蘿卜硫素激活Nrf2通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化

張 群,許璐璐,閆冰迪

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130041)

肺纖維化是一種常見的間質(zhì)性肺疾病,臨床癥狀表現(xiàn)為干咳和呼吸困難,伴有限制性通氣功能異常和彌散功能降低,其發(fā)病率逐年上升,且預(yù)后不佳。其病理早期表現(xiàn)為肺泡細(xì)胞損傷和凋亡,最終出現(xiàn)細(xì)胞外成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積。研究表明,失控的氧化應(yīng)激、氧化/抗氧化平衡失調(diào)是誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生的分子學(xué)基礎(chǔ)[1];內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)通過促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡、改變上皮細(xì)胞表型、促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化等方式也參與纖維化的發(fā)生及發(fā)展[2]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜受破壞,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子失衡,進(jìn)而引起ERS;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊過程中蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原素、谷胱甘肽、NADPH氧化酶4等信號介導(dǎo)產(chǎn)生額外的ROS,加重氧化應(yīng)激,形成級聯(lián)信號放大的惡性循環(huán),加重細(xì)胞損傷[3-4]。蘿卜硫素(SFN)是一種食源性的Nrf2信號通路激活劑,在體內(nèi)外試驗中均能活化Nrf2通路,上調(diào)下游多個抗氧化基因表達(dá),發(fā)揮間接抗氧化及細(xì)胞保護(hù)作用。有研究提示Nrf2通過抑制CHOP減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。為此,我們采用氣管內(nèi)滴注博來霉素復(fù)制肺纖維化模型,造模后皮下注射蘿卜硫素,觀察這一過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及Nrf2通路的表達(dá)情況,探究SFN是否通過影響Nrf2通路對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也有一定作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料SPF級雌性C57BL/6小鼠,體重20～30 g,購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心并于SPF級屏障設(shè)施飼養(yǎng)。鹽酸博來霉素(日本化藥株式會社);蘿卜硫素(美國Sigma-Aldich 公司);抗Nrf2抗體、抗HO-1抗體、抗NQO1抗體、抗caspase3 抗體、抗GRP78抗體及抗CHOP抗體(美國Abcam 公司);丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成研究所。

1.2 實驗方法將40只小鼠隨機(jī)分為空白對照組(Ctrl組)、蘿卜硫素組(SFN組)、博來霉素模型組(BLM組)、蘿卜硫素干預(yù)組(BLM/SFN組),每組10只。BLM組及BLM/SFN組小鼠麻醉后給予氣管內(nèi)緩慢滴注BLM溶液(5 mg/kg)建造模型,Ctrl組及SFN組氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。造模后SFN組及BLM/SFN組每天給予蘿卜硫素(0.5 mg/kg)皮下注射。Ctrl組及BLM組給予含1%DMSO相同劑量的生理鹽水皮下注射。

1.3 樣本采集建立模型后第7、28天,小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉,加高濃度二氧化碳窒息處死。打開胸腔,取出右側(cè)肺組織,各葉分裝后凍存于液氮中,用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測。左肺灌注后浸入4%多聚甲醛溶液中,24 h后脫水、包埋。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1組織病理學(xué) 病理切片進(jìn)行HE及Masson染色,采用Szapiel法[6]對肺組織肺泡炎及肺纖維化情況進(jìn)行評分;進(jìn)行TUNEL染色觀察肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況。

1.4.2肺組織MDA及SOD含量測定 肺組織勻漿液離心后取上清,后續(xù)按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3Western blot法檢測目的蛋白 將肺組織去除雜質(zhì)剪碎后加入蛋白裂解液(含PMSF),于冰上迅速勻碎。4℃條件下裂解充分,離心后留取上清液用于目的蛋白檢測。SDS-PAGE電泳80 V至蛋白Marker出現(xiàn)分離,120V恒壓至溴酚藍(lán)跑到玻璃板底端為止。將蛋白電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉2 h,洗膜3次 后加入一抗4℃孵育過夜,再次洗膜后加入二抗孵育。用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng),以β-actin為內(nèi)參,對結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件,通過 One-way ANOVA 方差分析方法,以P<0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN對BLM所致肺纖維化病理改變的影響

肺組織HE及Masson染色結(jié)果顯示(圖1.A),Ctrl組及SFN組肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔干凈,間隔無增寬,間隔內(nèi)無明顯膠原纖維;BLM組表現(xiàn)出明顯的肺泡炎改變,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔內(nèi)和肺泡間隔中可見較多炎細(xì)胞浸潤,肺間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在膠原纖維;給予SFN干預(yù)后,肺泡炎癥改變明顯減輕,肺泡間隔增寬,有少量膠原纖維沉積。采用Szapiel評分方法對各組標(biāo)本HE染色和Masson染色結(jié)果進(jìn)行評分(圖1.B),BLM組肺泡炎及纖維化評分明顯高于Ctrl組及SFN組(P<0.05),BLM/SFN組評分低于BLM組(P<0.05)。

圖1 蘿卜硫素減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺泡炎及肺纖維化

2.2 SFN對BLM所致肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

7天時肺組織TUNEL染色結(jié)果(圖2.A)提示Ctrl組及SFN組未見明顯凋亡;BLM組小鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加,BLM/SFN組與BLM組相比凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)。利用Western Blot檢測7天時肺組織中凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)情況(圖2.B)與Ctrl組比較,BLM組中肺組織Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào),給予蘿卜硫素后Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平下調(diào),有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western Blot結(jié)果與TUNEL結(jié)果呈同向性變化。

圖2 蘿卜硫素抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡

2.3 SFN對肺組織MDA和SOD含量的影響

7天和28天各組小鼠肺組織中MDA及SOD含量的測定結(jié)果(圖2.C),結(jié)果顯示與Ctrl組相比,BLM組小鼠肺臟MDA含量明顯增加,SOD含量明顯降低(P<0.05),給予蘿卜硫素處理后肺組織MDA含量減少,SOD含量增高(P<0.05)。

2.4 SFN對肺組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)的影響

利用Western Blot檢測7天和28天時肺組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)情況(圖3),與Ctrl組比較,BLM/SFN組與BLM組兩組Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯升高(圖3.A),并且BLM/SFN組Nrf2蛋白表達(dá)情況較BLM組進(jìn)一步升高(P<0.05)。BLM組小鼠肺組織7、28天時HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均低于Ctrl組(圖3.B),給予SFN處理后,HO-1、NQO1表達(dá)水平均較BLM組升高(P<0.05)。

圖3 蘿卜硫素對博來霉素模型中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)情況的影響

2.5 SFN對肺組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78及CHOP表達(dá)的影響

利用Western Blot檢測7天和28天時肺組織中GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平(圖4),BLM組小鼠肺組織GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平與Ctrl組比較明顯增加(P<0.05),給予SFN干預(yù)后GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖4 蘿卜硫素對博來霉素模型中GRP78及CHOP表達(dá)情況的影響

3 討論

肺纖維化是一種導(dǎo)致呼吸功能嚴(yán)重障礙的疾病。適度的ERS能夠發(fā)揮恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)定,維持細(xì)胞正常功能的作用;但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多時,通過CHOP途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與纖維化[2];ERS主要調(diào)節(jié)因子GRP78功能缺失條件下會減少肺泡巨噬細(xì)胞凋亡,減輕膠原沉積,對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化具有保護(hù)作用[7]。誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)的表面活性蛋白C突變的轉(zhuǎn)基因小鼠在經(jīng)氣管內(nèi)博來霉素處理后,與對照組相比發(fā)生了肺泡上皮細(xì)胞凋亡和肺中成纖維細(xì)胞數(shù)量增加,并在衣霉素誘導(dǎo)下進(jìn)一步加重肺纖維化[8]。本研究結(jié)果表明,BLM肺纖維化小鼠模型中GRP78及CHOP表達(dá)量均較對照組升高,且模型組TUNEL染色結(jié)果提示細(xì)胞凋亡的數(shù)量較正常對照組明顯增多,凋亡通路相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)情況也較對照組明顯升高,提示肺纖維化模型肺組織中發(fā)生ERS,上調(diào)凋亡蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

在肺纖維化早期肺泡炎階段,肺泡局部產(chǎn)生大量活性氧,通過線粒體等凋亡途徑促使肺泡上皮細(xì)Western blot方法檢測7和28天時肺組織內(nèi)GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表示為:均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6/group)。#表示為與對照組比較P<0.05,*表示為與博來霉素組比較P<0.05。

胞凋亡并通過TGF-β1誘導(dǎo)纖維化[1]。近年研究證實氧化應(yīng)激還引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)非折疊蛋白及錯誤折疊蛋白聚集,誘發(fā)ERS。本研究中模型組小鼠肺組織氧化物質(zhì)MDA含量明顯增多,而抗氧化物SOD水平受到抑制,伴有ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào),提示ERS可能與氧化/抗氧化失衡有關(guān)。而給予干預(yù)劑SFN后,肺組織內(nèi)氧化物質(zhì)MDA含量減少、抗氧化物SOD增多,并伴有ERS相關(guān)蛋白CHOP及GRP78表達(dá)下調(diào)。

Nrf2通路是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)答的重要因素,蘿卜硫素能夠激活Nrf2,增加其下游抗氧化基因的表達(dá),在心、腦、腎等多種疾病中起保護(hù)作用[9]。有研究表明Nrf2可直接被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子PERK磷酸化作用而直接激活,轉(zhuǎn)錄進(jìn)入細(xì)胞核啟動Nrf2信號通路,參與抗氧化[10];高表達(dá)的Nrf2也被證明可以通過阻止激活轉(zhuǎn)錄因子4與CHOP啟動子結(jié)合,抑制CHOP參與誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5],由此推測Nrf2可能是關(guān)聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及氧化應(yīng)激的樞紐。前期我們研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以通過激活Nrf2及增加其下游抗氧化蛋白的表達(dá),發(fā)揮平衡氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用,參與肺臟保護(hù)[11]。我們推測SFN可能也可以通過活化Nrf2參與調(diào)節(jié)ERS,減輕博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡及后續(xù)肺纖維化。

為此,我們應(yīng)用氣管內(nèi)滴入博來霉素復(fù)制肺纖維化模型,干預(yù)組給予皮下注射SFN以活化Nrf2,發(fā)現(xiàn)SFN干預(yù)組小鼠肺泡炎及肺纖維化程度、肺泡細(xì)胞凋亡程度較BLM組輕。SFN干預(yù)后小鼠模型內(nèi)氧化物質(zhì)MDA含量減少,而抗氧化物SOD水平提高,氧化/抗氧化失衡得到改善。并且應(yīng)用Western blot法檢測小鼠肺組織中Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1表達(dá)情況,結(jié)果提示模型組上述抗氧化蛋白表達(dá)升高,給予SFN干預(yù)后Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步增多,且給予SFN干預(yù)后CHOP及GRP78表達(dá)較BLM組減少,提示SFN具有減輕ERS的作用,可能參與ERS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細(xì)胞凋亡。

綜上,蘿卜硫素對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化具有保護(hù)作用,機(jī)制可能不僅與活化Nrf2通路,增加抗氧化酶活性抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān);推測其發(fā)揮肺纖維化保護(hù)作用還可能是通過降低CHOP及GRP78表達(dá),維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的作用得以實現(xiàn)。這為蘿卜硫素發(fā)揮肺保護(hù)作用提供進(jìn)一步的證據(jù),為其成為有潛力的治療藥物奠定基礎(chǔ)。