白菱的親緣關(guān)系更近,嘉興水紅菱和紹興水紅菱1 的親緣關(guān)系更近。以蘇州青菱與野菱的親緣關(guān)系最近,而南湖菱、南湖紅菱、無(wú)角青菱、水紅菱、駝背白菱等與野菱親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。因此,認(rèn)為蘇州青菱在進(jìn)化上比較原始,而南湖菱等無(wú)角菱、水紅菱等大果類型的四角菱進(jìn)化程度更高。

圖1 十八個(gè)菱材料系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Evolutionary tree of 18 Trapa L. samples

2.3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于篩選的有效SNP,通過(guò)Admixture軟件[27],分析樣品的群體結(jié)構(gòu),分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～9,進(jìn)行聚類。并對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行交叉驗(yàn)證,根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率的谷值(最低值)確定最優(yōu)分群數(shù)。K值為1～9的聚類情況及各個(gè)K值對(duì)應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率見(jiàn)圖2。由圖2-A可知,K=7時(shí),交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小,因此將18個(gè)樣品分為7組。根據(jù)K=7時(shí)的結(jié)構(gòu)圖,同一類群用同種顏色表示,同一樣本若具有不同顏色,則歸到占比顏色最多的一組,詳細(xì)見(jiàn)圖2-B。

A, Admixture各個(gè)K值交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率;B, Admixture各個(gè)K值對(duì)應(yīng)的樣品聚類結(jié)果。紅框中為K=7的聚類結(jié)果圖。A, Admixture of each K value cross validation error rate; B, Admixture of each K value corresponding sample clustering results. The red box is the clustering result graph with K=7.圖2 十八個(gè)菱材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Genetic structure analysis of Trapa L. samples

交叉遺傳錯(cuò)誤率最低值出現(xiàn)在K=7時(shí),因此可以將18份材料按照表5分為Q1～Q7一共7個(gè)組,理論上同一組的樣本有共同祖先。Q1:蘇州青菱、兩角紅菱;Q2:南湖菱、南湖菱提純、邵伯菱;Q3:兩角青菱、水果紅菱;Q4:金華青菱、紹興水紅菱1、嘉興水紅菱、駝背白菱、紹興水紅菱2 ;Q5:環(huán)菱1、環(huán)菱2、環(huán)菱3;Q6:無(wú)角青菱、南湖紅菱;Q7:野菱。

表5 菱材料遺傳結(jié)構(gòu)分群表Table 5 The table of the groups of Trapa L. samples classified by genetic structure

2.3.3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果顯示,次要等位基因頻率為0.354 9,期望等位基因數(shù)為1.805 9,與觀測(cè)等位基因數(shù)(2.000 0)較為接近,表明等位基因在群體當(dāng)中分布均勻;多樣性指數(shù)為0.455,多態(tài)標(biāo)記數(shù)為6 368,觀測(cè)等位基因數(shù)為2;期望雜合度(0.441 5)高于觀測(cè)雜合度(0.134 5),說(shuō)明雜合個(gè)體較少,群體雜合度較低;多態(tài)性信息含量近0.342 7,香農(nóng)維納指數(shù)小于3,僅有0.632 4,說(shuō)明本試驗(yàn)中的18個(gè)菱材料,其群體遺傳變異不豐富。

3 討論

水生蔬菜是江浙一帶重要的特色經(jīng)濟(jì)作物,素有“水八仙”之稱,而菱是其中最有特色的一個(gè)種類,在江浙一帶有著廣泛的分布和栽培。作為重要的蔬菜作物,菱在各個(gè)地方通過(guò)長(zhǎng)期的演化形成了一些極具地方特色的栽培品種[6-7],比如嘉興的南湖菱[9]、揚(yáng)州的邵伯菱、太湖的水紅菱、紹興的駝背白菱,形成了當(dāng)?shù)刂奶厣r(nóng)產(chǎn)品。但近年來(lái),菱栽培面積特別是傳統(tǒng)外河湖蕩種植面積大幅度下降,品種混雜退化嚴(yán)重,例如,南湖菱這種無(wú)角的、特異性狀明顯的菱品種,出現(xiàn)了不同程度的長(zhǎng)角現(xiàn)象[28],另有一些地方品種如駝背白菱存在著消失的風(fēng)險(xiǎn),地方特色菱種質(zhì)資源的保護(hù)已刻不容緩。種質(zhì)資源保護(hù)的前提是對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定,目前菱不同品種之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及遺傳多樣性仍不明確,并且可能存在品種間的混雜現(xiàn)象。本研究通過(guò)SLAF-seq技術(shù)對(duì)江浙地區(qū)主要的菱栽培品種進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序,基于過(guò)濾后得到的269 338個(gè) SNP,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)18份菱完成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、群體結(jié)構(gòu)分析,從基因組水平首次揭示了不同菱的遺傳關(guān)系,為了解菱的栽培演化提供了參考,也為菱品種的甄別及種質(zhì)資源的鑒定保護(hù)提供了依據(jù)。

基于利用SLAF-seq技術(shù)獲得的SNP進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)及遺傳結(jié)構(gòu)分析來(lái)看,本試驗(yàn)中的18個(gè)菱品種,其群體遺傳變異不豐富,說(shuō)明本試驗(yàn)用樣品雖然來(lái)源不同,但其之間親緣關(guān)系較近,這與保曙琳等[14]的研究結(jié)果一致。本研究可以較好地將大部分無(wú)角菱、四角菱、二角菱區(qū)分開(kāi)來(lái),也能將菱栽培種與野菱區(qū)分開(kāi)來(lái),但遺傳進(jìn)化樹(shù)中將四個(gè)無(wú)角菱類型品種與四角的邵伯菱分在一起,而將野菱與四角的蘇州青菱與幾個(gè)二角菱品種和烏菱分在一類,這與胡仁勇等[11]研究中9個(gè)栽培居群以菱果角的個(gè)數(shù)分成3大類有明顯不同,這說(shuō)明單純的以形態(tài)學(xué)性狀為依據(jù)進(jìn)行菱栽培種的分類和親緣關(guān)系認(rèn)定存在著一定的局限性。同時(shí)遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示,南湖菱以及以南湖菱為親本選育的無(wú)角類型品種與四角的邵伯菱親緣關(guān)系最近,進(jìn)一步佐證了丁炳揚(yáng)等[10,12]、胡仁勇等[11]提出的南湖菱與四角菱關(guān)系更加密切的觀點(diǎn)。

綜上,本論文從基因組的角度揭示了菱主要栽培品種之間的親緣關(guān)系均較近,品種間親緣關(guān)系與菱果的形狀、顏色等果實(shí)性狀無(wú)顯著相關(guān),南湖菱等無(wú)角菱品種與四角菱栽培種之間的親緣關(guān)系更加密切。同時(shí),從基因組信息角度驗(yàn)證了菱栽培種的演化可能是從四角野生菱資源同時(shí)向二角類型和大果型四角菱演化的過(guò)程,而無(wú)角菱栽培種是直接由四角菱演化而來(lái)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究菱主要栽培品種的演化過(guò)程以及開(kāi)展地方特色菱種質(zhì)資源保護(hù)利用提供了理論依據(jù)。