miRNA-23a-3p和TLR4在急性腦出血患者血清中的表達(dá)及臨床意義

賀琦，王燕

西安寶石花長慶醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710201

急性腦出血(acute cerebral hemorrhage，ACH)是一種顱內(nèi)出血性疾病，其發(fā)病率高，預(yù)后差[1-2]。因此，尋找與ACH 發(fā)病及預(yù)后轉(zhuǎn)歸相關(guān)的指標(biāo)，對及時(shí)干預(yù)，改善ACH 患者預(yù)后有積極意義。有研究認(rèn)為，ACH發(fā)病與炎癥反應(yīng)、微小RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)失調(diào)、信號傳導(dǎo)異常等相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-23a-3p(microRNA-23a-3p，miR-23a-3p)在ACH患者中呈高表達(dá)，與血腫體積、ACH 患者預(yù)后相關(guān)，可能參與并影響ACH 患者預(yù)后[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)腦出血患者Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)水平較高，是影響腦出血預(yù)后的危險(xiǎn)因素，且具有評估ACH 患者預(yù)后的潛在價(jià)值[6]。但miR-23a-3p、TLR4在ACH患者中的相關(guān)性，及兩者聯(lián)合預(yù)測ACH患者預(yù)后的價(jià)值尚未明確。基于此，本文通過測定miR-23a-3p、TLR4 在ACH 患者血清中的水平，旨在分析miR-23a-3p與TLR4的相關(guān)性以及miR-23a-3p、TLR4聯(lián)合檢測對ACH患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月至2022 年3 月西安寶石花長慶醫(yī)院診治的ACH 患者110 例作為ACH 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國腦出血診治指南(2019)》[7]中有關(guān)ACH 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)首次發(fā)病，入院就診＜4 h；(3)檢查資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)凝血功能障礙者；(2)伴有感染、糖尿病、傳染病者；(3)近1 個(gè)月服用抗血小板藥物者；(4)合并肝腎功能不全、自身免疫系統(tǒng)疾病者；(5)因蛛網(wǎng)膜下腔出血、外傷等引發(fā)的繼發(fā)性腦出血者；(6)腦血管畸形導(dǎo)致的顱內(nèi)出血者。ACH 組患者中男性56 例，女性54 例；年齡61～73 歲，平均(69.98±7.24)歲。另納入同期健康體檢者110例作為對照組，其中男性61 例，女性49 例；年齡61～73 歲，平均(68.73±7.11)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及其親屬對本研究知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本收集 收集ACH患者入院治療前，及健康者體檢當(dāng)日3～5 mL空腹外周血，自然凝集，分離出血清(4 000 r/min離心10 min)，分裝，存于-70℃冰箱。

1.2.2 血清miR-23a-3p 表達(dá)水平測定 采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR)法測定血清miR-23a-3p 表達(dá)水平。首先，按miRNeasy Serum/Plasma Kit (217184，北京索萊寶科技有限公司)說明書提取血清樣本總RNA，且在提取RNA 時(shí)加內(nèi)參cel-miR-39。其次，利用miScript Reverse Transcription Kit(218061，杭州開泰生物技術(shù)有限公司)獲得cDNA。最終，應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit(218075，北京欣華綠源科技有限公司)配制反應(yīng)體系，qRT-PCR 儀(StepOne TM，美國ABI 公司)將cDNA 擴(kuò)增、檢測。qRT-PCR 擴(kuò)增參數(shù)：96.5℃8 min；94℃30 s，64.5℃40 s，70℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。miR-23a-3p 上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGATCA-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGT CGT-3'，cel-miR-39 上游引物序列為5'-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3'。血清miR-23a-3p相對表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。

1.2.3 血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TLR4、核因子κB(NF-κB)水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清TNF-α、TLR4 和NF-κB 水平。采用人TNF-αELISA試劑盒(70-EK182HS-96，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)、人TLR4 ELISA 試劑盒(CSB-E12954h-1，上海恒斐生物科技有限公司)、人NF-κB ELISA 試劑盒(XFH11333，上海信帆生物科技有限公司)配制TNF-α、TLR4、NF-κB的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，解凍血清，酶標(biāo)儀(美國Awareness公司，Chromate 4300)測定TNF-α、TLR4、NF-κB標(biāo)準(zhǔn)品溶液及血清樣本在450 nm處的吸光度，繪制TNF-α、TLR4、NF-κB 的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，結(jié)合TNF-α、TLR4、NF-κB 的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算血清TNF-α、TLR4、NF-κB水平。

1.3 治療與隨訪 ACH 患者均依據(jù)《中國腦出血診治指南(2019)》[7]給予ACH患者降顱內(nèi)壓、吸氧、腦保護(hù)劑等對癥治療。對110例ACH患者隨訪6個(gè)月，對患者進(jìn)行改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)評估，并依據(jù)mRS評分將其分為預(yù)后良好組(58例，mRS評分＜3分)、預(yù)后不良組(52例，mRS評分≥3分)。此外，收集整理兩組ACH 患者美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)、年齡、高脂血癥、性別、高血壓、血小板分布寬度、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、糖尿病等資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)＜5 時(shí)，采用Fisher 精確概率法分析；ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平與TNF-α、NF-κB 的相關(guān)性采用Pearson 法分析；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評估血清mmiR-23a-3p、TLR4預(yù)測ACH患者預(yù)后的價(jià)值。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比較 與對照組相比，ACH 組患者血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比較()Table 1 Comparison of serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB between the two groups()

表1 兩組受檢者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比較()Table 1 Comparison of serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB between the two groups()

組別對照組ACH組t值P值例數(shù)110 110 miR-23a-3p 1.01±0.30 2.29±0.67 18.287 0.001 TLR4(μg/L)17.46±5.82 32.94±10.98 13.065 0.001 TNF-α(pg/mL)20.31±8.47 51.28±21.37 14.130 0.001 NF-κB(ng/mL)8.50±3.04 17.34±6.19 13.444 0.001

2.2 ACH 患者血清miR-23a-3p、TLR4 水平與TNF-α、NF-κB的關(guān)系 經(jīng)Pearson法分析結(jié)果顯示，ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平與TNF-α、NF-κB 均呈正相關(guān)(r=0.377、0.538、0.403、0.572，P＜0.05)，見表2；ACH 患者血清miR-23a-3p 表達(dá)水平與TLR4呈正相關(guān)(r=0.581，P＜0.05)，見圖1。

圖1 ACH患者血清miR-23a-3p表達(dá)水平與TLR4的相關(guān)性Figure 1 Correlation between serum miR-23a-3p expression level and TLR4 in patients with ACH

表2 ACH 患者血清miR-23a-3p、TLR4 水平與TNF-α、NF-κB 的相關(guān)性Table 2 Correlation of serum miR-23a-3p and TLR4 levels with TNF-α and NF-κB in ACH patients

2.3 不同預(yù)后ACH 患者的一般資料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比較 與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組ACH患者NIHSS評分、腦出血體積、血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，年齡、高脂血癥、男/女比、高血壓、血小板分布寬度、BMI、糖尿病比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 不同預(yù)后ACH患者的一般資料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平比較[，例(%)]Table 3 Comparison of general data and serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB in ACH patients with different prognosis[,n(%)]

表3 不同預(yù)后ACH患者的一般資料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平比較[，例(%)]Table 3 Comparison of general data and serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB in ACH patients with different prognosis[,n(%)]

臨床指標(biāo)年齡(歲)NIHSS評分(分)高脂血癥(是/否)男/女腦出血體積(mL)高血壓(是/否)血小板分布寬度(%)BM(kg/m2)糖尿病(是/否)TNF-α(pg/mL)NF-κB(ng/mL)miR-23a-3p TLR4(μg/L)預(yù)后良好組(n=58)69.87±7.11 10.48±3.50 12(20.69)/46(79.31)31(53.45)/27(46.55)22.25±7.42 34(58.62)/24(41.38)16.10±4.03 22.08±2.27 14(24.14)/44(75.86)38.07±15.86 12.42±4.44 1.71±0.50 24.52±8.17預(yù)后不良組(n=52)70.14±7.32 18.26±6.09 14(26.92)/38(73.08)25(48.08)/27(51.92)33.82±11.27 32(61.54)/20(38.46)16.03±4.00 22.27±2.31 15(28.85)/37(71.15)66.01±27.51 22.83±8.16 2.94±0.85 42.33±14.11 t/χ2值0.196 8.319 0.590 0.317 6.421 0.097 0.091 0.435 0.313 6.608 8.426 9.363 8.203 P值0.845 0.001 0.442 0.574 0.001 0.755 0.927 0.665 0.576 0.001 0.001 0.001 0.001

2.4 血清miR-23a-3p、TLR4 水平對ACH 患者預(yù)后的評估價(jià)值 經(jīng)ROC 分析結(jié)果顯示，血清miR-23a-3p 預(yù)測ACH 患者預(yù)后的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.857 (95%CI：0.781～0.933)，截?cái)嘀禐?.37，約登指數(shù)為0.648，其敏感度、特異性分別為76.9%、87.9%；TLR4 預(yù)測ACH 患者預(yù)后的AUC 為0.868 (95%CI：0.800～0.937)，截?cái)嘀禐?4.52 μg/L，約登指數(shù)為0.621，其敏感度、特異性分別為78.8%、86.2%；miR-23a-3p、TLR4聯(lián)合預(yù)測ACH患者預(yù)后的AUC為0.941(95%CI：0.893～0.990)，約登指數(shù)為0.801，其敏感度、特異性分別為90.4%、89.7%，見圖2。

圖2 血清miR-23a-3p、TLR4預(yù)測ACH患者預(yù)后的ROC曲線Figure 2 ROC curve of serum miR-23a-3p and TLR4 in predicting prognosis of patients with ACH

3 討論

ACH 是因非外傷性腦血管破裂引發(fā)的一種腦內(nèi)出血病變，起病急，經(jīng)治療后，部分患者可能伴有神經(jīng)功能缺損，發(fā)生不同程度殘疾，甚至死亡[8-9]。因此，尋找與ACH 病理變化相關(guān)，且可有效預(yù)測ACH 患者預(yù)后的方法十分重要。

miRNA是一類不編碼蛋白的RNA小分子，其可調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)自噬，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，與蛛網(wǎng)膜下腔出血、ACH等關(guān)系密切[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p 在心肌梗死中表達(dá)失調(diào)，可能是評估心肌梗死患者預(yù)后的標(biāo)志物[12]；另外，miR-23a-3p在腦出血患者中過表達(dá)，經(jīng)針灸治療后，miR-23a-3p 表達(dá)水平降低，miR-23a-3p 可能通過影響炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程進(jìn)而在腦出血中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13]。本研究中ACH 患者血清miR-23a-3p 表達(dá)水平較高，提示miR-23a-3p 可能與ACH 的病變過程相關(guān)，推測miR-23a-3p 可能通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)而參與ACH 病理發(fā)展，但其機(jī)制仍需深入探討。本研究又分析血清miR-23a-3p 表達(dá)水平與ACH 患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良的ACH患者血清miR-23a-3p高表達(dá)。為進(jìn)一步探究血清miR-23a-3p的臨床意義，進(jìn)行了ROC曲線分析，結(jié)果顯示，血清miR-23a-3p 預(yù)測ACH 患者預(yù)后的AUC為0.857，且當(dāng)血清miR-23a-3p 相對表達(dá)量＞2.37 時(shí)，ACH 患者發(fā)生不良預(yù)后概率較高，提示miR-23a-3p不僅與ACH 患者預(yù)后有關(guān)，還可能作為ACH 患者預(yù)后預(yù)測的輔助指標(biāo)。

TLR4 是Toll 樣受體家族的一員，是一種膜蛋白，其主要分布于神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，與腦出血的神經(jīng)損傷密切相關(guān)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在腦出血中呈高水平，經(jīng)麥角甾苷治療后，TLR4水平下降，TLR4 可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響腦出血病理過程[16]；另外，周喜燕等[17]也研究發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠腦組織中TLR4表達(dá)水平升高，TLR4可能促進(jìn)腦組織損傷，增加血腦屏障通透性，其與神經(jīng)功能顯著相關(guān)。本研究中ACH患者血清TLR4水平高于健康者，與既往研究[16-17]類似，提示TLR4可能參與ACH發(fā)病進(jìn)程，推測TLR4可能通過影響炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響ACH發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制有待深入探討。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良的ACH 患者血清TLR4 高于預(yù)后良好者，提示TLR4 可能與ACH 患者預(yù)后相關(guān)，推測高水平TLR4 通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響ACH患者預(yù)后。隨后的ROC曲線分析顯示，血清TLR4預(yù)測ACH患者預(yù)后的AUC 為0.868，當(dāng)血清TLR4 水平＞34.52 μg/L 時(shí)，ACH患者發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)較大，提示TLR4對ACH患者預(yù)后有一定預(yù)測價(jià)值，測定血清TLR4 水平有助于臨床預(yù)測ACH患者的預(yù)后情況。

近年來，關(guān)于miRNA 與下游靶基因的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制翻譯或降解mRNA，進(jìn)而調(diào)控疾病進(jìn)展方面的研究越來越多。miR-23a-3p 靶向TLR4 調(diào)控疾病進(jìn)程的研究目前已有報(bào)道，如Gao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p 可以通過調(diào)節(jié)TLR4 表達(dá)，進(jìn)而影響膿毒癥的炎癥反應(yīng)過程，Chen 等[19]發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者中miR-23a-3p的下調(diào)通過靶向IRF1/SP1的TLR4/TNF-α/TGF-β1/IL-10信號傳導(dǎo)抑制單核細(xì)胞的功能和吞噬作用，目前關(guān)于miR-23a-3p/TLR4在ACH中的作用報(bào)道較少，故本研究分析了ACH 患者血清miR-23a-3p表達(dá)水平與TLR4的關(guān)系，結(jié)果顯示，血清miR-23a-3p表達(dá)水平與TLR4呈正相關(guān)，提示miR-23a-3p可能與TLR4 相互作用進(jìn)而影響ACH 發(fā)生發(fā)展，但其機(jī)制需結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。進(jìn)一步研究顯示，血清miR-23a-3p、TLR4 聯(lián)合預(yù)測ACH 患者預(yù)后的AUC 為0.941，敏感度為90.4%，特異性為89.7%，提示miR-23a-3p、TLR4 聯(lián)合可提高對ACH 患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，為臨床判定ACH患者預(yù)后提供新思路。

綜上所述，ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平較高，miR-23a-3p與TLR4呈正相關(guān)，且miR-23a-3p、TLR4 均與ACH 患者預(yù)后相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測可提高預(yù)測ACH 患者預(yù)后的價(jià)值，為臨床預(yù)測ACH 患者預(yù)后提供新思路。但后期仍需深入探討miR-23a-3p、TLR4 在ACH 中的機(jī)制，為診治ACH、評估ACH 患者預(yù)后增加說服力。