沙門菌分子檢測方法的研究進(jìn)展

張 萍,莊林林,張 笛,董永毅,盛中偉,王成明,徐 步,竇新紅,龔建森*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,揚(yáng)州 225125;2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,句容 212400;3.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,南京 210036;4.奧本大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,奧本36849)

沙門菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌,常寄居在人和動(dòng)物體內(nèi),特別是家禽、家畜的腸道中。沙門菌主要通過污染食品進(jìn)而導(dǎo)致人類食物中毒,因而在公共衛(wèi)生方面具有重要意義[1]。全世界因沙門菌感染引起的食物中毒病例常年高居首位[2],其中非傷寒沙門菌感染約導(dǎo)致15.5萬人死亡,9 380萬人患病[3],中國每年的發(fā)病人數(shù)也超過300萬[4]。2015年,世界衛(wèi)生組織對(duì)全球食源性疾病的調(diào)查報(bào)告顯示,沙門菌發(fā)病數(shù)在22種細(xì)菌、病毒和原蟲疾病中排名第一[5]。

沙門菌屬包含腸道沙門菌(Salmonellaenterica)和邦戈?duì)柹抽T菌(Salmonellabongori)2個(gè)種,其中腸道沙門菌種又包含6個(gè)亞種[6]。此外,不同抗原型(菌體O抗原、鞭毛H抗原和莢膜Vi抗原)的沙門菌根據(jù)疾病類型(如雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌等)或首次發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)(如海德爾堡沙門菌、印第安納沙門菌、肯塔基沙門菌等)命名為特定的血清型(其中具有相同O抗原的血清型隸屬于同一血清群),目前報(bào)道的血清型種類已超過2 600種[7-8],沙門菌分類的復(fù)雜性無疑給檢測、分型、溯源等工作增加了難度。傳統(tǒng)沙門菌檢測方法包括增菌培養(yǎng)、選擇分離、生化鑒定和血清學(xué)分型等,通常耗時(shí)5～7 d,不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制病原的流行[9]。1992年,Rahn等[10]首次根據(jù)鼠傷寒沙門菌invA基因設(shè)計(jì)引物并建立PCR檢測方法,開創(chuàng)了沙門菌分子檢測的先河。此后,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及基因組數(shù)據(jù)的不斷豐富,基于沙門菌特異性核酸靶點(diǎn)的分子檢測方法的研究報(bào)道日益增多,目前可從沙門菌屬、種、血清群、血清型等多個(gè)層面分別進(jìn)行檢測[11]。

本文旨在對(duì)近三十年來國內(nèi)外報(bào)道的各類沙門菌分子檢測方法(包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光定量PCR、多重PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等)進(jìn)行總結(jié),并從屬、種、血清群、血清型等不同層面進(jìn)行梳理歸類,以期為沙門菌分子檢測方法的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 沙門菌分子檢測的研究背景

1.1 傳統(tǒng)檢測方法存在的問題

沙門菌的傳統(tǒng)檢測采用選擇性培養(yǎng)結(jié)合生化分析的方法,該方法要求樣品中細(xì)菌濃度需達(dá)到20～200 CFU·mL-1以上,靈敏度偏低[12];大多數(shù)樣品還需進(jìn)行增菌培養(yǎng)才能成功分離,操作繁瑣,周期較長;部分特殊樣品(如受高溫、高鹽、冷凍等處理)易出現(xiàn)“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”,難以通過傳統(tǒng)方法檢測;此外目前商品化的沙門菌選擇性培養(yǎng)基種類繁多,但每種培養(yǎng)基均可能存在難以培養(yǎng)的沙門菌血清型或菌株,因而至少需要同時(shí)使用2種以上培養(yǎng)基來提高分離效率,增加了檢測的難度和費(fèi)用。

1.2 沙門菌血清學(xué)分型存在的問題

沙門菌血清學(xué)分型結(jié)果可以為流行病學(xué)調(diào)查、病原溯源等提供重要依據(jù)。沙門菌血清學(xué)分型依賴特異性強(qiáng)的分型血清進(jìn)行凝集試驗(yàn),依據(jù)Kauffmann-White血清分型表可鑒定得到不同菌株的血清型[13-14]。但是該方法操作較為繁瑣復(fù)雜,效率較低,對(duì)分型血清質(zhì)量要求也較高,如果血清特異性不強(qiáng)極易產(chǎn)生交叉反應(yīng),進(jìn)而造成錯(cuò)誤分型[15],而且血清品種不全也會(huì)影響到分型的順利開展;此外,一些特殊狀態(tài)的細(xì)菌需處理后再進(jìn)行鑒定,如產(chǎn)生自凝的菌株,O抗原(H抗原)表達(dá)較弱的菌株等[16-17]。

1.3 沙門菌分子檢測方法的特點(diǎn)

基于沙門菌特異性核酸靶點(diǎn)建立的分子檢測方法(如常規(guī)PCR、熒光定量PCR、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等)已在病原快速檢測方面發(fā)揮重要作用。常規(guī)PCR技術(shù)根據(jù)沙門菌屬(型)等特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行體外擴(kuò)增,靈敏度高、特異性強(qiáng),簡單快速[11]。熒光定量PCR技術(shù)可在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中標(biāo)記和監(jiān)測PCR 產(chǎn)物,其檢測靈敏度和特異性優(yōu)于常規(guī)PCR[18]。多重PCR技術(shù)通過在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物,可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門菌的高通量檢測與快速分型,進(jìn)一步節(jié)省時(shí)間和成本[11,19]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在恒定溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸高效擴(kuò)增,相對(duì)于PCR技術(shù),操作簡單,對(duì)設(shè)備要求低,耗時(shí)更短[20]。

2 沙門菌分子檢測方法的研究進(jìn)展

2.1 沙門菌屬分子檢測方法

目前報(bào)道了很多沙門菌屬的特異性分子檢測方法(表1),此類方法的檢測靶點(diǎn)主要涉及沙門菌屬特有的毒力基因或看家基因,下面詳細(xì)介紹。

bcfD:沙門菌屬的一種保守菌毛基因,存在于已知所有血清型中,包括腸道沙門菌種和邦戈?duì)柹抽T菌種[60-61]。2014年,Zhuang等[24]針對(duì)bcfD設(shè)計(jì)引物建立了沙門菌屬LAMP檢測方法,對(duì)44株沙門菌的檢測結(jié)果均為陽性,而非沙門菌則全為陰性。

fim操縱子基因:fim基因簇編碼沙門菌I型菌毛,包含fimA等9個(gè)基因[62],目前,已有fimA、fimW和fimY報(bào)道作為沙門菌屬檢測靶點(diǎn)。fimA編碼菌毛主要亞單位蛋白,但沙門菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌fimA基因具有同源性,1996年,Cohen等[26]對(duì)fimA基因序列進(jìn)行研究,選取其中高特異性片段設(shè)計(jì)引物并建立PCR方法,能夠準(zhǔn)確區(qū)分376株沙門菌和34株非沙門菌,從而確定了fimA作為沙門菌屬特異性靶點(diǎn)的應(yīng)用功能。fimW和fimY都是調(diào)控基因,2014年,Zhang等[27]建立的fimW-PCR能夠?qū)⑹茉嚨?8株沙門菌與12株非沙門菌進(jìn)行區(qū)分;2002年,Yeh等[28]建立了fimY-PCR檢測方法,結(jié)果表明僅45株沙門菌可以擴(kuò)增出特異性條帶,而20株非沙門菌不能擴(kuò)增。

gyrB:是一種編碼細(xì)菌DNA回轉(zhuǎn)酶β亞基的看家基因,比16S rDNA具有更強(qiáng)的物種區(qū)分能力[63]。2011年,Ye等[30]通過分析gyrB基因序列,得到沙門菌特異性片段,經(jīng)PCR檢測所有被檢沙門菌均可擴(kuò)增得到366 bp的特異性產(chǎn)物。

hilA:編碼侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白,位于沙門菌致病性島1(SPI1),在沙門菌感染的過程中起著重要作用,在其它革蘭陰性菌中不存在[33]。2000年,Guo等[32]基于hilA設(shè)計(jì)了兩對(duì)PCR引物,其中HILA2可用于沙門菌特異性檢測。

hns:編碼DNA結(jié)合蛋白,與腸桿菌科其它屬細(xì)菌的基因序列差異較大,僅與大腸桿菌具有一定的同源性。1993年,Maciorowski等[37]在對(duì)沙門菌hns基因進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,成功建立了特異性PCR檢測方法,對(duì)所有受試沙門菌的檢測均為陽性。此外還有其它多個(gè)研究也使用該基因做為檢測靶點(diǎn)[64-65]。

invA:編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白,1992年,Rahn等[10]首次以invA基因?yàn)榘悬c(diǎn)建立了沙門菌PCR檢測方法,通過對(duì)630株沙門菌和142株非沙門菌進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)99.4%的沙門菌能夠檢測出特異性條帶,而非沙門菌則無法擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶或僅能擴(kuò)增出非特異性條帶,證明了invA廣泛存在各個(gè)血清型的沙門菌中,可作為沙門菌屬的候選檢測靶點(diǎn)。此后該基因一直被廣泛應(yīng)用于各種沙門菌分子檢測方法[38-39]。2018年,Yang等[29]對(duì)沙門菌LAMP檢測方法的統(tǒng)計(jì)表明,invA基因占比高達(dá)74%。

ompC:編碼外膜蛋白,是沙門菌及其它革蘭陰性菌主要的結(jié)構(gòu)蛋白。1996年,Kwang等[43]根據(jù)ompC序列設(shè)計(jì)引物建立PCR檢測方法,能夠成功區(qū)分60株沙門菌和42株非沙門菌。

oriC:是DNA的復(fù)制起點(diǎn),基于該基因建立的PCR檢測方法,可以將沙門菌與大腸桿菌等其它微生物進(jìn)行選擇性區(qū)分,已廣泛用于沙門菌屬檢測[47,66]。Fluit等[46]利用沙門菌B群特異性單克隆抗體和基于oriC的特異性PCR引物,建立磁性免疫聚合酶鏈反應(yīng)(MIPA),在大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌濃度分別107和101CFU的情況下,仍可檢測出樣品中鼠傷寒沙門菌。

phoP:是磷酸化調(diào)節(jié)子的一部分,調(diào)節(jié)沙門菌的毒力和巨噬細(xì)胞存活相關(guān)基因的表達(dá)[49]。Li等[50]對(duì)115株腸桿菌科的phoP序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)沙門菌屬phoP基因序列具有特異性,進(jìn)而建立了phoP-LAMP檢測方法,可準(zhǔn)確區(qū)分66株沙門菌和73株非沙門菌。

rRNA靶點(diǎn):包括16S rRNA 和16～23S rRNA靶點(diǎn)等。由于不同種的真細(xì)菌與古細(xì)菌間的16S rRNA基因的高度保守性,因而16S rRNA常被用于細(xì)菌的分類或種屬鑒定[67]。Lin和TSen[22,68]通過分析沙門菌16S rRNA基因保守序列,設(shè)計(jì)多條探針,其中以16S Ⅲ和16SF1為引物對(duì),建立了能特異性檢測沙門菌的PCR方法。16S rRNA與23S rRNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)也是一種rRNA,且不同細(xì)菌ITS長度和組成不同,因而也可以作為種屬鑒定的靶序列。2005年,Chiu等[21]通過比較沙門菌和非沙門菌ITS序列,成功設(shè)計(jì)引物建立PCR方法,并對(duì)40株沙門菌和48株非沙門菌進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

ttrRSBCA:該基因簇包含5個(gè)基因,位于沙門菌毒力島2(SPI2)附近,ttrA、ttrB和ttrC編碼四硫代還原酶結(jié)構(gòu)蛋白,ttrS和ttrR編碼雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的傳感器和響應(yīng)調(diào)節(jié)器組件。分子雜交結(jié)果表明,該操縱子存在于所有腸道沙門菌種和邦戈?duì)柹抽T菌種的菌株。2004年,Malorny等[56]首次以ttrRSBCA為靶點(diǎn)建立實(shí)時(shí)PCR方法,成功區(qū)分了110株沙門菌和87株非沙門菌。

此外,還有一些沙門菌屬分子檢測方法,涉及的靶點(diǎn)如組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因hisJ[36]、inv基因簇侵襲相關(guān)基因invE[40]、插入元件IS200[42]、質(zhì)粒毒力相關(guān)基因spv[54]和腸毒素基因stn[55]等。

2.2 沙門菌種分子檢測方法

沙門菌屬包括腸道沙門菌種和邦戈?duì)柹抽T菌種[6],目前只有關(guān)于腸道沙門菌種分子檢測方法的報(bào)道。iroB是鐵調(diào)節(jié)蛋白基因,1997年B?umler等[69]通過Southern雜交發(fā)現(xiàn),iroB存在于腸道沙門菌種的所有亞種中,但在邦戈?duì)柹抽T菌種和其它腸桿菌科細(xì)菌中均不存在。針對(duì)iroB建立的一種腸道沙門菌PCR檢測方法,應(yīng)用于197株細(xì)菌的檢測,僅腸道沙門菌出現(xiàn)陽性條帶。

2.3 沙門菌血清群分子檢測方法

沙門菌根據(jù)O抗原的差異可分為46個(gè)血清群[1],其中以A、B、C、D和E群最為常見,而目前報(bào)道的分子檢測方法也主要用于鑒定以上常見血清群。沙門菌血清群檢測靶點(diǎn)主要針對(duì)參與合成O抗原的編碼基因,這些基因通常聚集在rfb基因簇上。

rfb基因簇:包括rfb、wzx和wzy等。rfb編碼糖基合成酶和轉(zhuǎn)移酶,用于合成和組裝O抗原。1993年Luk等[70]根據(jù)rfbJ(B)、rfbJ(C2)和rfbS(D)設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物,在總共123個(gè)測試的臨床分離物中準(zhǔn)確鑒定了屬于血清群B、C2和D(A)群的所有40株沙門菌。但該方法不能鑒定血清群C1,且由于血清群A和D的靶基因僅有一個(gè)核苷酸堿基不同,同源性極高,難以區(qū)分。wzx(rfbX)編碼一種具有12個(gè)跨膜片段的膜蛋白,負(fù)責(zé)將O抗原單位從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞周質(zhì)中[71-72]。2007年Herrera-Len等[73]利用wzx-mPCR成功區(qū)分了沙門菌血清群B、C1、C2、D和E的分離株。wzy編碼O抗原聚合酶,負(fù)責(zé)將細(xì)胞周質(zhì)中的O抗原單位聚合在周質(zhì)表面。2007年Fitzgerald等[7]將沙門菌的rfb基因簇中的abe、wzx、wzy等基因作為檢測靶點(diǎn),可以區(qū)分血清群A(D)、B、C1、C2、E和O13的菌株。

IS200/IS1351:IS200和IS1351屬于沙門菌插入基因,研究表明沙門菌D(O9)群菌株與其它血清群相比,其序列中包含一段IS200/IS1351聯(lián)合序列,因此可將該聯(lián)合序列作為D(O9)群的檢測靶點(diǎn)。2008年Okamura等[74]以IS200/IS1351聯(lián)合序列為靶點(diǎn),成功建立了特異性檢測D(O9)群的LMAP方法。

2.4 沙門菌血清型分子檢測方法

以腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌等為代表的沙門菌血清型是目前流行最廣泛的病原,能夠感染人和各類動(dòng)物,引起各種沙門菌病,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。這里將主要介紹此類流行性較廣泛的血清型[75-100](表2)。

表2 沙門菌血清型分子檢測方法

2.4.1 腸炎沙門菌 腸炎沙門菌的相關(guān)研究較多,主要靶點(diǎn)如下。

prot6E:屬于沙門菌菌毛蛋白編碼基因。2006年Clavijo等[101]研究腸炎沙門菌在蛋清中存活相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)腸炎沙門菌特異性基因:prot6E和SEN4287。Cornelia和Reiner[77]以prot6E為靶點(diǎn)建立的實(shí)時(shí)PCR,能夠準(zhǔn)確鑒定95%(75/79)的腸炎沙門菌,而其它54個(gè)血清型(119株)非腸炎沙門菌均沒有檢出。

sdfI與lygD:sdfI編碼沙門菌差異性基因片段I,常作為靶點(diǎn)用于腸炎沙門菌分子檢測方法的建立[78],但該基因與都柏林沙門菌同源性較高,需要進(jìn)一步截取高特異性片段作為檢測靶點(diǎn)。lygD是sdfI基因片段中一段高特異性序列,僅存在于腸炎沙門菌,所有非腸炎沙門菌血清型均不含有該基因,Xiong等[76]利用上述基因成功建立了區(qū)分不同D群血清型的多重PCR方法。

sefA:編碼SEF14菌毛主要亞單位結(jié)構(gòu)蛋白基因。1996年,Woodward等[79]首次以該基因?yàn)榘悬c(diǎn)建立PCR法用于腸炎沙門菌的檢測。但該基因也存在于雞傷寒等少數(shù)D群血清型中,Gong等[102]建立了以該基因?yàn)榘悬c(diǎn)的LAMP法用于檢測腸炎沙門菌和雞傷寒沙門菌,進(jìn)一步的區(qū)分可通過菌落形態(tài)特征。

2.4.2 鼠傷寒沙門菌 主要靶點(diǎn)包括蘋果酸脫氫酶編碼基因mdh和多種未知功能基因。

mdh:蘋果酸脫氫酶編碼基因,是三羧酸循環(huán)的一種酶,普遍存在于各種生物體中。1999年Lin和Tsen[84]將鼠傷寒沙門菌和其它細(xì)菌的mdh基因序列進(jìn)行比較,成功建立了能特異性擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌的PCR方法。對(duì)所有鼠傷寒沙門菌均可擴(kuò)增出261 bp的產(chǎn)物,而其它血清型和非沙門菌菌株均未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

除上述基因外,目前還報(bào)道多種未知功能基因,包括STM0159、STM4200、STM4492、STM4495、STM4497等[81-82,85-87],其中STM4497使用頻率最高。2006年Kim等[87]通過比較基因組學(xué)方法獲得10個(gè)鼠傷寒沙門菌特異性基因,分別設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR驗(yàn)證,最終確定STM4497特異性最高,此后該基因被多次用于鼠傷寒沙門菌的檢測靶點(diǎn)[4,103]。

2.4.3 雞白痢/雞傷寒沙門菌 雞白痢和雞傷寒沙門菌屬于無運(yùn)動(dòng)性沙門菌。由于雞白痢、雞傷寒沙門菌的cigR和flhB序列比其它血清型沙門菌短,利用該特點(diǎn),以cigR或flhB為檢測靶點(diǎn),可進(jìn)行無運(yùn)動(dòng)性沙門菌的檢測[76,93-94]。此外由于雞白痢、雞傷寒沙門菌都不具有運(yùn)動(dòng)性,且在抗原型、病原學(xué)、流行病學(xué)和臨床癥狀等多方面具有相似性,難以通過常規(guī)的診斷或血清學(xué)方法進(jìn)行區(qū)分[104],因此分子檢測方法至關(guān)重要。目前已報(bào)道了多種分子鑒別方法,涉及fimH、fliC、glgC、ratA、rfbS和speC等檢測靶點(diǎn),其中基于glgC與speC可變區(qū)的二重PCR和基于ratA可變區(qū)的PCR均具有良好的特異性[104]。

2.4.4 基于fliC基因靶點(diǎn)的血清型檢測fliC編碼沙門菌鞭毛抗原。沙門菌屬具有兩相鞭毛抗原,第1相稱為特異相,采用小寫字母a、b、c……z1、z2、z3、……z88表示,為部分血清型特有;第2相稱為非特異相,采用阿拉伯?dāng)?shù)字1、2……7表示,為許多沙門菌共有[105]。沙門菌鞭毛基因高變區(qū)通常具有獨(dú)特的核苷酸序列,在沙門菌各血清型中呈多樣性,目前已成功應(yīng)用于甲型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌等的檢測[75,88,98,100]。

Zhou等[98]基于甲型副傷寒鞭毛基因fliC-a建立的PCR檢測方法檢測結(jié)果與血清檢測結(jié)果一致,但使用的樣品量僅有常規(guī)方法的一半。Pai?o等[75]根據(jù)鼠傷寒沙門菌鞭毛基因fliC-c高變區(qū)(794—1 226)設(shè)計(jì)引物,建立多重PCR方法,對(duì)所有鼠傷寒沙門菌均檢測出目的片段,而其它血清型及非沙門菌則沒有擴(kuò)增條帶,表明鼠傷寒沙門菌fliC-c高變區(qū)可作為其檢測靶點(diǎn)。傷寒沙門菌鞭毛抗原fliC-d,基因全長1 530 bp,其中d抗原Ⅵ區(qū)(969—1 077)具有高度特異性。Song等[88]以fliC-d為傷寒沙門菌檢測靶點(diǎn),建立的PCR檢測方法成功區(qū)分了傷寒病例樣本和健康者樣本。Chiu等[100]比較了豬霍亂沙門菌與其它血清型及非沙門菌屬腸桿菌科細(xì)菌的fliC基因序列,成功建立PCR檢測方法。該方法結(jié)合viaB靶點(diǎn)能將豬霍亂沙門菌與其它細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。

2.4.5 其它血清型 除上述常見血清型外,其它部分血清型也成功篩選到特異性靶點(diǎn)并建立了分子檢測方法,如印第安納沙門菌(A7P63_09100、A7P63_13850和MG752992)[95-97]、海德爾堡沙門菌(ACF69659)[80]、傷寒沙門菌(tyv、STBHUCCB_38510、STY1599、STY2879和STY4669)[81,89-92]、乙型副傷寒沙門菌(SPAB_01124)和嬰兒沙門菌(M.sinI)等[81,99]。但這些基因的功能往往沒有得到鑒定,其應(yīng)用也不夠廣泛,還需進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

3 討 論

根據(jù)沙門菌的分類特點(diǎn),可將分子檢測方法分為四類,即沙門菌屬、腸道沙門菌種、沙門菌血清群和沙門菌血清型。其中沙門菌屬和沙門菌重要血清型的分子檢測方法報(bào)道最多,其應(yīng)用也最廣泛。

沙門菌屬分子檢測方法的靶點(diǎn)主要涉及抗原決定簇、外膜蛋白、DNA結(jié)合蛋白和毒力相關(guān)基因等。這些基因中有些在個(gè)別沙門菌血清型中缺失,會(huì)引起假陰性的結(jié)果,需要特別注意,如invA[106];也有些基因普遍存在于腸桿菌科細(xì)菌中,易發(fā)生交叉反應(yīng),出現(xiàn)假陽性結(jié)果,如fimA和ompC[106-107]。為找到最合適的檢測靶點(diǎn),多個(gè)報(bào)道曾對(duì)這些基因的特異性進(jìn)行了比較與評(píng)價(jià)。如Endley等[108]比較了fimA和hns引物的特異性,結(jié)果顯示hns引物可對(duì)梭菌非特異性擴(kuò)增,而fimA引物特異性更強(qiáng)。Malorny等[106]評(píng)估了ompC、oriC和invA等,結(jié)果表明invA在沙門菌PCR檢測方面更加有效。Shabarinath等[64]比較了hns、invA和invE,其中hns的檢測效率優(yōu)于invA和invE。不同報(bào)道選擇的基因不同,使用的血清型和菌株不同,得到的最優(yōu)靶點(diǎn)也不同,但沒有報(bào)道所選擇的全部基因均是最優(yōu)靶點(diǎn),因此選擇沙門菌屬特異性檢測靶點(diǎn)建立分子檢測方法時(shí),可以多選幾種進(jìn)行分析驗(yàn)證。

沙門菌血清型分子檢測方法針對(duì)的靶點(diǎn)主要是基于比較基因組學(xué)方法分析所獲得,其中很多為功能未注釋的基因。本文整理了11個(gè)血清型共計(jì)36個(gè)檢測靶點(diǎn),其中超過一半的基因功能未注釋。由于目前分析時(shí)所用的基因組數(shù)據(jù)量較大,往往具有較好的特異性。其中有些是經(jīng)典的靶點(diǎn),如鼠傷寒沙門菌的STM4497[87]。fliC是沙門菌另一比較重要的血清型檢測靶點(diǎn),其編碼的鞭毛抗原是劃分沙門菌血清型的重要依據(jù),根據(jù)高變區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,可進(jìn)行不同血清型的鑒定[75,88,98,100],但fliC單獨(dú)使用時(shí)不能區(qū)分某些具有相同O抗原的血清型(如豬霍亂沙門菌與丙型副傷寒沙門菌),此時(shí)需要結(jié)合其它靶點(diǎn)才能有效區(qū)分[100]。多個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合使用的情況還出現(xiàn)在屬和型的檢測,如Khaltabadi等[109]進(jìn)行鼠傷寒沙門菌鑒定時(shí)結(jié)合使用了屬特異性靶點(diǎn)invA和型特異性靶點(diǎn)mdh。因此,為進(jìn)一步提高沙門菌分型的特異性與敏感性,建議可同時(shí)選擇兩種以上的檢測靶點(diǎn)來建立分子檢測方法。

目前關(guān)于腸道沙門菌種和血清群的分子檢測方法報(bào)道數(shù)量有限。由于邦戈?duì)柹抽T菌常見于冷血無脊椎動(dòng)物,很少引起溫血?jiǎng)游锷抽T菌病例[110],因此相關(guān)研究較少,目前僅報(bào)道了針對(duì)iroB靶點(diǎn)的腸道沙門菌種特異性分子檢測方法[69]。而沙門菌血清群的分子檢測方法主要針對(duì)幾種參與合成O抗原的編碼基因(如rfb、wzx和wzy等)[7,70-71]。

自2003年人類基因組計(jì)劃完成之后,基因測序技術(shù)發(fā)展迅猛,尤其當(dāng)2005年第一臺(tái)高通量測序儀454推出后,全基因組測序技術(shù)飛躍發(fā)展,細(xì)菌全基因組測序也在不斷完成[111]。采用比較基因組學(xué)方法發(fā)掘新檢測靶點(diǎn)的研究應(yīng)運(yùn)而生,并發(fā)現(xiàn)了越來越多的沙門菌新檢測靶點(diǎn)[96,112]。相信隨著分子生物學(xué)研究的持續(xù)深入,更多、更可靠的沙門菌分子檢測方法將會(huì)應(yīng)用于臨床檢測中。