外施α-酮戊二酸對(duì)鹽脅迫下海濱錦葵生長(zhǎng)、碳氮磷養(yǎng)分積累及其計(jì)量關(guān)系的影響

吳雨露， 扈嘉鑫， 陳宇熙， 鄭炳松， 閆道良

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300）

土壤鹽漬化已成為制約植物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的主要環(huán)境問(wèn)題，研究植物對(duì)鹽漬化土壤的適應(yīng)機(jī)制并建立相應(yīng)的抗鹽調(diào)控技術(shù)對(duì)植物的生產(chǎn)至關(guān)重要。在諸多的抗鹽調(diào)控技術(shù)中，化學(xué)調(diào)控因其方式的可調(diào)控性和技術(shù)的綜合性而備受關(guān)注[1]。α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，KG）作為有機(jī)碳源物質(zhì)，能夠被植物直接吸收而進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在氮代謝中起著重要的作用。α-酮戊二酸是植物氨同化必需的碳架及信號(hào)分子，廣泛參與了植物碳（C）、氮（N）代謝的調(diào)節(jié)，是協(xié)調(diào)碳、氮兩大代謝系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)[2]。研究表明，外源施用α-酮戊二酸可以明顯提高水稻體內(nèi)氨同化酶的活性，同時(shí)銨吸收與同化能力也明顯加強(qiáng)，對(duì)植物氮代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)其對(duì)鹽漬逆境的適應(yīng)[3?4]。黃楠等[5]、吳婷婷等[6]的研究表明，外施一定水平的α-酮戊二酸可以顯著提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)。

海濱錦葵（Kosteletzkya virginica）是一種集油料、造紙、藥用、觀賞與改良鹽堿地生態(tài)環(huán)境為一體的重要經(jīng)濟(jì)耐鹽植物[7]，目前對(duì)海濱錦葵的研究主要集中在抗鹽生理及分子機(jī)制等方面[8-10]，關(guān)于海濱錦葵栽培調(diào)控的生理鮮有報(bào)道。α-酮戊二酸作為有機(jī)碳肥，能夠調(diào)節(jié)因植物“碳饑餓”導(dǎo)致C、N、磷（P）間的化學(xué)計(jì)量失衡，從而提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性。本課題組前期研究表明，氮虧缺是影響沿海灘涂海濱錦葵生長(zhǎng)發(fā)育的重要限制因子[11]。為此，本研究以海濱錦葵幼苗為材料，通過(guò)模擬鹽脅迫下施用有機(jī)碳肥α-酮戊二酸對(duì)海濱錦葵生長(zhǎng)及對(duì)C、N、P 養(yǎng)分吸收及其之間化學(xué)計(jì)量平衡關(guān)系的影響，以期為將來(lái)利用α-酮戊二酸調(diào)控鹽堿地植物的生長(zhǎng)及其對(duì)C、N、P 養(yǎng)分的吸收利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用海濱錦葵種子購(gòu)自江蘇鹽城鹽土農(nóng)業(yè)公司。供試塑料缽，規(guī)格為12 cm（直徑）×11 cm（高），購(gòu)自浙江卡爾生物技術(shù)有限公司。供試基質(zhì)河沙均為洗凈無(wú)雜質(zhì)河沙。試劑α-酮戊二酸(99.9%)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司，分析純；氯化鈉（NaCl）購(gòu)自浙江卡爾生物技術(shù)有限公司，主要成分為99.9%的NaCl，分析純。所用營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland 配方，配制所需對(duì)照及NaCl溶液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取當(dāng)年收獲、籽粒飽滿完好的海濱錦葵種子，表面消毒后溫室催芽，挑選萌發(fā)一致的種子播種于塑料缽內(nèi)，缽內(nèi)基質(zhì)為洗凈的河沙。出苗后每缽保留長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗5~7 株，待幼苗有3~4 片真葉完全展開(kāi)后，分別用0、5、15 g·L-1NaCl 溶液和0、10、20 mg?L-1α-酮戊二酸處理，共設(shè)置9 組處理，具體信息詳見(jiàn)表1。試驗(yàn)中每隔3 d 澆灌NaCl 溶液，直至其剛好從缽底流出，以盡可能減少鹽在基質(zhì)中的積累，保證基質(zhì)中鹽水平恒定；在鹽處理后的第2天，噴施α-酮戊二酸，使葉面完全濕潤(rùn)。每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)（5 個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽），共45 缽。所有處理的植物材料置于人工氣候箱內(nèi)，箱內(nèi)晝/夜溫度為（27±1）℃/（22±1）℃，相對(duì)濕度為60%~70%。處理45 d后，采樣測(cè)定并分析。

表1 試驗(yàn)組設(shè)置情況Table 1 Setting of experimental group

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

收獲的海濱錦葵根部泥沙用流動(dòng)自來(lái)水小心洗凈，再用蒸餾水沖洗2遍后于120 ℃烘箱中殺青20 min，轉(zhuǎn)至80 ℃烘干至恒重。用直尺測(cè)定株高(cm)，用千分之一電子秤稱量植株生物量(干重,mg)。根冠比、相對(duì)生長(zhǎng)率（%）、比葉重采用下面公式計(jì)算。用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定植物全碳含量[12]；采用硫酸-雙氧水消解，凱氏法測(cè)定植物中總氮含量；ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry)分析儀測(cè)定植物磷、鉀、鈉元素含量[13]，計(jì)量單位為g·kg-1DW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理間差異顯著性(P<0.05)采用Duncan 多重比較。指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson 分析。所有數(shù)據(jù)均是各處理平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-酮戊二酸處理對(duì)鹽脅迫條件下海濱錦葵生長(zhǎng)的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照相比，NaCl處理會(huì)顯著抑制海濱錦葵植株生長(zhǎng)，其株高和植株相對(duì)生長(zhǎng)率均顯著降低(P<0.05)。其中，15 mg?L-1NaCl 處理的株高僅為對(duì)照的42.82%。另外，施加α-酮戊二酸后并沒(méi)有明顯改善單鹽脅迫下海濱錦葵的株高和相對(duì)生長(zhǎng)率。

表2 不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵株高Table 2 Plant height of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate

2.2 α-酮戊二酸處理對(duì)鹽脅迫條件下海濱錦葵生物量積累的影響

由表3可知，與對(duì)照相比，單施α-酮戊二酸顯著提高了海濱錦葵的生物量，NaCl 鹽脅迫則顯著降低了其生物量（S5 處理除外）。鹽脅迫下，外施α-酮戊二酸增加了海濱錦葵的總生物量，但并沒(méi)有明顯緩解鹽對(duì)海濱錦葵生物量積累的抑制效應(yīng)。在NaCl 濃度為15 g?L-1處理下，外源噴施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了海濱錦葵的根生物量，是15 g?L-1NaCl 脅迫下的1.4 倍，說(shuō)明α-酮戊二酸促進(jìn)了高鹽脅迫下海濱錦葵根生物量的積累，這與該條件下海濱錦葵具有較高的根冠比相一致。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)外施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了5 g?L-1NaCl 脅迫下的海濱錦葵葉生物量，說(shuō)明噴施適宜水平的α-酮戊二酸有利于減緩鹽脅迫對(duì)植株葉生物量積累的抑制，這對(duì)植株碳同化正常功能的發(fā)揮有著重要的作用。

表3 鹽脅迫條件下不同α-酮戊二酸處理的海濱錦葵單株生物量、根冠比和比葉重Table 3 Biomass per plant， root shoot ratio and specific leaf weight of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

比葉重是反映植物光合能力的重要指標(biāo)。與對(duì)照相比，鹽脅迫顯著增加了海濱錦葵的比葉重，外施α-酮戊二酸后明顯提高了鹽脅迫下的比葉重，說(shuō)明海濱錦葵對(duì)鹽有一定的適應(yīng)性，外施α-酮戊二酸對(duì)提高葉的光合性能有重要的作用。

2.3 α-酮戊二酸處理對(duì)鹽脅迫條件下海濱錦葵C、N、P化學(xué)計(jì)量特征的影響

植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收與環(huán)境中養(yǎng)分的供應(yīng)有密切的關(guān)系，在養(yǎng)分供應(yīng)缺乏的情況下往往具有較高的養(yǎng)分利用效率。由表4 可見(jiàn)，與對(duì)照相比，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了植株的總C 含量，是對(duì)照的1.07 倍。在15 g?L-1NaCl 高鹽脅迫下，外施α-酮戊二酸對(duì)海濱錦葵總C 的積累具有顯著效果，是該鹽梯度（S15 處理）脅迫下的1.1 倍。外施α-酮戊二酸對(duì)海濱錦葵總N 含量有明顯的影響，即增加了植株的總N含量，尤其是20 mg?L-1α-酮戊二酸施加后，植株的總N含量顯著高于對(duì)照，是對(duì)照的1.04 倍；另外，外施10 mg?L-1α-酮戊二酸僅明顯提高了5 g?L-1NaCl 低鹽脅迫下海濱錦葵葉片的N 與P 含量。以上結(jié)果表明α-酮戊二酸對(duì)鹽脅迫下海濱錦葵葉片N、P含量的影響受到用量的影響。15 g?L-1NaCl 脅迫下，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著提高海濱錦葵的C/N 和C/P，說(shuō)明高鹽脅迫下施加適當(dāng)水平的α-酮戊二酸能顯著提高海濱錦葵對(duì)N、P的利用效率，產(chǎn)出更多的碳水化合物。10、20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著提高了15 g?L-1NaCl脅迫下海濱錦葵的N/P，與僅施加15 g?L-1NaCl 脅迫相比，差異明顯(P<0.05)，說(shuō)明α-酮戊二酸促進(jìn)了高鹽脅迫下海濱錦葵對(duì)磷的利用效率。

表4 鹽脅迫下不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉片碳、氮、磷化學(xué)計(jì)量特征Table 4 Stoichiometric characteristics of carbon， nitrogen and phosphorus in leaves of K. virginica plants treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.4 α-酮戊二酸處理對(duì)鹽脅迫條件下海濱錦葵Na+、K+含量的影響

由表5可見(jiàn)，外施α-酮戊二酸不同程度地提高了海濱錦葵葉片中的K+含量，其中，施加10 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了葉片K+含量，是對(duì)照處理的1.23倍。在5 g·L-1NaCl處理下，施加10 mg?L-1α-酮戊二酸顯著增加了葉片的K+含量，說(shuō)明α-酮戊二酸可以促進(jìn)鹽脅迫下葉片對(duì)K+的吸收。但是，只噴施α-酮戊二酸并沒(méi)有顯著影響葉片中Na+的含量；在5 g·L-1NaCl 低鹽脅迫下，施加20 mg?L-1α-酮戊二酸顯著降低了該鹽度脅迫下的Na+含量。對(duì)K+/Na+而言，只噴施α-酮戊二酸能顯著增加其比值，在鹽脅迫下施加α-酮戊二酸并沒(méi)有顯著影響K+/Na+比值。在鹽環(huán)境下，植物體內(nèi)維持相對(duì)較高且穩(wěn)定的K+/Na+是保證植物正常酶活性的必要條件，本試驗(yàn)中，α-酮戊二酸對(duì)于鹽脅迫的海濱錦葵沒(méi)有通過(guò)促進(jìn)K+/Na+值來(lái)提高植株對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)，這可能與海濱錦葵本身對(duì)一定含量的鹽具有較強(qiáng)的適應(yīng)性有關(guān)。

表5 鹽脅迫下α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉片Na+、K+含量及其化學(xué)計(jì)量特征Table 5 Na+， K+ contents and their stoichiometric characteristics in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

2.5 α-酮戊二酸處理對(duì)鹽脅迫條件下海濱錦葵各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要功能器官。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)的Na+、K+含量與C、N、P養(yǎng)分含量及其化學(xué)計(jì)量間的平衡對(duì)海濱錦葵的正常生長(zhǎng)發(fā)育極其重要。相關(guān)性分析（表6）發(fā)現(xiàn)，海濱錦葵葉片總N 與總P 呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與葉片N/P呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與葉K+/Na+呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；海濱錦葵葉片總P含量與Na+含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與葉K+含量呈極顯著正相關(guān)。葉片中N/P與K+/Na+呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在α-酮戊二酸處理下，葉片總N、總P的積累和平衡與環(huán)境中Na+對(duì)鹽生植物海濱錦葵生長(zhǎng)有協(xié)同作用。

表6 鹽脅迫下不同α-酮戊二酸處理下的海濱錦葵葉N、P、Na+、K+化學(xué)計(jì)量特征相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of stoichiometric characteristics of N， P， Na+， K+ in leaves of K. virginica treated with different concentration of α-ketoglutarate under salt stress

3 討論

α-酮戊二酸是植物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，參與細(xì)胞內(nèi)多種化學(xué)反應(yīng)，具有多種生理功能。對(duì)釀酒酵母的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，添加一定水平的α-酮戊二酸后，細(xì)胞的代謝活性增強(qiáng)，總抗氧化能力和氨基酸含量等指標(biāo)也得以提高[14]。對(duì)其他植物的研究也表明，外施α-酮戊二酸可以明顯提高植物體內(nèi)氨同化酶的活性，同時(shí)銨吸收與同化能力也得到明顯加強(qiáng)，對(duì)植物氮代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用[15?16]。同樣，外施一定水平的α-酮戊二酸對(duì)逆境下植物的生長(zhǎng)具有重要的正向調(diào)節(jié)作用。外施α-酮戊二酸增強(qiáng)了干旱脅迫下小麥氮代謝強(qiáng)度，減緩了干旱脅迫對(duì)小麥產(chǎn)量降低的影響，增強(qiáng)其對(duì)干旱逆境的適應(yīng)[17?18]。另外，外施α-酮戊二酸改善了小麥低氮脅迫下植株的生長(zhǎng)，促進(jìn)了逆境下小麥的氮代謝，提升了小麥的產(chǎn)量[19]。本研究表明，在鹽脅迫下外施α-酮戊二酸雖然增加了海濱錦葵的總生物量，但并沒(méi)有明顯緩解鹽對(duì)海濱錦葵生物量積累的抑制效應(yīng)，這可能與不同物種的生物學(xué)特性有關(guān)。在15 g?L-1鹽處理下，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸則明顯提高了海濱錦葵的根生物量，說(shuō)明α-酮戊二酸有利于海濱錦葵把更多碳物質(zhì)向根轉(zhuǎn)移，作為后備能源物質(zhì)儲(chǔ)存起來(lái)，以更好地維持鹽漬環(huán)境下生命的延續(xù)，研究結(jié)果為α-酮戊二酸提高鹽脅迫環(huán)境下海濱錦葵的適應(yīng)性機(jī)制提供了參考。

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素，植物通過(guò)積累更多的K+，以減輕Na+對(duì)植物的離子毒害[20?21]。本研究表明，外施α-酮戊二酸顯著提高了低鹽脅迫下（5 g·L-1NaCl）葉片的K+含量，但對(duì)K+/Na+的影響并不明顯，這可能與海濱錦葵具有一定的喜鹽性有關(guān)。同時(shí)，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸分別顯著增加了低鹽和高鹽脅迫下海濱錦葵的比葉重，說(shuō)明外施α-酮戊二酸有利于緩解鹽脅迫對(duì)葉片光合性能的抑制作用，從而有利于碳物質(zhì)合成和積累。C/N 和C/P 反映了植物對(duì)N、P的利用效率，效率越高，碳物質(zhì)的積累越多。本研究表明，外施20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著提高高鹽脅迫下（15 g·L-1NaCl）海濱錦葵的C/N 和C/P，說(shuō)明高鹽脅迫下施加適量的α-酮戊二酸能明顯提高海濱錦葵對(duì)N、P 的利用效率，增加了碳物質(zhì)的合成和積累，從而促進(jìn)了植株生物量的提高。

近年有研究表明，外施α-酮戊二酸不但可以提高動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的沉積和免疫能力[22]，而且α-酮戊二酸作為有機(jī)碳肥的研究與實(shí)踐利用也取得了一定的成果，它不但可以緩解逆境對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，而且在增產(chǎn)和提高植物品質(zhì)方面也得到了證實(shí)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施α-酮戊二酸后，海濱錦葵葉片總N 含量與K+/Na+呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，說(shuō)明噴施α-酮戊二酸后在促進(jìn)N 含量的同時(shí)，K+/Na+值也得到了提高，從而有利于維持鹽脅迫下葉片K+的平衡，緩解Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用。同時(shí)，N 與P 含量呈極顯著正相關(guān)，施加α-酮戊二酸后，在提高N含量的同時(shí)，也促進(jìn)了海濱錦葵對(duì)P的吸收利用，而植株吸收、積累一定量的P，有利于提高植株對(duì)逆境的適應(yīng)。

綜上所述，外源噴施α-酮戊二酸促進(jìn)了海濱錦葵植株的生物量積累。在低鹽（5 g·L-1NaCl）脅迫下，外施α-酮戊二酸顯著提高了植株的K+含量，增加了K+/Na+。其中，施加20 mg?L-1α-酮戊二酸可以顯著增加鹽脅迫下海濱錦葵的比葉重，說(shuō)明α-酮戊二酸對(duì)鹽脅迫下海濱錦葵的光合性能有較好地促進(jìn)作用。同時(shí)，α-酮戊二酸提高了葉片對(duì)N、P的利用效率，增強(qiáng)了碳物質(zhì)的合成。