西瓜甜瓜品種（系）苗期枯萎病、蔓枯病抗性快速聯(lián)合鑒定技術(shù)

姚協(xié)豐 徐建 朱凌麗 婁麗娜 劉廣 張曼 侯茜 徐錦華 羊杏平

摘 要：西甜瓜枯萎病、蔓枯病是設(shè)施生產(chǎn)中的防治難點(diǎn)，培育及推廣優(yōu)質(zhì)復(fù)合抗病新品種是生產(chǎn)上控制病害最為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的手段。開(kāi)展復(fù)合抗性育種研究，品種資源的復(fù)合抗病性鑒定是首要工作。但是目前尚無(wú)兩種病害抗性鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，為了提高品種資源復(fù)合抗性鑒定的效率、準(zhǔn)確性、規(guī)范性，對(duì)枯萎病、蔓枯病病原菌的來(lái)源與擴(kuò)繁，苗期活體接種和離體葉片接種結(jié)合方法，聯(lián)合抗病鑒定評(píng)價(jià)指標(biāo)等進(jìn)行技術(shù)總結(jié)，以規(guī)范西甜瓜品種（系）苗期抗枯萎病、蔓枯病的快速聯(lián)合鑒定技術(shù)方案。本研究方案克服了“以往單一接種效率低、周期長(zhǎng)、耗費(fèi)多，避免了傳統(tǒng)活體先后接種方法病害發(fā)病交互影響，病情指數(shù)偏高，易產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果”等缺點(diǎn)，為大批量初步篩選西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病復(fù)合抗性品種資源提供可參考的技術(shù)方法。為推動(dòng)西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育種和種業(yè)提升提供技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：西瓜；甜瓜；枯萎??；蔓枯??；聯(lián)合抗性鑒定

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目[BE2021364]；江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目[JBGS（2021）075，JBGS（2021）069]；國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-26-08）。

作者簡(jiǎn)介：

姚協(xié)豐（1982-），男，江蘇蘇州人，博士，副研究員，主要從事西瓜甜瓜抗病育種與技術(shù)推廣。? E-mail：yaoxiefeng@jaas.ac.cn

*通信作者：徐錦華，男，研究員，主要從事西瓜甜瓜育種。

E-mail：jinhuaxu@jaas.ac.cn。

西瓜、甜瓜是重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)蔬果生產(chǎn)、消費(fèi)中占據(jù)了十分重要地位，在調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和促進(jìn)農(nóng)民增收致富等方面發(fā)揮顯著作用[1-2]。隨著西甜瓜設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大及種植年限不斷增長(zhǎng)，西甜瓜病害發(fā)生情況日益嚴(yán)重[2]。尖孢鐮刀菌（Fusarium? oxysporum）侵染引起的枯萎病和亞隔孢殼屬（Stagonosporopsis）危害引起的蔓枯病是西甜瓜生產(chǎn)上兩種主要病害[3-7]。目前設(shè)施栽培常年連作伴隨病菌量加大、高溫高濕等農(nóng)業(yè)生態(tài)條件惡化，導(dǎo)致病害高發(fā)、重發(fā)，生產(chǎn)上植株死亡率可達(dá) 30%～40%，嚴(yán)重可達(dá)80%以上[4，8-9]，已成為制約西甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。

生產(chǎn)上發(fā)生西甜瓜枯萎病、蔓枯病后，仍以化學(xué)藥劑防治為主，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，使得西甜瓜枯萎病、蔓枯病等防治越發(fā)成為生產(chǎn)上的難點(diǎn)[4，10]。培育及推廣優(yōu)質(zhì)復(fù)合抗病西甜瓜新品種是控制枯萎病、蔓枯病最為環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效的辦法[5，11，12]。然而開(kāi)展復(fù)合抗性育種研究，品種資源對(duì)枯萎病和蔓枯病的復(fù)合抗病性鑒定是首要工作。抗病性鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)，而符合生產(chǎn)實(shí)際的抗病性鑒定技術(shù)方法又是抗病性鑒定的關(guān)鍵，制定出準(zhǔn)確、快捷的復(fù)合鑒定技術(shù)，可提高抗病育種的準(zhǔn)確性，加速抗病育種進(jìn)程[13]。抗性品種與抗性鑒定方法結(jié)合，促進(jìn)西甜瓜抗性品種的推廣與應(yīng)用。

目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)上尚無(wú)發(fā)布實(shí)施的關(guān)于西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病單獨(dú)或者兩種病害聯(lián)合抗性鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可參考，只有一些國(guó)內(nèi)外抗性鑒定方法的文獻(xiàn)報(bào)道，但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)西甜瓜枯萎病、蔓枯病的抗性鑒定方法多采用分株單一接種法，比如枯萎病苗期浸根接種、灌根接種、葉子刺傷接種[12，14-17]，以及通過(guò)苗期蔓枯病孢子懸浮液的噴霧接種、離體接種等[13，18]。分株單一接種法效率低、耗費(fèi)種子等試驗(yàn)材料多，且不同批次試驗(yàn)不穩(wěn)定。也有少量報(bào)道枯萎病、蔓枯病復(fù)合接種，即都以活體先后接種枯萎病和蔓枯病菌[12，19]，然而目前的復(fù)合接種方法同時(shí)活體接種兩種病原菌，往往會(huì)造成病害發(fā)病交互影響，病情指數(shù)偏高，容易產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果，而且由于枯萎病菌對(duì)感病植株是致命的，接種后基本全部死亡，無(wú)法同時(shí)進(jìn)行其它多抗性苗期鑒定試驗(yàn)，對(duì)感枯萎病材料如需鑒定蔓枯病等其它抗病性，后期仍需要進(jìn)行不同批次的單獨(dú)接種試驗(yàn)，導(dǎo)致傳統(tǒng)枯萎病和蔓枯病的雙重抗性鑒定不在同株同時(shí)鑒定的，影響結(jié)果一致性，拉長(zhǎng)鑒定周期。因此為更加簡(jiǎn)便、高效鑒定西瓜甜瓜品種（系）對(duì)枯萎病、蔓枯病抗性，針對(duì)當(dāng)前單一接種為主的技術(shù)不足，亟需制定適合大量快速抗源篩選，能夠避免不同病害發(fā)病交互影響病情觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，且鑒定結(jié)果更快速準(zhǔn)確的抗病性聯(lián)合鑒定技術(shù)規(guī)程。

本文建立了西甜瓜品種（系）枯萎病苗期活體和蔓枯病離體葉片聯(lián)合抗性接種鑒定技術(shù)方法，實(shí)現(xiàn)了同一植株同時(shí)鑒定枯萎病和蔓枯病兩種病害的抗性，縮短鑒定周期，避免病害交叉影響、提高鑒定穩(wěn)定性、節(jié)約試驗(yàn)材料等，適合大量快速抗源篩選。以期為廣大西甜瓜科研育種及品種試驗(yàn)推廣等單位和個(gè)人，提供可參考的快速聯(lián)合抗性鑒定技術(shù)規(guī)范。以推動(dòng)西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育種，保障西瓜甜瓜種業(yè)提升。

1 試驗(yàn)材料

1.1 鑒定品種（系）、對(duì)照品種選擇及育苗管理

1.1.1 鑒定品種（系）和對(duì)照品種：聯(lián)合抗性鑒定中除了所參鑒的西瓜、甜瓜品種（系），還可選一個(gè)感病對(duì)照和一個(gè)抗病對(duì)照。西瓜枯萎病抗病對(duì)照可采用高抗品種‘卡紅，感病對(duì)照可選用感病品種‘蘇蜜1號(hào)；甜瓜枯萎病抗病對(duì)照可選用‘長(zhǎng)香玉，感病對(duì)照可選‘蘇甜二號(hào)。西瓜蔓枯病抗病對(duì)照可采用材料‘PI189225，感病對(duì)照可選用感病品種‘蘇蜜1號(hào)；甜瓜蔓枯病抗病對(duì)照可選用抗病材料‘PI200819，感病對(duì)照可選‘蘇甜4號(hào)。

1.1.2 育苗管理：鑒定品種（系）和對(duì)照品種在播種前將供試種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡5min，流動(dòng)清水沖洗去除表面殘留消毒液，種子放在鋪有吸水紙培養(yǎng)皿中，置30℃～32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。待種子露白后，播于50孔穴盤(pán)（泥炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1混合基質(zhì)填裝）內(nèi)，每份材料種植25株，3次重復(fù)。育苗溫度保持在白天26±2℃，夜間16±2℃，待出苗長(zhǎng)至3～5片真葉時(shí)的植株作為備用。 活體接種枯萎病菌后的西瓜甜瓜植株，定植于裝有滅菌育苗基質(zhì)的直徑為10cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，置于26±2℃的溫室培養(yǎng)管理，待后續(xù)病情觀察。

1.2 病原菌來(lái)源及擴(kuò)繁

1.2.1 病原菌來(lái)源：尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyder? &? Hansen）為害的西瓜枯萎病以生理小種1為優(yōu)勢(shì)小種，為此宜選用1號(hào)生理小種Race1。甜瓜枯萎病菌株用尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.melonis（Leachet? currence）Snyder? et? Hansen）。蔓枯病菌株（Stagonosporopsis? citrulli.DBJSSY2[7]）采用從病田收集、分離，并經(jīng)致病性鑒定后所得的致病性強(qiáng)且穩(wěn)定的株系。

所有選用的病原菌系江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所分離、鑒定和保存的菌株。

1.2.2 病原菌孢子繁殖：枯萎病菌孢子懸浮液準(zhǔn)備：參考耿麗華等[15]的方法，取西瓜枯萎病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖 20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g，水1000mL），26±2℃培養(yǎng)5天，再將培養(yǎng)好的枯萎病菌絲塊接種于馬鈴薯培養(yǎng)液（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，水1000mL），26±2℃，150r/min培養(yǎng)5～7天，4層紗布過(guò)濾后，加無(wú)菌蒸餾水稀釋?zhuān)醚∏蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成濃度為5×105孢子/mL的孢子懸浮液備用。蔓枯病菌孢子懸浮液準(zhǔn)備：參考Li等[7]方法誘導(dǎo)蔓枯病菌產(chǎn)生分生孢子。取蔓枯病病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g，水1000mL），26±2℃培養(yǎng)5～7天。選取新鮮無(wú)傷口的黃瓜經(jīng)流動(dòng)水沖洗干凈后，75%酒精擦拭表面，晾干后，在黃瓜表面輕微削去小塊表皮，培養(yǎng)好的菌株用直徑0.7cm的滅菌打孔器打取菌絲塊，菌絲塊倒置于黃瓜傷口上，培養(yǎng)箱中26±2℃培養(yǎng)，5～7天后分生孢子產(chǎn)生，用刀片刮取，研磨，4層紗布過(guò)濾后，加無(wú)菌蒸餾水稀釋?zhuān)醚∏蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成5×105孢子/mL的孢子懸浮液備用。

1.3 離體葉片準(zhǔn)備

取直徑9cm的培養(yǎng)皿，底部鋪設(shè)用苯并咪唑植物保鮮水溶液（11.8mg/L）浸濕的濾紙，然后從之前準(zhǔn)備的未接種枯萎病的健康植株上每株取1～2片真葉，放置于濾紙上，以備蔓枯病菌接種用。

2 枯萎病苗期活體蔓枯病離體葉片聯(lián)合接種方法

枯萎病苗期活體接種：將前期在穴盤(pán)中長(zhǎng)至3～5片真葉的待用植株小心取出，根部用清水輕柔洗凈，吸水紙吸去多余滴水，然后在提前備好的枯萎病菌孢子懸浮液中浸5min，取出移栽于裝有滅菌基質(zhì)，直徑為10cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，置于26±2℃溫室培養(yǎng)，接種3天后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)病情。

蔓枯病離體葉片接種：將蔓枯菌孢子懸浮液（添加1% Tween? 80）均勻噴到準(zhǔn)備好的同批次同植株離體葉片上，每個(gè)葉片約噴霧500μL，然后把培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：溫度26±2℃，光照周期16h光照/8h黑暗，相對(duì)濕度約90%，1天后觀察病情并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

3 病害調(diào)查與結(jié)果評(píng)價(jià)

3.1 枯萎病調(diào)查分級(jí)評(píng)價(jià)

接種枯萎病菌孢子液后3d開(kāi)始記錄生長(zhǎng)及病情，植株按接種后癥狀與病情分為6個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)[20]：0級(jí)：無(wú)病癥；1級(jí)：午間子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫，夜間尚能恢復(fù)；2級(jí)：1個(gè)真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級(jí)：子葉及60%以上真葉萎蔫，影響生長(zhǎng)；4級(jí)：整株出現(xiàn)萎蔫，60%以上葉枯死，但是心葉仍存活；5級(jí)：整株嚴(yán)重萎蔫并枯死；其中，2級(jí)以下為抗病植株，3級(jí)以上為感病植株；根據(jù)公式（Ri（發(fā)病率）=100%×ni（發(fā)病植株數(shù)）/nt（總調(diào)查植株數(shù)）計(jì)算進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。

結(jié)果分四個(gè)抗性等級(jí)（詳見(jiàn)表1），在感病對(duì)照發(fā)病率達(dá)80%以上，判定為鑒定有效，對(duì)植株發(fā)病數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

3.2? 蔓枯病調(diào)查分級(jí)評(píng)價(jià)

參考張永兵等[18]優(yōu)化蔓枯病的調(diào)查分級(jí)，依據(jù)離體葉片上病斑的大小進(jìn)行分級(jí)，各病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：葉片沒(méi)有病斑；1級(jí)：葉片病斑面積≤25%；2級(jí)：25%<葉片病斑面積≤50%；3級(jí)：50%<葉片病斑面積≤75%；4級(jí)：75%<葉片病斑面積≤100%。蔓枯病接種3d后離體葉片開(kāi)始出現(xiàn)病斑癥狀，在感病對(duì)照病情指數(shù)達(dá)60.0以上時(shí)，判定為鑒定有效。調(diào)查結(jié)果按公式（2）計(jì)算病情指數(shù)（DI）。根據(jù)計(jì)算結(jié)果分為6個(gè)抗性等級(jí)（詳見(jiàn)表2）。

DI—病情指數(shù)；dc—相應(yīng)病級(jí)；nc—各病級(jí)病葉數(shù)；nt—總?cè)~片數(shù)。amax—最高病情分級(jí)值。

3.3? 西瓜品種枯萎病和蔓枯病苗期聯(lián)合抗性鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)

由表3結(jié)果，根據(jù)枯萎病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，蘇蜜1號(hào)發(fā)病率為81.25%，鑒定為枯萎病感病品種，卡紅發(fā)病率為18.75%，鑒定為枯萎病高抗品種；利用西瓜苗離體葉片鑒定西瓜品種蔓枯抗性，蘇蜜1號(hào)病情指數(shù)為81.48，根據(jù)蔓枯病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為蔓枯病高感病品種，W7病情指數(shù)為39.81，為蔓枯病中抗品種。

鑒定結(jié)果表明，蘇蜜1號(hào)為枯萎病感病、蔓枯病高感病品種；卡紅為枯萎病高抗品種、蔓枯病感病品種，W7為蔓枯病中抗品種，與預(yù)期對(duì)照相應(yīng)抗病性符合。

4 注意事項(xiàng)

（1）枯萎病接種試驗(yàn)主要需注意控制溫度條件，粗放的環(huán)境條件下，建議避開(kāi)夏季高溫和冬季低溫，環(huán)境溫度宜控制在25℃～30℃，氣溫過(guò)高或過(guò)低都不利于枯萎病發(fā)病。（2）注意用于蔓枯病病菌產(chǎn)生分生孢子的黃瓜材料需要選擇新鮮的黃瓜果實(shí)。（3）用馬鈴薯液體培養(yǎng)液制備培養(yǎng)枯萎病菌孢子過(guò)程中，建議在培養(yǎng)液中加入鏈霉素等抗生素，防止細(xì)菌污染。（4）注意接種后每天都要定期觀察發(fā)病情況。

5 討論與結(jié)論

本鑒定技術(shù)方案對(duì)西甜瓜枯萎病、蔓枯病的病原菌種類(lèi)、來(lái)源、擴(kuò)繁、孢子液制備，同批同株苗期活體與離體葉片聯(lián)合抗病接種鑒定方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)性描述總結(jié)。該聯(lián)合鑒定技術(shù)方案將為抗枯萎病、抗蔓枯病的復(fù)合抗性種質(zhì)資源的篩選和品種選育提供技術(shù)輔助，該技術(shù)方案克服了之前的分株不同時(shí)的單一接種鑒定蔓枯病和枯萎病的抗病性，或者活體先后接種等方法的各自缺點(diǎn)[12，19]。比如以往活體先后接種后，枯萎病菌對(duì)感病植株是致命的，兩種病害接種相互影響病情，對(duì)感枯萎病材料如需繼續(xù)鑒定蔓枯病等其它抗病性，需要再次進(jìn)行不同批次的單一接種試驗(yàn)等缺點(diǎn)[13-14]，而本方案明確了蔓枯病采用離體葉片孢子懸浮液噴霧的接種方式，同時(shí)還優(yōu)化了蔓枯病的病情評(píng)價(jià)分級(jí)，而且實(shí)現(xiàn)在同批次同植株上同時(shí)鑒定兩種病害的抗性，提高效率，大大縮短了接種后所需等待時(shí)間。

本方案提供一種在同一植株同時(shí)鑒定西甜瓜枯萎病和蔓枯病抗性的可靠方法，避免了不同病害交叉侵染影響病情結(jié)果和不同批次試驗(yàn)不穩(wěn)定問(wèn)題。適合大量快速抗源篩選，縮短了周期，提高了鑒定效率，避免了錯(cuò)選率，也節(jié)約了鑒定材料，更有利于在實(shí)際工作中推廣應(yīng)用。

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