外泌體在心律失常中的研究進(jìn)展

王曉霏，李雯，王轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，韓林，黃辰

作者單位： 710061 西安，西安交通大學(xué)

心律失常是一種心血管疾病，由于竇房結(jié)激動(dòng)異常或激動(dòng)產(chǎn)生于竇房結(jié)以外，導(dǎo)致心臟搏動(dòng)的頻率和/或節(jié)律異常。這種疾病可單獨(dú)發(fā)病，也可與其他心血管疾病伴發(fā)，如心肌缺血缺氧、心力衰竭、氧化應(yīng)激及長(zhǎng)QT 綜合征等。目前的治療方法主要通過藥物或?qū)Ч芟趤砘謴?fù)和維持竇性心律，但效果有限[1]。近年來，外泌體成為了心律失常相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。外泌體是一種細(xì)胞分泌的膜性囊泡，其攜帶的組分可以反映細(xì)胞的生理狀態(tài)，因此成為疾病標(biāo)志物篩選的有效工具。同時(shí)，外泌體因其免疫原性較低，膜的生物相容性良好，因此也成為藥物及基因遞送的高效載體[2-3]。本文對(duì)外泌體在心律失常研究方面進(jìn)行綜述，為該領(lǐng)域提供新的治療視角和方法。

1 外泌體的生物學(xué)特征與發(fā)生

外泌體是一種細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡組成成分之一，直徑30 ～150 nm，包含復(fù)雜RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 等[2]。外泌體膜富含膽固醇和鞘磷脂，并含有多種膜蛋白，根據(jù)功能可以分為四類：（1）CD9、CD63、CD81 和CD82 蛋白等轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白；（2）MHCⅠ、MHCⅡ和CD86 等抗原處理與呈遞相關(guān)蛋白；（3）信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白，如外泌體膜蛋白黏蛋白-1（MUC1）亞基含有羧基末端結(jié)構(gòu)域，其可以通過磷酸化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；（4）Rab GTP 酶家族成員、SNAREs、flotillin 以及annexins 等胞吐和胞吞相關(guān)蛋白。不同細(xì)胞或同種不同生理狀態(tài)細(xì)胞分泌的外泌體，其囊腔中所含蛋白種類不同。此外，外泌體中還含有miRNA、lncRNA、mRNA 和DNA 等多種非編碼RNA 和編碼RNA 分子，參與生物體的生命活動(dòng)調(diào)節(jié)[4]。

外泌體是通過細(xì)胞內(nèi)吞和胞吐過程形成的細(xì)胞外囊泡，其分泌過程復(fù)雜有序。最初，新攝入的受體、脂膜和細(xì)胞外液等物質(zhì)被包于早期內(nèi)體中，然后通過ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ及ESCRT-Ⅱ等作用，識(shí)別泛素化膜蛋白并捕獲到早期內(nèi)體膜表面，以“逆出芽”方式向內(nèi)凹陷出芽，并進(jìn)一步選擇性地包裹部分細(xì)胞質(zhì)成分形成管腔內(nèi)小體。隨著ESCRT-Ⅲ的剪切作用，管腔內(nèi)小體與內(nèi)體質(zhì)膜分離形成多囊體（MVB），MVB可被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體融合被降解，或者與細(xì)胞膜融合后釋放其內(nèi)部小囊泡，產(chǎn)生外泌體[5]。此外，HSC70、HSP90 等蛋白參與了特異性結(jié)合內(nèi)容物分選入外泌體的過程[6]。外泌體還能夠富集AGO2 與RISC 等miRNA 結(jié)合相關(guān)蛋白[7]，為miRNA 分選進(jìn)入外泌體提供了條件。因此，外泌體在細(xì)胞間傳遞信息和物質(zhì)方面具有重要作用，其在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。外泌體可以通過多種途徑作用于靶細(xì)胞，包括：（1）外泌體膜上的信號(hào)蛋白與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而影響靶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；（2）外泌體將供體細(xì)胞表面的功能蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞膜上，改變靶細(xì)胞的功能；（3）外泌體與靶細(xì)胞發(fā)生膜融合，向靶細(xì)胞傳遞mRNA、非編碼RNA 等遺傳物質(zhì)，或者釋放傳染性顆粒以及功能蛋白質(zhì)；（4）外泌體被受體細(xì)胞內(nèi)吞或吞噬，作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被受體細(xì)胞的溶酶體降解[4]。因此，外泌體在醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

2 外泌體生物標(biāo)志物與心律失常相關(guān)疾病

2.1 心房顫動(dòng)（AF） AF是成年人中最常見的持續(xù)性心律失常，其主要原因?yàn)榛蛲蛔?、功能損傷、離子通道與轉(zhuǎn)運(yùn)體及鈣離子加工蛋白的表達(dá)紊亂，以及異位興奮灶的發(fā)生，導(dǎo)致心房纖維化、重構(gòu)、電異常和流變功能障礙[8]。引起AF 的心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)性重構(gòu)與外泌體密切相關(guān)。

心房電重構(gòu)是指心房肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致心房電活動(dòng)異常，為促進(jìn)持續(xù)性AF 的關(guān)鍵因素[9]。心房肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能改變可導(dǎo)致外泌體的內(nèi)含物組成發(fā)生變化，檢測(cè)差異的外泌體標(biāo)志物具有預(yù)測(cè)心房電重構(gòu)和AF 的價(jià)值。L 型鈣電流的改變和電壓門控型L型鈣通道亞基1c（Cav1.2）的表達(dá)減少導(dǎo)致動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間縮短，與AF 有關(guān)。AF 患者血清源性外泌體中的miR-21-3p 和miR-21-5p 均上調(diào)，其中miR-21-3p 直接靶向作用于編碼Cav1.2 的CACNA1C 基因，抑制Cav1.2 蛋白表達(dá)[10]。在風(fēng)濕性心臟病合并AF 患者和AF 犬心房模型中，富含miR-328 的外泌體通過靶向編碼L型鈣通道的CACNA1C 和CACNB1 基因參與心房電重構(gòu)[11]。與AF 患者相比，AF 相關(guān)的缺血性腦卒中患者血清外泌體miR-641 和miR-30e-5p 顯著升高，可作為AF 與AF 相關(guān)的缺血性腦卒中的鑒別指標(biāo)[12]。miR-122-5p 在術(shù)后AF 患者中上調(diào)，提示其是預(yù)測(cè)術(shù)后AF 的生物標(biāo)志物[13]。在持續(xù)性AF 患者血清外泌體中，miR-142-5p、miR-483-5p、mir-223-5p和miR-223-3p 可能與AF 的進(jìn)展有關(guān)[14]，外泌體miR-92b-3p、miR 1306-5p 和Let-7b-3p 表達(dá)有助于評(píng)估AF 的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展[15]。在人心包液中檢測(cè)到的外泌體miR-382-3p、miR-450a-2-3p 和miR-3126-5p，可以反映心臟纖維化相關(guān)的AF進(jìn)展[16]。除了miRNA以外，lncRNAs 也可以作為AF 的標(biāo)志物。lncRNAs LOC105377989 和LOC107986997 在持續(xù)性AF 患者血清外泌體中表達(dá)上調(diào)，兩者對(duì)AF 的診斷均具有顯著的有效性，其中l(wèi)ncRNA LOC107986997 還參與AF 相關(guān)的病理生理調(diào)節(jié)[17]。

心肌纖維化是AF 的病理表現(xiàn)。起搏心肌成纖維細(xì)胞的外泌體（CF-exos）引起快速起搏h9c2 細(xì)胞鐵死亡，其高表達(dá)的miR-23a-3p 可直接靶向抑制SLC7A11 的翻譯，抑制miR-23a-3p 可以逆轉(zhuǎn)CFexos 誘導(dǎo)h9c2 細(xì)胞鐵死亡的過程[18]。經(jīng)Ang-II 處理的人心肌細(xì)胞來源的外泌體高表達(dá)PVT1，并通過抑制miR-145-5p 增加IL-16 的表達(dá)促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)重塑，因此提示PVT1 可能是AF 的治療靶點(diǎn)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)AF 患者和AF 大鼠模型中miR-324-3p 表達(dá)降低，導(dǎo)致其下游靶點(diǎn)TGF- 1 升高，PI3K/AKT 信號(hào)通路開放，引起成纖維細(xì)胞增殖[20]，這表明miR-324-3p 可能是AF 的保護(hù)因子。

2.2 心肌梗死（MI） MI 是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，可并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，常危及生命。尋找MI 早期標(biāo)志物，通過快速診斷，可提高M(jìn)I 的救治效率。研究發(fā)現(xiàn)MI患者外泌體的大小和濃度明顯高于年齡匹配的非MI患者，并且血漿源性外泌體中LDLR 和APOA5 水平顯著降低，提示其可作為MI 的診斷標(biāo)志物[21]。另外，與對(duì)照組相比，AMI 患者中 lncRNAs ENST00000556899.1 和ENST00000575985.1 顯著上調(diào)。ROC 曲線分析顯示，循環(huán)外泌體lncRNAs ENST00000556899.1 和 ENST00000575985.1 的AMI 曲線下面積（AUC）分別為0.661 和0.751。其中，ENST00000575985.1 與炎癥生物標(biāo)志物、預(yù)后指標(biāo)、心肌損傷標(biāo)志物等臨床參數(shù)的關(guān)系更為顯著[22]。

2.3 動(dòng)脈粥樣硬化（AS） AS是由于脂質(zhì)代謝障礙而引起脈粥樣硬化病變的一類疾病，為冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始，先由脂質(zhì)和復(fù)合糖類在血管內(nèi)沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚變硬、血管腔狹窄。隨著病變發(fā)展，導(dǎo)致動(dòng)脈腔阻塞，引起該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官缺血或壞死。外泌體通過細(xì)胞間信息交換參與血管鈣化，在血管粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-146a通過負(fù)調(diào)控IRAK1 和TRAF6 表達(dá)抑制泡沫細(xì)胞的形成、RAW264.7 巨噬細(xì)胞的凋亡和促炎反應(yīng)，從而增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[23]。而在致AS 外泌體中，miR-146a 高度富集，其可抑制巨噬細(xì)胞IGF2BP1 和HuR的表達(dá)，進(jìn)而降低巨噬細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)血管平滑肌的鈣化[24]。巨噬細(xì)胞來源的外泌體miR-4532 通過靶向SP1 和下游NF- B P65激活，顯著破壞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）功能，可能與AS 的發(fā)生相關(guān)[25]。血小板分泌高表達(dá)miR-223 的外泌體可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，影響內(nèi)皮炎癥和AS 的進(jìn)展，而用吲哚酚可以降低miR-223 的表達(dá)，限制AS 的發(fā)展。內(nèi)臟脂肪來源的外泌體miR-27b-3p 進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以靶向下調(diào)PPAR ，激活NF- B 通路，增加炎癥和AS[26]。攜帶miR-16 和miR-21 的外泌體可以抑制NF- B 通路，阻斷TNF- 誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，從而延緩AS的進(jìn)展[27]。與穩(wěn)定斑塊患者相比，不穩(wěn)定/易損斑塊患者的血清外泌體中circ_0006896 的表達(dá)明顯增加，其水平與三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和C-反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)，這提示circ_0006896 與斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[28]。

2.4 冠狀動(dòng)脈疾?。–AD） CAD 是一種常見的心臟疾病，其中冠狀動(dòng)脈血流減少導(dǎo)致心肌缺血。外泌體循環(huán)RNA 在CAD 的診斷中具有重要的作用。circNPHP4 在CAD 患者單核細(xì)胞分離出的外泌體中表達(dá)顯著升高，通過抑制miR-1231 促進(jìn)EGFR/PI3K/AKT通路，影響人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞的招募[29]。穩(wěn)定型心絞痛（CCS）患者血漿外泌體lncRNA ENST00000424615.2 和 ENST000005607 69.1 較對(duì)照組高，兩個(gè)lncRNA 的ROC 曲線下面積分別為0.654 和0.722，可作為診斷CCS的生物標(biāo)志物。更多病變血管的CCS 患者中外泌體lncRNA ENST00000560769.1 更高，提示其可能與預(yù)后不良有關(guān)[30]。外泌體 miRNAs miR-133a、miR-208a、miR-1、miR-499-5p 和miR-30a 在CAD 患者中表達(dá)上調(diào)，可以用于急性MI 的早期診斷。在CAD 患者中，外泌體蛋白如纖維蛋白原/ 鏈、間-胰蛋白酶抑制劑重鏈和-1 抗胰蛋白酶表達(dá)上調(diào)，提示其為潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物；而白蛋白、簇蛋白和維生素D結(jié)合蛋白下調(diào)，可作為預(yù)后指標(biāo)[31]。此外，外泌體circ_0005540 與SOCS2-AS1 在CAD 患者中也普遍升高[32]。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈疾?。⊿CAD）組血 清 外 泌 體 中 miR-942-5p、miR-149-5p 和miR-32-5p 的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，診斷SCAD的AUC 分別為0.693、0.702 和0.691；GO 分類和信號(hào)通路分析提示這些miRNA 參與了SCAD 的病理生理過程[33]。

3 外泌體與心律失常相關(guān)疾病的治療

3.1 AF AF的發(fā)展與外泌體miRNA密切相關(guān)，提示外泌體miRNA 可能在AF 治療中扮演著關(guān)鍵的角色。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以改善心肌損傷并減小MI 面積。其中外泌體miRNA-22 可調(diào)節(jié)甲基化結(jié)合蛋白，改善心肌纖維化并抑制心肌細(xì)胞凋亡[34]；外泌體miRNA-126 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)血管生成過程，并在一氧化氮刺激下具有更好的效果[35]。胚胎干細(xì)胞來源的外泌體miRNA-294 可抑制心肌纖維化，從而改善MI 后的心功能[36]，而大鼠血漿的外泌體miRNA-24[37]和脂肪組織的外泌體miRNA-320d[38]也具有保護(hù)心臟的作用。另外，心球細(xì)胞的外泌體富含miRNA-146a，可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低瘢痕組織形成來修復(fù)受損心肌[39]。

3.2 MI 發(fā)生MI 時(shí)，由于部分心肌細(xì)胞死亡和破壞會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，從而加重心肌缺血缺氧，導(dǎo)致心肌功能不全。外泌體治療能夠通過多種途徑對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，減輕心肌缺血再灌注傷害，快速抑制心肌凋亡并促進(jìn)免疫系統(tǒng)的再生治療。有研究表明，外泌體可以被有效釋放到心肌組織中，抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低梗死面積和縮短肌細(xì)胞恢復(fù)期。外泌體來源的miR-146a[40]和miR-21[41]等能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和再生，抑制心臟炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌細(xì)胞和纖維化細(xì)胞起到保護(hù)作用。miR-126 能夠促進(jìn)血管新生和心肌再生，對(duì)梗死心肌發(fā)揮保護(hù)作用[42]。近年，工程化外泌體在MI 治療中的應(yīng)用得到了廣泛重視。金屬蛋白酶-2 的組織抑制劑修飾的人臍帶msc來源外泌體通過Akt/SFRP2 途徑增強(qiáng)大鼠MI模型的修復(fù)[43]；過表達(dá)HIF-1 的msc 來源外泌體可以增強(qiáng)AMI 后的血管生成[44]；間質(zhì)干細(xì)胞衍生因子（SDF）-1 外泌體可抑制缺血心肌細(xì)胞的自噬，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞微血管生成[45]。缺血心肌靶向肽（IMTP）設(shè)計(jì)的外泌體可以特異性靶向缺血心肌，使MSC 衍生的IMTP 外泌體對(duì)AMI 的治療作用增強(qiáng)[46]。心臟祖細(xì)胞（CPC）分泌外泌體的膜上富集有妊娠相關(guān)血漿蛋白A（PAPP-A），PAPP-A可以切割I(lǐng)GFBP-4，釋放IGF-1，進(jìn)而觸發(fā)心肌細(xì)胞Akt 和ERK1/2 的激活以及caspase-7 的抑制，對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[47]。

3.3 AS 外泌體不僅可以誘導(dǎo)AS 的形成，同時(shí)也可以抑制其病理過程，成為治療的手段。來自間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、骨髓源性巨噬細(xì)胞和血小板的外泌體可以改善AS。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞來自的外泌體富集了包括miR-100-5p[48]、miR-512-3p[49]、let-7 家族[50]和miR-21a-5p[51]等多種miRNA，能夠減少AS 斑塊的面積和斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化，并且通過靶向不同的信號(hào)通路來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移、膽固醇代謝和炎癥反應(yīng)等生物過程。這提示MSC 來源的外泌體可能成為治療AS 的新型藥物。

血小板源性外泌體在預(yù)防AS 方面也發(fā)揮著重要作用。凝血酶激活的血小板源性外泌體中含有多種miRNA，如miR-223、miR-339、miR-21[52]和miR-25-3p[53]等，這些 miRNA 可以通過靶向ICAM-1、Adam10 等分子，調(diào)節(jié)NF- B 信號(hào)通路，從而抑制內(nèi)皮炎癥和炎癥反應(yīng)，緩解AS 的發(fā)生。

綜上所述，外泌體作為一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物學(xué)信號(hào)載體，可以通過作為診斷標(biāo)志物、參與疾病治療等方式，為心律失常相關(guān)疾病的臨床治療提供更加精準(zhǔn)、有效的手段。隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會(huì)在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用得到更加廣泛的開展。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突