基于人工智能的益生乳酸菌精準(zhǔn)篩選及產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)

張和平，高廣琦

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特 010018）

益生菌是一類活性微生物，當(dāng)攝入量足夠時，對宿主健康有益[1]。近年來，大量研究揭示了益生菌的健康益處，包括有效緩解或改善便秘、腹瀉、炎癥性腸病、腸易激綜合征、食物過敏、心血管疾病以及癌癥等多種代謝性疾病[2]。正因如此，益生菌在保健、醫(yī)療和食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，盡管益生菌市場日益繁榮，我國市場上絕大多數(shù)益生菌產(chǎn)品還是以外國菌株為主。發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的本土菌株，以更精準(zhǔn)地維護(hù)中國人腸道健康，既是當(dāng)務(wù)之急，也是提高我國益生菌市場競爭力的關(guān)鍵。

乳酸菌是益生菌家族的重要成員，廣泛分布于土壤、水體、植被以及人類和動物的腸道等環(huán)境中[3]。目前，我國仍使用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)從自然界分離和篩選具有益生潛力的乳酸菌，再通過高密度發(fā)酵等技術(shù)將其商品化。然而，這種方法策略面臨兩大問題：一是篩選過程耗時耗力，投入成本高；二是高密度發(fā)酵和產(chǎn)業(yè)化技術(shù)相對滯后。這兩個問題嚴(yán)重阻礙了我國益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等高通量技術(shù)的快速發(fā)展，乳酸菌遺傳、代謝、生長和衰亡機(jī)制，以及益生功能相關(guān)基因被深入研究。利用這些基因組數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)，建立更精準(zhǔn)的益生乳酸菌篩選技術(shù)，將極大地推動益生乳酸菌資源的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

1 益生乳酸菌篩選技術(shù)概述

益生菌發(fā)揮其益生功能的前提，是它們必須能在消化道苛刻的環(huán)境中生存和定植。消化道中高酸度（pH 1.5～4.0）的胃酸、具有抑菌活性的膽汁鹽以及各種消化酶[4]，對乳酸菌來說，既是生存壓力，也是篩選其作為優(yōu)質(zhì)益生菌的重要指標(biāo)。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）在2003 年聯(lián)合發(fā)布的《食品益生菌評價指南》中明確指出，必須對益生菌的耐酸、耐膽鹽能力進(jìn)行評價。這種評價乳酸菌耐受消化道酸性和膽汁鹽的篩選方法通常在體外進(jìn)行。一般認(rèn)為，可用的、具有益生潛質(zhì)的乳酸菌需要先后在人工胃液（0.3%胃蛋白酶，pH2.5）條件下耐受3 h，在人工腸液（0.1%胰蛋白酶，1.8%膽鹽，pH 8.0）條件下耐受8 h 后仍具有較高的存活率，以此作為耐受胃腸液的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

遵循以上標(biāo)準(zhǔn)，國際上已成功篩選出多株益生菌。其中，最出名的是動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 株（Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12，BB-12）和鼠李糖乳桿菌GG 株（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）。這兩株菌不僅在腸道環(huán)境中表現(xiàn)出出色的生存和定植能力，還被證明具有多種健康益處。比如，BB-12 被報道能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，提高機(jī)體免疫力，緩解特應(yīng)性濕疹的癥狀，促進(jìn)嬰幼兒免疫系統(tǒng)的成熟和降低輪狀病毒和呼吸道感染率[5]。LGG 被證明能改善腸胃道功能，緩解便秘和腹瀉癥狀，刺激機(jī)體免疫力，預(yù)防呼吸道感染和齲齒，排除毒素和促進(jìn)有益菌生長[6]。

總體來看，傳統(tǒng)的益生乳酸菌篩選技術(shù)雖有一定的成效，但效率低、耗時長，并可能遺漏某些有益菌株。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是高通量基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)更精準(zhǔn)、更高效的篩選技術(shù)十分必要。這些創(chuàng)新手段或能加速篩選速度，降低經(jīng)濟(jì)成本，并有機(jī)會發(fā)現(xiàn)更多未知的益生菌，推進(jìn)益生乳酸菌的研究和應(yīng)用進(jìn)程。

2 基于人工智能的益生乳酸菌精準(zhǔn)篩選技術(shù)

近年來，得益于測序技術(shù)的快速迭代和測序成本的大幅降低，大量乳酸菌基因組序列數(shù)據(jù)被上傳并存儲在公共數(shù)據(jù)平臺中。目前，美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫已公開約6 000 個乳桿菌和雙歧桿菌的基因組序列。同時，一些科研機(jī)構(gòu)還在不斷地收集和建立更大規(guī)模的乳酸菌基因組數(shù)據(jù)庫。這些豐富的基因組數(shù)據(jù)為乳酸菌科學(xué)研究帶來了前所未有的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。通過利用生物信息學(xué)和人工智能技術(shù)，研究人員在這海量的基因組數(shù)據(jù)中對乳酸菌基因組結(jié)構(gòu)、代謝通路和潛在的功能基因進(jìn)行全面、深入的分析和挖掘。

在這一領(lǐng)域，Xiao 等[7]及其團(tuán)隊采用機(jī)器學(xué)習(xí)模型和算法對乳桿菌和雙歧桿菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行深度解析，并對其腸道定植模式進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。這不僅為理解益生菌在腸道中的定植行為提供了新的視角，也為挖掘其它益生菌的基因組數(shù)據(jù)提供了重要的理論和技術(shù)支撐。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊開發(fā)了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法和基因組大數(shù)據(jù)的益生乳酸菌篩選和預(yù)測平臺。他們對多個益生菌菌株的基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行k-mer 分析，發(fā)現(xiàn)了益生乳酸菌基因組的寡核苷酸組成和特性，并成功建立了益生乳酸菌的預(yù)測模型，經(jīng)降噪處理和k-mer 優(yōu)化，該模型的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到97.77%，曲線下面積達(dá)到98.00%。在此基礎(chǔ)上，還利用GO、KEGG 和RAST 等數(shù)據(jù)庫對益生乳酸菌基因組進(jìn)行功能注釋，并成功挖掘到與益生特性相關(guān)的基因和代謝通路。此外，還發(fā)現(xiàn)益生菌的益生功能并非由單一基因決定，而是由整體的kmer 組成共同影響。為了便于其他科研人員進(jìn)行益生乳酸菌的快速篩選和研究，該團(tuán)隊開發(fā)了一個在線且免費的生物信息學(xué)篩選工具——iProbiotics[8]。

實際上，在iProbiotics 工具開發(fā)之前，基于基因組數(shù)據(jù)篩選益生乳酸菌的理念和方法已有先例。2010 年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊成功完成了我國首個乳酸菌——干酪乳桿菌Zhang（Lacticaseibacilluscasei Zhang，LCZ）的全基因組測序。通過對基因組序列進(jìn)行深度解析，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)LCZ 攜帶多個潛在的益生特性基因[9]。在隨后的幾年里，LCZ 的一系列益生功能，如維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)[10]、減輕炎癥反應(yīng)[11]、緩解過敏癥狀[12]、調(diào)節(jié)血脂代謝[13]以及改善急性和慢性腎臟疾病[14]等，在臨床和動物試驗中得到驗證。這項技術(shù)的本質(zhì)是依托乳酸菌種質(zhì)資源庫，結(jié)合公開發(fā)布數(shù)據(jù)庫收集的乳酸菌基因組信息，通過生物信息學(xué)處理，全面梳理乳酸菌的物種分類、功能基因、培養(yǎng)條件、菌株來源和益生特性等信息，構(gòu)建乳酸菌基因組大數(shù)據(jù)集。利用乳酸菌基因組數(shù)據(jù)集中海量的基因、基因結(jié)構(gòu)域和代謝通路注釋結(jié)果，基于人工智能方法建立基于菌株基因組特征、代謝特征和生產(chǎn)特性的全新乳酸菌功能基因挖掘方法，明確與益生特性相關(guān)的功能基因或位點，構(gòu)建低噪聲的優(yōu)良益生特性乳酸菌的高通量篩選技術(shù)，結(jié)合超級計算機(jī)平臺優(yōu)化篩選模型的計算效率，為優(yōu)良乳酸菌的篩選提供以數(shù)據(jù)為導(dǎo)向的解決方案，挖掘出具有調(diào)節(jié)腸道菌群、強(qiáng)化免疫平衡等功能的益生乳酸菌。同時可針對不同乳酸菌菌株耐酸耐膽鹽、抗氧化、抗炎以及降血脂等益生功能的差異性，結(jié)合比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)解析不同乳酸菌菌株在轉(zhuǎn)錄水平以及代謝水平的差異，篩選乳酸菌候選益生功能基因。如今，通過使用iProbiotics，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊從自然發(fā)酵乳制品、自然發(fā)酵食品、母乳、嬰兒糞便等樣品中成功篩選出28 株具有潛在益生特性的乳酸菌。如具有治療急慢性腹瀉[15]、潰瘍性結(jié)腸炎[16]、多囊卵巢綜合征[17]功效的乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium lactis V9），具有降解體內(nèi)有機(jī)磷農(nóng)藥、緩解農(nóng)藥高暴露誘發(fā)的炎癥反應(yīng)作用的植物乳桿菌P9（Lactobacillus plantarum P9）[18-19]，具有通過“腸-腦軸”調(diào)節(jié)精神健康，緩解阿爾茨海默癥[20]、帕金森[21]等癥狀的乳雙歧桿菌Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8），以及具有免疫調(diào)節(jié)、提高抗腫瘤免疫應(yīng)答作用的鼠李糖乳酪桿菌Probio-M9（Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9）等。這種基于群體基因組學(xué)和功能基因精準(zhǔn)定位策略的益生乳酸菌人工智能篩選技術(shù)，通過超算集群實現(xiàn)了益生菌高效靶向篩選，不僅篩選出具有調(diào)節(jié)腸道菌群、強(qiáng)化免疫平衡等功能的益生乳酸菌，而且構(gòu)建了多維度腸道菌群互作的益生功能評價體系。iProbiotics 的誕生和廣泛應(yīng)用，標(biāo)志著我國益生乳酸菌的篩選和評價全面進(jìn)入基因組時代。

3 益生乳酸菌的高密度發(fā)酵及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)

益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵在于生產(chǎn)盡可能多的活菌。乳酸菌的生長和活性受諸多因素的影響，包括培養(yǎng)溫度、pH 值、營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)等。為了更好地控制這些因素，工業(yè)生產(chǎn)常采用高密度發(fā)酵（High Cell Density Fermentation）技術(shù)進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)。高密度發(fā)酵技術(shù)可以精準(zhǔn)控制培養(yǎng)溫度、實時調(diào)節(jié)pH 值，并向生物反應(yīng)器及時補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，以創(chuàng)造最佳的乳酸菌生長環(huán)境。目前，該技術(shù)能使乳酸菌的菌體密度達(dá)到甚至超過靜態(tài)培養(yǎng)的10 倍以上。此外，針對不同的乳酸菌株，開展個性化的優(yōu)化試驗，如優(yōu)化高密度發(fā)酵的培養(yǎng)條件和調(diào)整培養(yǎng)基成分，還可以進(jìn)一步提高乳酸菌活性。董安利[22]使用單因素實驗和正交試驗，優(yōu)化了乳酸乳球菌乳酸亞種BL19（Lactococcus lactis subsp.lactis BL19）高密度培養(yǎng)基中碳源、氮源、營養(yǎng)因子和緩沖鹽，使BL19 的活菌數(shù)提高了6.07倍。蘇馨[23]不僅優(yōu)化了嗜酸乳桿菌IMAU81186（Lactobacillus acidophil IMAU81186）的培養(yǎng)基成分，還調(diào)整了溫度、接種量和pH 值等培養(yǎng)條件，使IMAU81186 的活菌數(shù)提高了7.03 倍。

在益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)化過程中，另一大挑戰(zhàn)是如何長期保持菌株活性。由于大多數(shù)益生菌怕水、怕氧、怕熱，工業(yè)生產(chǎn)常采用真空冷凍干燥（Vacuum Freezing Technology）技術(shù)把益生菌細(xì)胞中95%的水分在低溫和低氧條件下去除，從而使益生菌變成一種極端“干燥” 的狀態(tài)并進(jìn)入深度休眠。這種狀態(tài)可以暫停益生菌的生命活動，直到水分重新進(jìn)入細(xì)胞，活性才會恢復(fù)。因此，真空冷凍干燥技術(shù)既保持了益生菌的活性，又提高了其在長期儲藏中的穩(wěn)定性。然而，冷凍干燥過程中的極寒環(huán)境會引起菌體應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致菌體失活。如何提高乳酸菌在冷凍干燥過程中的存活率，仍然是益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)化過程中需要突破的技術(shù)瓶頸[24]。通過改變培養(yǎng)條件提高菌株凍干存活率是該領(lǐng)域的研究熱點，例如在針對植物乳植桿菌LIP-1 的研究中，利用亞細(xì)胞損傷鑒定流程發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入氨基酸和堿基類物質(zhì)影響菌株的冷凍干燥存活率。不同的培養(yǎng)條件促使菌株通過增加細(xì)胞膜蛋白，調(diào)整細(xì)胞膜脂肪酸組成成分，增加細(xì)胞壁肽聚糖及表層蛋白含量的途徑減少細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的損傷，或通過代謝堿基為DNA 合成提供原料和調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH 的方式減少DNA 損傷，以及通過合成生物膜和應(yīng)激蛋白，使菌株自身獲得更高的冷凍干燥存活率[25]。

近年來，基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多組學(xué)技術(shù)逐漸成為突破益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)化瓶頸的關(guān)鍵技術(shù)。借助多組學(xué)技術(shù)，研究人員深入探究了乳酸菌在冷凍干燥過程中的應(yīng)激響應(yīng)和生理適應(yīng)機(jī)制，找到了與乳酸菌抗寒和生物膜組分調(diào)節(jié)相關(guān)的基因和蛋白[26-29]，這為開發(fā)乳酸菌冷凍干燥保護(hù)技術(shù)奠定了重要的理論基礎(chǔ)。王昊乾等[30]從乳清蛋白水解物中篩選出一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的多肽，能夠作為凍干保護(hù)劑減少真空冷凍干燥過程中對乳雙歧桿菌Probio-M8 的細(xì)胞損傷，顯著提高菌種存活率至（88.31±0.02）%，同時還能夠降低胞內(nèi)活性氧水平并保護(hù)細(xì)胞活力。此外，通過建立LCZ 不同生長時期的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，不同發(fā)酵條件和發(fā)酵階段關(guān)鍵基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)菌株生長特性與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解和分子伴侶蛋白等13 個功能基因的表達(dá)相關(guān)，明確了這些基因在菌株生長中的重要作用，構(gòu)建了菌株差異化的代謝通路，發(fā)明了不同菌株精準(zhǔn)營養(yǎng)的高密度發(fā)酵技術(shù)，液體培養(yǎng)活菌數(shù)提高至3.0×1010CFU/mL，突破了高密度發(fā)酵的技術(shù)瓶頸，菌體生物量提高了1 個數(shù)量級。此外，通過研究乳酸菌在培養(yǎng)過程中的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[31-36]，研究者發(fā)現(xiàn)了乳酸菌特殊的營養(yǎng)需求，以及其對某些營養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝途徑的缺陷[37-39]。基于單細(xì)胞層面探索了高密度發(fā)酵和冷凍干燥過程中菌體受損和衰亡的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)了還原型輔酶Ⅰ氧化酶和氧損傷修復(fù)蛋白編碼基因顯著高表達(dá)的規(guī)律，明確了細(xì)胞膜氧化損傷是益生乳酸菌高密度發(fā)酵、冷凍干燥和儲存過程中菌株衰亡的主要原因。通過添加谷胱甘肽和蛋白水解抗氧化肽，并進(jìn)行菌體微包膜隔氧干燥處理，維持細(xì)胞不飽和脂肪酸比例，減輕自由基對細(xì)胞組分的破壞，保護(hù)菌體細(xì)胞膜完整性，研創(chuàng)了微包膜高效保護(hù)的乳酸菌冷凍干燥技術(shù)，使活菌得率提高至90%以上，生產(chǎn)出的發(fā)酵劑（制劑）活菌數(shù)在1.5×1012CFU/g 以上[40]。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步優(yōu)化高密度培養(yǎng)基成分，提高菌體密度提供了新的思路。

4 結(jié)語

隨著消費者對健康飲食認(rèn)知的提升，益生乳酸菌產(chǎn)品逐漸為大眾所知，并得到廣泛的認(rèn)可。作為全球人口最多的國家，中國益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)有巨大的增長潛力，未來或有望成為全球最大的益生菌消費市場。然而，我國當(dāng)前的益生乳酸菌篩選及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)落后，也缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的益生菌菌株。鑒于此，繼續(xù)提高益生乳酸菌篩選及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)方面的投入，發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的本土菌株，才能更好地維護(hù)中國人腸道健康。此外，也要重視并加強(qiáng)技術(shù)創(chuàng)新，充分利用好大數(shù)據(jù)以及人工智能等現(xiàn)代技術(shù)，著力解決益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)化過程中的技術(shù)瓶頸，以實現(xiàn)中國益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展。