宏基因組二代測序在兒童內(nèi)臟利什曼病相關噬血淋巴組織細胞增生癥中的應用價值

康 磊 郭 芳 李立方 白新鳳 程彩云 徐梅先

河北省兒童醫(yī)院 1.重癥監(jiān)護科，2.感染科（河北石家莊 050031）

噬血淋巴組織細胞增生癥（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）是由淋巴細胞和巨噬細胞過度激活增殖引起的大量炎癥因子釋放的臨床病理狀態(tài)[1]。HLH 分原發(fā)性和繼發(fā)性，感染相關HLH是繼發(fā)性HLH最常見的形式[2]，利什曼原蟲是常見的觸發(fā)HLH 的原生動物[3]。繼發(fā)于內(nèi)臟利什曼病（visceral leishmaniasis，VL）的HLH 在兒童時期非常罕見，若不能早期診斷治療病死率可達100%[4]。利什曼原蟲的鑒定是診斷VL-HLH 的關鍵，而傳統(tǒng)方法具有局限性[5]，如骨髓穿刺（bone marrow aspiration，BMA）及淋巴結(jié)、脾臟穿刺液鏡檢，陽性率低且很大程度上依賴于檢驗人員的經(jīng)驗；而免疫層析法快速檢測存在滯后性，容易漏診或誤診，延誤治療，影響預后。宏基因組二代測序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）可以同時檢測多個病原體基因序列，實現(xiàn)病原全面無偏差篩查?，F(xiàn)報道6 例VL-HLH 患兒的診斷和治療經(jīng)驗，探討二代測序技術(shù)在VL-HLH中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2016年1月1日至2022年6月30日確診的VL-HLH 患兒的臨床資料。納入標準：①年齡＜18歲；②符合HLH-2004診斷標準[6]；③BMA檢出利什曼原蟲或二代測序檢出利什曼原蟲基因序列；④抗利什曼原蟲治療有效。排除標準：①先天性HLH；②已明確為EB 病毒等其他常見病原感染所致的繼發(fā)性HLH；③自身免疫性疾病及腫瘤性疾病所致的繼發(fā)性HLH。根據(jù)VL-HLH的確診方式不同分為mNGS組及BMA組。

本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過（No.2018013）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括性別、年齡、居住城市、疫區(qū)旅居史、首次住院時間、住院次數(shù)、確診方式、診斷延遲天數(shù)、臨床表現(xiàn)和預后等。

1.2.2 常規(guī)實驗室檢測 包括血生化、凝血四項、鐵蛋白、總淋巴細胞免疫分析、免疫球蛋白定量、可溶性CD25（sCD25），HLH相關遺傳基因，細菌、真菌培養(yǎng)，EB 病毒、巨細胞病毒抗體及聚合酶鏈反應（PCR），1,3-β-D葡聚糖試驗及半乳甘露聚糖試驗，多重PCR 檢測肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結(jié)核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體及流感病毒、腺病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠狀病毒。所有研究對象均進行BMA，獲取骨髓0.2 mL涂片進行形態(tài)學檢測，2 mL進行骨髓細菌及真菌培養(yǎng)。入組病例未行脾臟及淋巴結(jié)活檢，未行免疫層析法快速檢測等血清學檢測。

1.2.3 宏基因組二代測序 送檢標本均符合華大基因要求，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000平臺，對樣本中微生物核酸序列進行分析，通過與數(shù)據(jù)庫中已有微生物的核酸序列進行比對，從而對微生物進行鑒定。檢測過程包括核酸提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建、測序、信息分析及報告解讀。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)M（P25～P75）或中位數(shù)（全距）表示。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

河北省兒童醫(yī)院2016 年之前無VL-HLH 確診病例；2016年1月至2022年6月共收治住院患兒31 048例，確診VL-HLH6例（表1），患病率為0.02%。其中男4例、女2例，中位年齡20.0（9.8～27.0）月。病初均否認利什曼原蟲疫區(qū)旅居史，病例P1、P2、P5 在確診VL-HLH 后追問病史，謂半年前有山西省陽泉市旅居史。夏季起病1 例、秋季起病2 例、冬季起病3 例，從發(fā)病至確診的診斷延遲天數(shù)為38.0（27.3～69.0）天，3 例未能在首次住院期間確診。6例于住院初始留取血標本送檢常規(guī)實驗室檢查均無致病微生物檢出，HLH相關遺傳基因檢查無陽性發(fā)現(xiàn)。6 例均有發(fā)熱、脾大、血細胞減少、鐵蛋白增高，5例合并高三酰甘油血癥或低纖維蛋白原血癥，4例NK細胞活性下降，3例sCD25升高，2例BMA見吞噬細胞。

表1 6例患兒一般資料

2.2 mNGS與BMA診斷陽性率

所有患兒均于入院2天內(nèi)完善BMA，穿刺次數(shù)1～3 次。mNGS 組4 例（P2、P3、P4、P6）BMA 均未見利杜小體，全部通過mNGS檢出利什曼原蟲，中位序列數(shù)2 365.5（802.0～7 929.0），從發(fā)病至確診延遲時間為34.0（16.0～39.0）天，mNGS診斷陽性率為100%。BMA組2例（P1、P5）通過BMA確診后未行mNGS 檢查，首次BMA 陽性僅1 例，發(fā)病至確診時間間隔分別為62 天和90 天，BMA 診斷總陽性率為33.33%（2/6）。

2.3 治療及并發(fā)癥

所有患兒入院初期均給予阿昔洛韋（10 mg/kg）抗病毒，其中4 例給予特殊級抗生素，2 例予以限制級抗生素抗感染。6 例確診前均給予免疫球蛋白1g/（kg·d），連用2d。5例在發(fā)病9.0（4.5～65.5）天開始給予地塞米松（10 mg/m2，1 次/d），確診VL-HLH后停用激素，激素療程12.0（8.5～26.0）天。3例給予依托泊苷（100mg/m2，2次/周）化療，均在住院1周內(nèi)開始，確診VL-HLH后停用，化療療程中位數(shù)20.0天。因炎癥因子風暴行血液透析濾過治療3 例，合并呼吸衰竭行機械通氣3 例。兩組用藥、器官支持及合并感染情況見表2。

表2 6例患兒治療及并發(fā)癥

mNGS 組有2 例因延遲確診而接受藥物化療，骨髓抑制期出現(xiàn)嚴重細菌感染（P2 繼發(fā)銅綠假單胞菌引起的膿毒性休克、呼吸衰竭；P3 繼發(fā)侵襲性肺炎鏈球菌?。_診VL-HLH 后?；煼桨讣皬V譜抗生素，加用兩性霉素B 脂質(zhì)體（amphotericin B liposome，L-Amb）或銻劑治療，最終痊愈。另外2例早期行mNGS 確診VL-HLH，停用廣譜抗生素及阿昔洛韋，分別給予葡萄糖酸銻鈉及L-Amb，避免應用化療藥物，均無合并感染。BMA組中P1確診前給予化療32 天，骨髓抑制期合并重癥肺炎，廣譜抗生素治療效果不理想，3次BMA后確診VL-HLH后加用葡萄糖酸銻鈉治療，最終痊愈；P5 脾大為首發(fā)癥狀，后期合并發(fā)熱，常規(guī)抗感染無效，在病程第90天行BMA確診VL-HLH，給予葡萄糖酸銻鈉治療后緩解，見表2。

3 討論

VL-HLH 是兒童中容易忽視的繼發(fā)性HLH，利什曼原蟲以前鞭毛體形態(tài)被單核淋巴細胞吞噬，成熟為無鞭毛體，并通過血液和淋巴管傳播，影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)而引起VL[7]。利什曼原蟲分布有明確的區(qū)域特點，全球90%以上利什曼病例發(fā)生在包括中國在內(nèi)的10個國家[8]，國內(nèi)發(fā)病率最高地區(qū)由西部的新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅和四川省，逐漸向中部的山西、陜西省轉(zhuǎn)移，而河北省近10 年未見相關病例報道[9-10]。本研究6 例患兒均長期定居在河北省，3 例有短暫疫區(qū)旅居史，為省外輸入病例，其余3例否認疫區(qū)旅居史，為本地病例。分析原因：山西省陽泉市白蛉密度較高[11]，鹿泉與井陘相鄰，位于河北省西部，與山西省陽泉市隔太行山脈相鄰，這些地區(qū)具有海拔較低、氣溫較高、活動季節(jié)較長、土壤較濕潤松散等較好的白蛉繁殖條件。

VL-HLH 確診需滿足HLH 的同時鑒定出利什曼原蟲[12]，6 例患兒從出現(xiàn)臨床癥狀到確診的時間為38.0（27.3～69.0）天，其中3 例在首次住院時存在漏診、誤診，P1 于第三次住院時方確診。主要與以下因素有關：①臨床表現(xiàn)無特異性，持續(xù)發(fā)熱、脾腫大和全血細胞減少等，與嚴重感染、血液系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病等臨床癥狀重疊[13-14]。②潛伏期長，利士曼原蟲通過白蛉叮咬入侵人體血液循環(huán)，通過上調(diào)巨噬細胞和T 細胞的細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子蛋白表達進行免疫逃逸[15-16]，因此潛伏期從數(shù)周到數(shù)年不等[17]，平均3～8個月[18]，有報道同一時間感染的雙胞胎兒童，臨床癥狀出現(xiàn)的間隔長達9 個月[19]，因此VL-HLH 的發(fā)病時間無季節(jié)性規(guī)律。本研究中有50.0%的兒童在冬季起病，發(fā)病季節(jié)不符合白蛉的活動特點，考慮與利什曼原蟲感染后潛伏期長短不一有關。③病原學檢查有局限性，BMA 是目前兒童利什曼原蟲檢測的常用手段。本研究所有對象均進行了BMA，其對VLHLH 的診斷陽性率為33.3%，BMA 要求骨髓內(nèi)病原體負荷達到一定程度，且需要經(jīng)驗豐富的微生物學家才能保證顯微鏡下對利什曼原蟲的檢出率，因此，非流行地區(qū)敏感性低，結(jié)果存在偏倚[20]。免疫層析法是流行地區(qū)的常用篩查方法之一，高度特異性的PCR 有助于確診VL-HLH，但上述兩種檢測方法均需要特定的試劑盒，限制了在非流行地區(qū)的開展應用[21]。

本組所有患兒入院初期即符合HLH 的診斷標準，早期入院的4例規(guī)范化療效果差，且出現(xiàn)骨髓抑制及嚴重感染，且傳統(tǒng)病原培養(yǎng)、血清學及常見病原PCR 均無陽性發(fā)現(xiàn)，對于沒有預判病原的不明原因感染，予行mNGS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對利什曼原蟲檢測陽性率明顯高于BMA，與既往的報道一致[22]。不同于傳統(tǒng)的病原檢查方法，mNGS 直接對標本核酸進行高通量測序，可以同時檢測多個病原體基因序列，與數(shù)據(jù)庫包含的病原序列信息進行比對分析，實現(xiàn)全面無偏差篩查。然而，需要注意的是，核酸檢測本身并不能證明已識別的微生物是致病原，研究結(jié)果必須在臨床背景下進行解釋[23]。

本研究6例兒童檢出利什曼原蟲后經(jīng)L-Amb或銻劑治療，病情迅速緩解，其中2例因早期行mNGS確診VL-HLH，避免了化療藥物的使用。提示VLHLH的治療關鍵在于抗利什曼原蟲，而只有在抗利什曼原蟲治療反應不佳時，才應考慮進行免疫調(diào)節(jié)，與國外研究結(jié)果一致[24]。進行免疫調(diào)節(jié)治療時需警惕骨髓抑制合并嚴重感染。相對于常規(guī)實驗室檢測，mNGS對于血液系統(tǒng)疾病合并感染的病原診斷價值更高[25]。由于早期廣譜抗生素的使用和微生物培養(yǎng)的低陽性率，病例P2、P3常規(guī)病原學檢查均為陰性，經(jīng)mNGS 發(fā)現(xiàn)合并感染病原，為有效調(diào)整抗生素提供強有力依據(jù)。如能早期行mNGS檢測并進行針對性抗利什曼原蟲治療，不僅可避免化療后骨髓抑制期繼發(fā)的嚴重感染，還能夠快速、精準的獲取檢測樣本中的合并病原信息。

本研究存在一定的局限性。第一，病例數(shù)較少，且BMA組病例未行mNGS，因此未能對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，相關結(jié)論尚需大樣本量的數(shù)據(jù)進行驗證。第二，mNGS對病原體的診斷尚無統(tǒng)一標準，本研究對患兒進行抗利什曼原蟲治療有效才驗證了mNGS結(jié)果的準確性。

綜上，兒童VL-HLH罕見，具有潛伏期長短不一、臨床表現(xiàn)無特異性及常規(guī)輔助檢查局限等特點，在非利什曼流行地區(qū)早期確診困難，易延遲診斷，由此引發(fā)的免疫抑制治療，不僅療效差，且易出現(xiàn)骨髓抑制、嚴重感染等并發(fā)癥。mNGS不僅可為早期識別兒童VL-HLH提供有效依據(jù)，還可快速、精準識別混合感染病原。建議對HLH-2004方案治療不理想者，盡早行mNGS，以明確是否存在包括VL在內(nèi)的罕見病原引起的繼發(fā)性HLH。