pH 對箭筈豌豆白蛋白和球蛋白物化性質(zhì)的影響

王宇慧，張金鳳，李昊坤，王立昊，劉全蘭,

（1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東青島 266045；2.中國海洋大學食品科學與生物工程學院，山東青島 266003）

豆科（Leguminosae）植物可固定空氣中的氮，在土壤養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。同時，豆科植物蛋白是人類食品中蛋白的重要來源之一，它們已被越來越廣泛地應用在食品加工的各個領(lǐng)域。箭筈豌豆（common vetch，Vicia sativaL.）是一年生牧草綠肥豆科植物，在我國四川、甘肅等省份被廣泛種植。箭筈豌豆種子中蛋白含量高，除蛋氨酸外，其余必須氨基酸含量均遠超過FAO/WHO 規(guī)定的成年人的需求量，優(yōu)勢氨基酸是天冬氨酸（10.03%～10.73%）和谷氨酸（16.78%～17.85%），精氨酸含量為8.69%～9.54%[1]。Ribeiro 等[2]的研究表明箭筈豌豆種子中白蛋白占粗蛋白含量的43.6%，球蛋白占50.8%。Chen 等[3]的研究表明箭筈豌豆種子中粗蛋白含量為27.70%～32.14%，其主要組成成分為白蛋白和球蛋白，白蛋白在粗蛋白中的含量為26.79%～56.12%，球蛋白的含量為22.78%～52.42%。箭筈豌豆蛋白在中性pH 下具有良好的溶解性、乳化性和起泡性，是一種具有潛力的天然食品乳化劑，可作為配料應用于飲料、肉制品和焙烤制品中[4]。但是對箭筈豌豆蛋白的研究并不多，對改性箭筈豌豆蛋白的研究報道更是較少見。

在食品中添加改性蛋白可以增強其功能特性[5]，pH 處理是一種常見且效果顯著的改性方法，這種方法不僅能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還能改善其功能性質(zhì)。如，米糠蛋白經(jīng)過pH 堿性處理后，其二級結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o序，這使得米糠蛋白的持油性得到顯著改善[6]；pH 處理可影響大豆11S 球蛋白的結(jié)構(gòu)、蛋白溶解性：可使蛋白二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)從β-折疊和無規(guī)卷曲向α-螺旋轉(zhuǎn)變[7]；黑豆分離蛋白在堿性條件下的溶解度更高，乳化穩(wěn)定性也增加[8]?？梢?，當?shù)鞍踪|(zhì)暴露在不同pH 條件下時，其組成、表面疏水性等結(jié)構(gòu)特征會發(fā)生變化，這可以顯著改善植物蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)。當前箭筈豌豆蛋白理化功能特性是在中性pH 條件下開展的研究，其結(jié)果具有一定的局限性。為了更好的將箭筈豌豆蛋白應用于食品行業(yè)，本文探索了箭筈豌豆主要儲藏蛋白白蛋白和球蛋白在不同pH 下的物化性質(zhì)變化，通過pH的變性調(diào)控以拓展和改善箭筈豌豆蛋白的功能性質(zhì)，這可使箭筈豌豆蛋白更加適應市場需求，并使之逐漸成為一種新興的植物蛋白。

本文采用紅外光譜、熒光分光光度法、Zeta-電位、聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法研究pH 對箭筈豌豆白蛋白和球蛋白結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)的影響，以期這些研究結(jié)果為箭筈豌豆蛋白在食品領(lǐng)域的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

箭筈豌豆種子（川北） 四川本地品種；大豆油 山東魯花集團有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、甲醇、無水乙醇、冰醋酸 國藥集團化學試劑有限公司；蛋白Marker、4×蛋白上樣緩沖液（還原和非還原）、透析袋（MD77-14000）、考馬斯亮藍R-250北京索萊寶科技有限公司；1.8-苯胺萘磺酸鹽（ANS）、甘氨酸 上海麥克林生化科技有限公司；所有試劑均為分析純。

SIGMA 3K15 冷凍離心機 德國Sigma 公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機 上海比朗儀器有限公司；PHS-25 型數(shù)顯pH 計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550 紫外分光度計 日本島津公司；FJ-200 高速剪切機 上海標本模型廠；DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司；TYYC-Ⅱ脫色搖床 無錫久平儀器有限公司；GelSMART凝膠成像系統(tǒng) 大龍興創(chuàng)實驗儀器；FL970 熒光分度計 上海泰科儀器有限公司；NanoZS90 動態(tài)光散射儀 英國Malvern 公司；VERTEX70 傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CVAP 和CVGP 的制備 參考Osborne 分級分離法[9]并做適當修改。稱取100 g 箭筈豌豆種子在25 ℃水浴2 h，待豆子泡軟后加入500 mL 去離子水打漿，用220 目濾布濾出溶液并收集，室溫下磁力攪拌4 h。之后在室溫下6000×g 離心10 min，收集上清液，此時上清液中的蛋白質(zhì)為箭筈豌豆白蛋白（CVAP）。將離心后的沉淀與500 mL 的5% NaCl混合，室溫下磁力攪拌4 h，之后在室溫下6000×g 離心10 min，收集上清，此時上清液中的蛋白質(zhì)為箭筈豌豆球蛋白（CVGP）。得到的上清液均放置在4 ℃冰箱中冷沉過夜。后用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH（白蛋白上清液調(diào)節(jié)至pH3.5 左右，球蛋白上清液調(diào)節(jié)至pH4.5 左右），在4 ℃下8000×g 離心10 min，收集沉淀分散于去離子水中，并用1 mol/L NaOH 調(diào)pH至7.0。將蛋白溶液倒入透析袋中，在4 ℃下透析48 h，隨后冷凍干燥，并將干燥后的蛋白樣品（經(jīng)凱氏定氮測定CVAP 純度為69.15%，CVGP 純度為93.66%）置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 不同pH 下CVAP 和CVGP 的制備 分別配制1%（w/v）的CVAP 和CVGP 溶液，渦旋振蕩10 min。分別用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)其為pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0、pH13.0（使用pH 計測定溶液pH）。配好的蛋白溶液在25 ℃磁力攪拌2 h 后，在室溫下8000×g 離心10 min，取上清液備用。部分上清液冷凍干燥成固體樣品，留做后續(xù)實驗。

1.2.3 二級結(jié)構(gòu)的測定 采用衰減全反射法（Attenuated Total Reflectance，ATR）[10]進行傅里葉變換紅外光譜掃描分析，測定箭筈豌豆白蛋白和球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。凍干蛋白樣品放于ATR（ZnSe）附件上進行紅外光譜全波段掃描（400～4000 cm-1），掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1，每個樣品平行測定三次。用儀器自帶軟件對圖譜進行基線校正，平滑處理。用Peakfit v4.12 軟件進行GAUSS 去卷積以及二階導數(shù)擬合直至R2不變?yōu)橹?。記錄各個子峰面積百分比，進而計算各部分二級結(jié)構(gòu)含量[11]。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）分析 參照Laemmli[12]的方法對CVAP 和CVGP 進行還原性和非還原性的SDSPAGE 電泳分析，1%蛋白溶液與上樣緩沖液以1:2 的比例混合，煮沸5 min 后離心。還原條件下，上樣緩沖液中加入5%β-巰基乙醇。采用質(zhì)量濃度分別為12%的分離膠和5%的濃縮膠，每個泳道上樣量為10 μL，在80 V（濃縮膠）和120 V（分離膠）的電壓下進行電泳。電壓結(jié)束后用0.1%的考馬斯亮藍R250 染色，用脫色液脫色，用GelSMART 拍照分析。

1.2.5 表面疏水性的測定 參考Kato 等[13]的方法并稍作修改測定表面疏水性。將pH 處理后的蛋白溶液分別稀釋到0.05～0.2 mg/mL 的濃度梯度。取4 mL 稀釋后的蛋白溶液加入20 μL 8.0 mmol/L ANS溶液，混勻，避光反應15 min。在390 nm 的激發(fā)波長和480 nm 的吸收波長下，采用FL970 熒光分度計測定不同濃度蛋白樣品的熒光強度，以熒光強度作為縱坐標，蛋白濃度作為橫坐標做直線，其斜率即為表面疏水性。

1.2.6 Zeta-電位的測定 參考Deng 等[14]的方法測定Zeta-電位。將pH 處理后的蛋白溶液分別稀釋到0.1%，采用NanoZS90 動態(tài)光散射儀測定蛋白樣品的電位，上樣體積為1 mL，每個樣品平行測定三次。

1.2.7 溶解度的測定 參考Deng 等[14]方法測定溶解度。采用考馬斯亮藍法測定處理后的蛋白質(zhì)上清液中可溶性蛋白的含量。溶解度的計算公式為：

1.2.8 乳化性的測定 參考Deng 等[14]方法測定乳化性。取10 mL 處理后的蛋白溶液，加入5 mL 大豆油。用高速剪切機以20000 r/min 乳化2 min。分別在0 min 和30 min 時測定其乳化層的吸光度。具體方法如下：取25 μL 乳化層的蛋白溶液加入到試管中，再加入5 mL 0.1% SDS 溶液，在500 nm 處測定其吸光度值。乳化性的計算公式為：

式中：C 為蛋白質(zhì)初始濃度，mg/mL；φ為光路，1 cm；θ為油體積分數(shù)，0.25；D 為稀釋系數(shù)，200；A0和A1是0 和30 min 的吸光度，Δ t 為間隔時間，30 min。

1.2.9 起泡性的測定 參考Deng 等[14]方法測定起泡性。取10 mL 處理后的蛋白溶液，用均質(zhì)機以20000 r/min 均質(zhì)4 min，分別記錄0 min 和30 min時的泡沫體積。起泡性的計算公式為：

式中：V 為原始溶液體積，mL；V0為0 min 蛋白溶液體積，mL；V1為30 min 蛋白溶液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2018 和SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，使用OPUS 7.2 和Peakfit v4.12 軟件對紅外圖譜及數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對CVAP 和CVGP 二級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)常用傅里葉紅外光譜進行分析，其紅外吸收光譜主要是由一系列酰胺吸收帶組成，酰胺Ⅰ帶的1700～1600 cm-1吸收帶對于研究二級結(jié)構(gòu)最有價值[15]，但是酰胺Ⅰ帶難以區(qū)分譜峰重疊的α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；酰胺Ⅲ帶1220～1330 cm-1的吸收帶可以更好地區(qū)分α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[16]。因此，CVAP 和CVGP 參照酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的規(guī)律來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[17]。

從表1 中可以看出，CVAP 含有豐富的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。隨著pH 的增加，靠近等電點時，α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低，pH 為4.0 時，α-螺旋含量為40.94%±0.41%，β-折疊含量為26.08%±0.13%；遠離pH4.0 時，呈現(xiàn)相反趨勢。CVAP 遠離等電點時，pH 變性處理使蛋白分子展開而暴露出其內(nèi)部的疏水基團，疏水作用、氫鍵、二硫鍵等相互作用影響了α-螺旋、β-折疊的含量，表現(xiàn)出α-螺旋含量降低和β-折疊含量升高的趨勢[6]。β-轉(zhuǎn)角在pH4.0時含量為12.97%±0.13%，當pH 為2.0 和3.0 時，β-轉(zhuǎn)角含量降低。這說明蛋白亞基在此pH 條件下易發(fā)生解離，這導致CVAP 結(jié)構(gòu)柔性發(fā)生變化，CVAP相應部位的構(gòu)象將更穩(wěn)定。當pH 為5.0～13.0 時，β-轉(zhuǎn)角含量低于或高于pH4.0的β-轉(zhuǎn)角。這說明蛋白亞基在此pH 范圍下發(fā)生了波動性的解離，這導致CVAP 結(jié)構(gòu)柔性發(fā)生波動性的變化。

表1 pH 對CVAP 二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of pH on the secondary structure of CVAP

從表2 中可以看出，相同pH 下，CVGP 中α-螺旋含量低于CVAP 中含量，β-折疊及無規(guī)卷曲含量高于CVAP 中含量。CVGP 處于遠離等電點的極端pH 環(huán)境時，表現(xiàn)出α-螺旋含量增加和β-折疊含量減少的趨勢，這不同于CVAP 二級結(jié)構(gòu)的變化，由此推測，CVAP 和CVGP 的二級結(jié)構(gòu)在pH 變化下?lián)碛胁煌淖兓?guī)律。CVGP 中β-轉(zhuǎn)角在pH5.0 時含量為12.59%±0.13%；pH 為6.0～13.0 時（pH9.0 除外），β-轉(zhuǎn)角含量高于pH5.0 時的含量，這說明CVGP蛋白亞基易發(fā)生解離，這可導致CVGP 結(jié)構(gòu)柔性發(fā)生變化，相應部分構(gòu)象變得不穩(wěn)定；pH 為9.0 時，β-轉(zhuǎn)角含量低于等電點，可能是此pH 易導致蛋白亞基解離或其他未知原因?qū)е麓爽F(xiàn)象。

表2 pH 對CVGP 二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of pH on the secondary structure of CVGP

2.2 pH 對CVAP 和CVGP 組成成分的影響

CVAP 的主要組成成分為7S 亞基，伴有少量的11S；CVGP 的主要組成成分為11S 亞基，伴有少量的7S[5]。它們的組分特征隨pH 的變化結(jié)果如圖1所示。pH 處于等電點附近，即CVAP 在pH4.0 附近時，CVGP 在pH5.0 附近時，蛋白多以聚集體沉淀物的形式存在，蛋白質(zhì)溶解度低（圖4），這導致溶液中的蛋白質(zhì)含量低而難以在SDS-PAGE 膠上顯現(xiàn)。pH遠離等電點時，蛋白質(zhì)溶解度變大，CVAP 和CVGP在SDS-PAGE 膠上出現(xiàn)明顯的條帶。pH13.0 時，蛋白條帶彌散，這表明極端強堿處理導致CVAP 和CVGP 的解聚，蛋白分子的解聚進一步導致了蛋白結(jié)構(gòu)的變化[18]。

圖1 不同pH 下的CVAP 和CVGP 的SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE of CVAP and CVGP at different pH values

如圖1A 所示，在非還原條件下，CVAP 的主要條帶出現(xiàn)在43.0～66.2 kDa 之間，還有少量條帶位于22.0 kDa 和31.0～43.0 kDa 之間；pH2.0 時，這些條帶的亮度高于其他pH。如圖1B 所示，還原條件下，CVAP 的條帶分別出現(xiàn)在22.0 kDa、31.0～66.2 kDa之間；與非還原條件相比，22.0 kDa 和31.0～43.0 kDa之間的條帶顏色加深，而43.0～66.2 kDa 之間的條帶顏色變淺，這說明CVAP 中少量11S 亞基的二硫鍵在還原條件下打開。結(jié)合CVAP 的溶解性（圖4），pH2.0 和pH8.0 條件下蛋白溶解度相似，它們的蛋白圖譜在還原性SDS-PAGE 膠上相似（圖1B 的泳道1 和7），但它們的蛋白圖譜在非還原性SDS-PAGE膠上不同（圖1A 的泳道1 和7）。這說明CVAP 中11S 亞基的二硫鍵易在酸性環(huán)境下解開形成類似于7S 亞基的分子量成分（22.0 kDa 和31.0～43.0 kDa）。CVGP 的蛋白組分不同于CVAP（圖1C 和D）。如圖1C 所示，在非還原條件下，CVGP 的條帶均出現(xiàn)在43.0～66.2 kDa 之間（pH2.0、3.0 和12.0 除外）；在還原條件下（圖1D），43.0～66.2 kDa 之間的條帶顏色變淺，22.0 kDa 和31.0～43.0 kDa 之間出現(xiàn)了明顯條帶，這說明11S 亞基43.0～66.2 kDa 之間的蛋白分子的二硫鍵被打開。

2.3 pH 對CVAP 和CVGP 理化性質(zhì)的影響

2.3.1 pH 對CVAP 和CVGP 表面疏水性的影響 pH改變了CVAP 和CVGP 的分子組成，其一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)和分子柔性也會發(fā)生變化。因此，CVAP和CVGP 表面暴露的疏水基團也會發(fā)生改變，這將導致它們表面疏水性的改變。pH 還會影響蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電離作用、溶解性及其他功能性質(zhì)，這些因素也會影響蛋白質(zhì)表面疏水性[14]。CVAP 和CVGP表面疏水性隨pH 變化趨勢如圖2 所示。pH 使CVAP 的表面疏水性呈現(xiàn)出波動性變化，pH2.0 處的表面疏水性最高（57911.0），pH4.0 時的表面疏水性最低（2492.4）。與其他pH 下的蛋白分子量相比，pH2.0 時，CVAP 高級結(jié)構(gòu)打開并形成含量近似一致的小分子量的亞基（圖1A），這使得蛋白質(zhì)表面出現(xiàn)更多的疏水基團，并且在pH2.0 的溶解度下，CVAP濃度可能更有利于其疏水結(jié)構(gòu)形成[19]。pH 在等電點時的表面疏水性表現(xiàn)為最低，這可能是因為此時CVAP 以聚集體的形式存在，其亞基表面具有的疏水基團較少[6]。pH11.0～13.0 時的表面疏水性近似于pH 等電點時的表面疏水性，結(jié)合SDS-PAGE 圖譜，此pH 下的蛋白質(zhì)多以大分子量的片段、降解彌散的小分子片段、肽或氨基酸存在，這不利于疏水基團的暴露[20]。

圖2 pH 對CVAP 和CVGP 的表面疏水性的影響Fig.2 Effect of pH on surface hydrophobicity of CVAP and CVGP

pH 對CVGP 的表面疏水性不同于CVAP，呈現(xiàn)出表面疏水性急劇上升到最高再急劇下降，之后一直保持在接近于等電點疏水性水平的趨勢。pH4.0 時，CVGP 表面疏水性達到最大值85783.0；pH11.0 時，表面疏水性最小為1344.0；pH5.0、pH6.0～10.0、pH12.0和pH13.0 的表面疏水性略高于pH11.0。通過電泳圖譜分析可知，pH4.0 時，11S 蛋白亞基是CVGP 的主要成分，11S 蛋白質(zhì)的堿性亞基中含有大量的疏水基團，這就導致了CVGP 表現(xiàn)出高的表面疏水性[21]。pH 在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最低，蛋白質(zhì)以聚集體的形式存在而導致此時的表面疏水性降低[6]。pH6.0～13.0 時的表面疏水性近似于等電點時的表面疏水性，此pH 下的蛋白質(zhì)多以大分子量的片段和少量的小分子片段存在，這不利于疏水基團的暴露[20]。pH11.0時，CVGP 中的11S 的二硫鍵被打開而形成了小分子量的片段，CVGP 中蛋白質(zhì)聚集體（97.4 kDa）的含量較高，還含有一定比例的7S，這些蛋白質(zhì)成分不利于CVGP 中疏水基團的暴露，使其表面疏水性降低，這在大豆蛋白中也出現(xiàn)同樣結(jié)果[22]。

2.3.2 pH 對CVAP 和CVGP Zeta-電位的影響 Zeta-電位可以反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成和功能性質(zhì)的變化，Zeta-電位的絕對值越大，分子間的靜電斥力越強，越能降低分子間的聚集。如圖3 所示，CVAP 的Zeta-電位在近等電點pH4.0 附近時為0，CVGP 的Zeta-電位在近等電點pH5.0 附近時為0，這種Zeta電位特征可能與它們的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，這一觀點在油菜籽蛋白Zeta-電位的研究中也有出現(xiàn)[23]。CVAP的Zeta-電位正電荷的最大值為6.99 mA（pH2.0），負電荷絕對值的最大值為34.37 mA（pH10.0）；CVGP的Zeta-電位正電荷的最大值為22.43 mA（pH4.0），負電荷絕對值的最大值為36.17 mA（pH10.0）。Zeta-電位結(jié)果說明pH 的變化使蛋白質(zhì)表面的暴露基團發(fā)生改變，影響正電荷和負電荷之間的平衡[18]。

圖3 pH 對CVAP 和CVGP 的Zeta-電位的影響Fig.3 Effect of pH on Zeta-potential of CVAP and CVGP

當pH 小于蛋白質(zhì)等電點時，其表面帶正電荷，這些正電荷可能來源于NH3+。Lin 等[24]的研究表明甲殼胺表面的NH3+是其抗細菌活性的重要影響因子。當pH 大于蛋白質(zhì)等電點時，其表面帶負電荷，這可能得益于蛋白羧基去質(zhì)子化，COO-使蛋白分子表面帶負電荷；在pH10.0 的條件下，CVAP 和CVGP的Zeta-電位絕對值達到最大值；pH11.0～13.0 條件下，Zeta-電位絕對值變小。結(jié)合SDS-PAGE 研究結(jié)果推斷，pH11.0～13.0 的Zeta-電位特征可能是因為溶液中復雜成分在氧化交聯(lián)時形成的可溶性和不溶性聚集體阻礙了蛋白質(zhì)羧基解離，從而使蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力減弱[18]。

2.4 pH 對CVAP 和CVGP 界面性質(zhì)的影響

2.4.1 pH 對CVAP 和CVGP 溶解度的影響 箭筈豌豆蛋白的溶解度隨pH 變化曲線如圖4 所示。箭筈豌豆蛋白的溶解度變化趨勢呈U 型曲線。CVAP在pH4.0 處溶解度最低，CVGP 在pH5.0 處溶解度最低。隨著酸性條件增強，CVAP 和CVGP 的溶解度均逐漸增大；在pH2.0 時，兩類蛋白質(zhì)達到酸性條件下的最大溶解度，分別為39.80%和40.57%。隨著堿性條件增強，CVAP 和CVGP 的溶解度均增大，且在pH12.0 時達到此條件下的最大溶解度，CVAP的最大溶解度為63.90%，CVGP 的最大溶解度為42.18%；在pH12.0～13.0 時，兩類蛋白質(zhì)的溶解度開始下降。其他植物蛋白的溶解性也表現(xiàn)出類似特征，如油莎豆蛋白的等電點在pH4.5 附近，酸性條件下溶解度最大值在pH3.0 得到（39%），堿性條件下溶解度最大值在pH10.0 得到（60%）[25]。

圖4 pH 對CVAP 和CVGP 溶解度的影響Fig.4 Effect of pH on solubility of CVAP and CVGP

2.4.2 pH 對CVAP 和CVGP 乳化性的影響 CVAP和CVGP 乳化性隨pH 變化趨勢如圖5 所示。CVAP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的最低值均出在其等電點附近（圖5A），這可能是因為靠近等電點時，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力和表面疏水性均小，這導致蛋白質(zhì)聚集降低其乳化性[8]。隨著酸性條件增強，CVAP 乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸增大；在pH2.0 時，達到酸性條件下的最大值，分別為15.88 m2/g 和331.54 min。隨著堿性條件增強，CVAP 乳化活性和乳化穩(wěn)定性偶有波動，總體呈現(xiàn)增大趨勢；在pH13.0 時，達到最大值，分別為36.50 m2/g 和4245 min。這可能是因為偏離等電點較遠時，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、疏水作用力、電荷電性和電荷絕對值發(fā)生了改變，這增強了蛋白質(zhì)與油相之間的作用，進而使得其乳化性更好[26]。

圖5 pH 對CVAP（A）和CVGP（B）乳化性的影響Fig.5 Effect of pH on emulsifying properties of CVAP (A) and CVGP (B)

CVGP 乳化活性隨pH 變化趨勢與溶解度相似（圖5B），在其等電點附近出現(xiàn)乳化活性的最小值（5.16 m2/g）。隨著酸性條件增強，CVGP 乳化活性呈現(xiàn)逐漸增大；在pH2.0 和3.0 時，乳化活性分別為15.79 m2/g 和16.86 m2/g。隨著堿性條件增強，CVAP乳化活性呈現(xiàn)增大趨勢；在pH12.0 時，達到最大值（34.14 m2/g）。CVGP 乳化穩(wěn)定性隨pH 變化呈現(xiàn)出波動性變化趨勢，其最大值在pH13.0 處得到為1938.75 min，在pH4.0 處也出現(xiàn)了較高的乳化穩(wěn)定性（1735 min），這可能是CVGP 在不同pH 條件下的表面疏水性、電荷電性和電荷絕對值等與其疏水基團的暴露有關(guān)[27]，疏水基團使蛋白質(zhì)通過交聯(lián)形成分子量更大的聚合物，改變其溶解度，并增強其乳化性和發(fā)泡性能[7]?？偟膩碚f，CVGP 與CVAP 的乳化穩(wěn)定性變化趨勢不同，這可能是由于它們的分子組成不同，進而導致蛋白質(zhì)表面暴露的疏水基團不同[7,27]。

2.4.3 pH 對CVAP 和CVGP 起泡性的影響 CVAP和CVGP 起泡性和起泡穩(wěn)定性隨pH 變化趨勢如圖6 所示。CVAP 的起泡性如圖6A 所示，在等電點附近的起泡能力小于其他pH 的起泡能力，pH4.0 時的起泡能力為140%， pH5.0 時的起泡能力為最小值（130%）；CVAP 的起泡穩(wěn)定性在pH 近等電點時（pH4.0）處得到最小值18.52%。隨著pH 偏酸或偏堿，CVAP 的起泡能力得到明顯改善，起泡穩(wěn)定性變化不大，其中pH11.0 處的起泡穩(wěn)定性最大（66.21%）。CVGP 在等電點附近（pH5.0）的起泡能力最?。?5%），但此pH 下的起泡穩(wěn)定性高。隨著pH 偏酸或偏堿，CVGP 的起泡性得到明顯改善，但它的起泡穩(wěn)定性沒有得到改善。已有研究表明[28-30]，蛋白組分、蛋白疏水基團暴露程度、蛋白電荷均影響蛋白質(zhì)的起泡性。由SDS-PAGE 圖譜分析發(fā)現(xiàn)CVAP 和CVGP的蛋白組分不同，這可能是導致兩種蛋白起泡性不同的主要原因。傅里葉、表面疏水性和Zeta-電位的結(jié)果說明pH 影響了它們的二級結(jié)構(gòu)，改變了它們疏水基團的暴露和電荷，從而也會導致它們的起泡性產(chǎn)生差異。

圖6 pH 對CVAP（A）和CVGP（B）起泡性的影響Fig.6 Effect of pH on foaming properties of CVAP （A） and CVGP （B）

3 結(jié)論

箭筈豌豆蛋白經(jīng)pH 處理后，其二級結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)均發(fā)生了顯著改變。根據(jù)分子量組成變化分析，pH 處理促使箭筈豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)展開，箭筈豌豆蛋白11S 亞基的二硫鍵被打開而釋放出蛋白亞基；pH 為13.0 時，箭筈豌豆蛋白被分解成多樣的小肽。CVAP 和CVGP 在pH2.0 和3.0 時的表面疏水性均分別高于pH7.0～13.0 的表面疏水性，在pH8.0～11.0下?lián)碛懈哂谄渌鹥H 的Zeta-電位絕對值。在pH2.0～4.0 和pH8.0～13.0 時，CVAP 和CVAP 溶解度高于pH7.0 的溶解度；在pH2.0～4.0 時，CVAP 溶解度低于CVGP；在pH8.0～13.0 時，CVAP 溶解度高于CVGP。在pH2.0～3.0 和pH10.0～13.0 時，CVAP 的乳化性和乳化穩(wěn)定性均高于pH7.0 的；在pH8.0～13.0 時，CVGP 的乳化性和乳化穩(wěn)定性均高于pH7.0 的。pH 處理對CVAP 的起泡穩(wěn)定性沒有明顯提升，但pH11.0～13.0 的起泡性得到提升；為堿性偏移處理的CVAP 和CVGP 的乳化性和起泡性優(yōu)于酸性偏移處理的蛋白。由此可見，pH 堿性偏移有助于改善箭筈豌豆蛋白的物化性質(zhì)。