肺癌顱腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型建立的比較

涂洵崴 李鴻茹 陳正偉 王大璇

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其主要死亡原因是發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。近年來，肺癌的發(fā)病率逐年升高，肺癌顱腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病率也隨之升高。在臨床上有20%～30%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了顱腦轉(zhuǎn)移，40%～50%的肺癌患者在整個(gè)病程中會(huì)出現(xiàn)顱腦轉(zhuǎn)移。肺癌顱腦轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后不良、神經(jīng)損害癥狀、生存質(zhì)量下降、生存期減短，未經(jīng)治療的中位生存期為1～3個(gè)月[1-3]。然而，目前對(duì)肺癌顱腦轉(zhuǎn)移發(fā)生的具體機(jī)制還不清楚，需要臨床相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來具體研究。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同注射途徑的方法建立肺癌顱腦轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，即通過左心室注射、尾靜脈注射和胸腔注射具有顱腦轉(zhuǎn)移潛力的PC-9人肺腺癌細(xì)胞，以探究顱腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型建立的最佳注射途徑，為研究顱腦轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制提供可靠的造模方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

BALB/c NUDE裸小鼠，雌性，體質(zhì)量16～18 g/只，4～6周齡，健康，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬）2021-005]，隨機(jī)分配至左心室注射組、尾靜脈注射組、胸腔注射組，每組6只。通過剪裸鼠耳朵標(biāo)記裸鼠的左耳上下、右耳上部位，為裸鼠編號(hào)。所用的飼料、水、墊料都經(jīng)過嚴(yán)格滅菌處理，并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則給予人道的關(guān)懷。RPMI 1640 培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）、新生胎牛血清（杭州四季青生物技術(shù)公司，中國(guó)）、1%Pen-Strep雙抗（HyClone公司，美國(guó)）、0.25%胰酶-EDTA（Gibco公司，美國(guó)）、1 mL胰島素注射器（舒銳公司，美國(guó)）、生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾、中國(guó)），CO2培養(yǎng)箱（上海力申科儀、中國(guó)）、倒置顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC-9細(xì)胞株，具有顱腦轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞系購(gòu)買自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，以含體積分?jǐn)?shù)為10%滅活新生胎牛血清、1% Pen-Strep雙抗、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，并以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞懸液置備

當(dāng)鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制備細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入無血清的1640培養(yǎng)基，再經(jīng)吹打、離心，以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)

吹打混勻細(xì)胞，取4滴細(xì)胞懸液、4滴臺(tái)盼藍(lán)染液混于離心管中，活細(xì)胞不被染。將混勻的細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，統(tǒng)計(jì)四大格的活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞量/mL＝（四大方格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×2/mL。臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞存活率＞90%（細(xì)胞存活率＝活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。離心并重懸細(xì)胞至密度分別為1×107個(gè)/mL。

1.2.4 接種動(dòng)物

左心室注射組：裸鼠麻醉、固定、消毒后，在胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進(jìn)針。

尾靜脈注射組：裸鼠固定后，用酒精擦拭尾巴消毒并擴(kuò)張血管，于尾部中外1/3處進(jìn)針。

胸腔注射組：裸鼠右側(cè)臥位固定、消毒后，在腋后線第6肋間進(jìn)針，以進(jìn)針突破感后再進(jìn)針3～4 mm為準(zhǔn)。三組均注入0.1 mL（即1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞）的PC-9細(xì)胞懸液。在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)接種后的裸鼠。

1.2.5 標(biāo)本留取

定期稱重，觀察裸鼠情況，注意裸鼠有無出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行，當(dāng)裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，表現(xiàn)為弓背、消瘦、食欲減退時(shí)，處死裸鼠，解剖及HE染色觀察肺臟、顱腦。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 裸鼠情況

記錄裸鼠體質(zhì)量、觀察裸鼠一般情況以及注意有無共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行。

1.3.2 形成肺部腫瘤及顱腦轉(zhuǎn)移情況

在無菌條件下解剖小鼠，觀察肺、腦臟器有無轉(zhuǎn)移灶，肉眼見病灶給予拍照記錄，取出肺組織、腦組織，以10%甲醛溶液固定，行常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠情況

（1）左心室注射組：注射后18 d裸鼠開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降，惡病質(zhì)逐漸出現(xiàn)，期間表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行的裸鼠有5只（圖1-A）。（2）尾靜脈注射組：注射后55 d裸鼠體質(zhì)量開始減輕，92 d開始出現(xiàn)惡病質(zhì)，期間均未出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行。（3）胸腔注射組：注射后22 d，裸鼠出現(xiàn)胸壁瘤結(jié)；體質(zhì)量在35 d開始下降，惡病質(zhì)逐漸出現(xiàn)，期間均未出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行。

圖1 裸鼠情況

2.2 形成肺部腫瘤及顱腦轉(zhuǎn)移

（1）左心室注射組：裸鼠27 d處死，肺（圖1-B）解剖觀察無異常，顱腦無異常；HE染色證實(shí)，6只裸鼠肺內(nèi)腫瘤病灶均未檢出；轉(zhuǎn)移灶見所有裸鼠顱腦（圖1-C）。（2）尾靜脈注射組：裸鼠于112 d處死，解剖觀察肺（圖1-B）及顱腦無異常；HE染色證實(shí)4只裸鼠身上出現(xiàn)了肺部腫瘤灶；6只裸鼠均未發(fā)現(xiàn)顱腦轉(zhuǎn)移。（3）胸腔注射組：裸鼠于42 d處死，觀察肺及胸腔見多發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)、團(tuán)塊，并胸膜、肋骨、脊柱浸潤(rùn)（圖1-D）；HE染色證實(shí)6只裸鼠均出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶；均未發(fā)現(xiàn)顱腦轉(zhuǎn)移。

3 討論

肺癌是常見的高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤[4]。大量患者死于晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是腦部轉(zhuǎn)移[5]。顱腦轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者預(yù)后，故高效的顱腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)于肺癌顱腦轉(zhuǎn)移機(jī)制研究有重大意義。其他顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤主要來自乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤以及未知組織來源的腫瘤[6-8]。目前，國(guó)際上對(duì)顱腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究比較關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試用各種不同的方法，包括尾靜脈注射、左心室或頸內(nèi)動(dòng)脈注射及腦立體定位原位種植途徑，相關(guān)的動(dòng)物模型也已陸續(xù)被建立，然而均存在成功率不高或操作復(fù)雜的局限性[9-16]。因此，建立合適的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，用于肺癌的顱腦轉(zhuǎn)移研究就成了重中之重。

課題組通過對(duì)比肺癌顱腦轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用左心室注射、尾靜脈注射、胸腔注射的方法，發(fā)現(xiàn)左心室注射方法顱腦轉(zhuǎn)移形成率達(dá)到100%，而尾靜脈注射、胸腔注射的方法未發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移灶。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，分析如下：左心室注射方法，心室解剖位置較易定位，技術(shù)難度較頸內(nèi)動(dòng)脈注射法降低，心室內(nèi)血液容積大及被迅速泵入動(dòng)脈，注射入的腫瘤細(xì)胞不易形成細(xì)胞團(tuán)簇，有利于腫瘤細(xì)胞隨血液擴(kuò)散；經(jīng)左心室注射的腫瘤細(xì)胞，直接入動(dòng)脈，能夠很快到達(dá)腦部毛細(xì)血管床，減少過程中被消滅的可利用的腫瘤細(xì)胞數(shù)，有助于顱腦轉(zhuǎn)移形成[17-21]。左心室注射的方法很好地模擬了肺癌的血行轉(zhuǎn)移，即通過肺微血管床的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入左心室，經(jīng)血流流向腦部，產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移[22]。再則，左心室注射使腫瘤細(xì)胞滯留在肺微血管床的時(shí)間減少，腫瘤細(xì)胞經(jīng)腦實(shí)質(zhì)的數(shù)量增加，腫瘤細(xì)胞因肺癌而死亡的時(shí)間推遲，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞在腦內(nèi)生長(zhǎng)和增殖的時(shí)間延長(zhǎng)，從而獲得較高的腦轉(zhuǎn)移率；而尾靜脈注射、胸腔注射的方法，腫瘤細(xì)胞首先經(jīng)靜脈滯留肺部，只有通過肺微血管床以及從肺轉(zhuǎn)移灶脫離的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入體循環(huán)，才能形成腦轉(zhuǎn)移可能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射組、胸腔注射組，裸鼠在顱腦轉(zhuǎn)移灶形成前，就因不堪肺臟及胸腔負(fù)瘤情況而出現(xiàn)惡病質(zhì)死亡，且兩組中裸鼠生存周期相比較長(zhǎng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。然而，左心室注射組裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)的時(shí)間明顯縮短，與臨床經(jīng)驗(yàn)相符，證明肺癌顱腦轉(zhuǎn)移嚴(yán)重縮短患者的生存周期。

此外，本實(shí)驗(yàn)選擇的是具有肺癌顱腦轉(zhuǎn)移潛能的PC-9細(xì)胞株，腫瘤轉(zhuǎn)移模型的建立有賴于高致瘤能力的腫瘤細(xì)胞，研究結(jié)果表明只有少數(shù)腫瘤細(xì)胞能夠引起腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移，而大部分并不具備轉(zhuǎn)移、侵襲能力，且對(duì)于同一惡性腫瘤而言，其細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移特性并不完全相同[23]。按照“種子與土壤”轉(zhuǎn)移學(xué)說的觀點(diǎn)，是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性與靶器官微環(huán)境相互作用的結(jié)果，也就是說，腫瘤轉(zhuǎn)移具有器官特異性，不同的腫瘤具有對(duì)不同靶器官不同的親和性，從而形成進(jìn)入動(dòng)脈系統(tǒng)形成特定器官的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24-25]。

關(guān)于左心室注射的方法：前期課題組先在小白鼠上實(shí)踐，考慮到與注射時(shí)間、接種細(xì)胞濃度（單細(xì)胞懸液1×108/mL）易栓塞有關(guān)，發(fā)現(xiàn)小白鼠有即時(shí)死亡或數(shù)小時(shí)或隔天死亡的現(xiàn)象；還有一些小白鼠在開胸后，考慮到注射時(shí)腫瘤細(xì)胞向胸腔或針管外漏可能，因此在胸腔內(nèi)出現(xiàn)了微小種植灶的現(xiàn)象。所以總結(jié)左心室注射心得如下：（1）注射器：選擇BD牌1 mL胰島素注射器。（2）體位擺放：仰臥位固定，保證心臟體表位置處皮膚充分舒展；最好保證每只裸鼠仰臥位舒展的體外相對(duì)一致，以保證進(jìn)針點(diǎn)的一致性。（3）進(jìn)針前準(zhǔn)備：進(jìn)針前調(diào)節(jié)好BD針頭至滯留空氣0.05 mL后，再吸取細(xì)胞懸液0.1 mL。（4）進(jìn)針點(diǎn)：仰臥位裸鼠胸前皮膚經(jīng)酒精消毒后，可以清晰暴露裸鼠肋骨各位置；于胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進(jìn)。（5）進(jìn)針角度：針尖斜面朝向腳端，與地面成30°～45°角，注意緩慢進(jìn)針。（6）進(jìn)針：以突然見到血液噴射為標(biāo)志，并在此時(shí)停止進(jìn)針；并盡可能快速地推動(dòng)注射器（10 s內(nèi)），細(xì)胞懸液快推完時(shí)，及時(shí)拔出，以免注入空氣；如果一次嘗試未見血液噴射，重新改變進(jìn)針點(diǎn)。目前，關(guān)于肺癌顱腦轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型相對(duì)較少，大家都在探索階段，對(duì)細(xì)胞株和注射途徑的選擇未形成共識(shí)。本實(shí)驗(yàn)選擇具有顱腦轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9，采用左心室注射途徑，建立肺癌顱腦轉(zhuǎn)移模型具有明顯的高轉(zhuǎn)移率。

綜上所述，對(duì)于肺癌顱腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立，經(jīng)左心室注射途徑，提供了一種可行的建模方法。