Tubastatin A通過(guò)降低氧化應(yīng)激減輕膿毒癥所致心肌損傷的體外研究

尤佳琪，劉暢，崇巍

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110001）

研究［1］顯示，40%～50%膿毒癥患者可發(fā)生心肌抑制，其中的7%會(huì)發(fā)生心力衰竭。目前，對(duì)于膿毒癥所致心功能障礙的機(jī)制尚未明確，普遍認(rèn)為心肌抑制與膿毒癥時(shí)的炎癥介質(zhì)、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)，但確切機(jī)制仍不清楚［2］。生理?xiàng)l件下，心臟組織中活性氧 （reactive oxygen species，ROS）生成很少［3］，然而在缺氧、高糖、炎癥等刺激下ROS大量產(chǎn)生［3-6］。膿毒癥時(shí)，循環(huán)中病原體相關(guān)分子模式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）、損傷相關(guān)分子模式 （damage-associated molecular patterns，DAMPs） 共同作用于心肌細(xì)胞［7］，通過(guò)誘導(dǎo)胞內(nèi)的黃嘌呤氧化酶 （xanthine oxidase，XO）、NADPH氧化酶 （NADPH oxidase，NOX） 活化和線粒體損傷產(chǎn)生ROS［8］。過(guò)量的ROS引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［9］。Tubstatin A （Tub A） 是組蛋白去乙酰化酶6 （histone deacetylase 6，HDAC6） 選擇性抑制劑［10］，本課題組密歇根大學(xué)合作伙伴發(fā)現(xiàn)Tub A可以提高致死性膿毒癥大鼠的遠(yuǎn)期生存率［11］。有研究［12-16］表明，Tub A可以減少心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等ROS的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究應(yīng)用脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 刺激巨噬細(xì)胞獲得細(xì)胞上清液，用其刺激心肌細(xì)胞，建立體外膿毒癥心肌損傷模型，并用Tub A進(jìn)行干預(yù)，探討Tub A對(duì)膿毒癥心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，培養(yǎng)條件為完全培養(yǎng)基 （DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS+1%青鏈霉素），37 ℃，5% CO2以及飽和濕度孵箱。巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%左右接觸率時(shí)饑餓培養(yǎng) （DMEM高糖培養(yǎng)基+0.5%FBS+1%青鏈霉素） 過(guò)夜，用1 μg/mL LPS （L8247，美國(guó)Sigma公司） 刺激8 h后取上清液獲得心肌細(xì)胞培養(yǎng)基 （MCM組）；用無(wú)LPS刺激的巨噬細(xì)胞8 h后取上清液獲得心肌細(xì)胞培養(yǎng)基 （Sham組），兩種上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞 （美國(guó)ATCC公司），培養(yǎng)條件與RAW264.7巨噬細(xì)胞一致。待H9C2生長(zhǎng)達(dá)80%左右接觸率并饑餓過(guò)夜后，Sham組用無(wú)LPS刺激的巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)；MCM組用LPS刺激巨噬細(xì)胞所獲上清液培養(yǎng)；Tub A組預(yù)處理 （饑餓培養(yǎng)基+40 μmol/L Tub A） 3 h，正式處理 （MCM組應(yīng)用的培養(yǎng)基+40 μmol/L Tub A） 孵育24 h［17-18］，收集心肌細(xì)胞及上清液檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2 巨噬細(xì)胞上清液中一氧化氮 （nitric oxide，NO）水平檢測(cè)

應(yīng)用總NO含量檢測(cè)試劑盒 （S0024，中國(guó)碧云天公司） 檢測(cè)，操作按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。酶標(biāo)儀 （美國(guó)Biotec公司） 測(cè)定樣本在540 nm的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.3 心肌細(xì)胞活性檢測(cè)

將Sham組、MCM組、Tub A組和空白對(duì)照組 （饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng)的心肌細(xì)胞） 按照1×104/孔接種到96孔板并饑餓過(guò)夜后給予相應(yīng)刺激。在各孔中加入10 μL的CCK8試劑 （日本同仁化工公司），混勻后放回孵箱，2 h后拿出96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)定樣本在450 nm處的吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平

收集各組心肌細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒 （CA1410，中國(guó)索萊寶公司） 將DCFH-DA探針裝載入心肌細(xì)胞內(nèi) （陰性對(duì)照除外），應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，用FITC通道檢測(cè)2，7-二氯熒光素 （2，7-dichlorofluorescein，DCF） 熒光，應(yīng)用Flow Jo軟件分析結(jié)果。

1.5 心肌細(xì)胞內(nèi)丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 含量檢測(cè)

收集各組心肌細(xì)胞，檢測(cè)MDA含量。按照試劑盒 （BC0025，中國(guó)索萊寶公司） 說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本在532 nm和600 nm處的吸光度值。各組分別計(jì)算：ΔA532=A532測(cè)定-A532空白，ΔA600=A600測(cè)定-A600空白，ΔA=ΔA532-ΔA600； MDA含量 （nmol/107cell） =107.5×ΔA。

1.6 細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH） 檢測(cè)

按照試劑盒 （BC0685，中國(guó)索萊寶公司） 說(shuō)明書(shū)檢測(cè)2組巨噬細(xì)胞上清液中以及各組心肌細(xì)胞上清液中的LDH，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本在450 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。心肌細(xì)胞所產(chǎn)生的LDH=LDH （心肌細(xì)胞上清液） -LDH （所用的巨噬細(xì)胞上清液）。

1.7 心肌細(xì)胞釋放心肌型肌酸激酶同工酶 （creatine kinase-MB，CK-MB） 檢測(cè)

收集各組心肌細(xì)胞上清液，按照試劑盒 （SEKR-0059，中國(guó)索萊寶公司） 說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)CK-MB水平，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本在450 nm、630 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。巨噬細(xì)胞不產(chǎn)生CK-MB，因此心肌細(xì)胞上清液中的CK-MB是心肌細(xì)胞產(chǎn)生的。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Excel 2016錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCM組和Sham組巨噬細(xì)胞上清液中NO水平

結(jié)果顯示，MCM組和Sham組巨噬細(xì)胞上清液NO含量分別為 （16.27±3.57） μmol/L、 （0.90±0.68） μmol/L，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.001）。

2.2 各組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較

檢測(cè)各組細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度，以陽(yáng)性對(duì)照組熒光強(qiáng)度峰值為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量各組大于該熒光強(qiáng)度的細(xì)胞占比。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組、Sham組、MCM組、Tub A組、陰性對(duì)照組細(xì)胞占比分別為46.2%、22.9%、33.0%、22.5%和0。見(jiàn)圖1A。對(duì)各組平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示MCM組熒光強(qiáng)度顯著高于Sham組和Tub A組 （均P＜ 0.05），而Sham組和Tub A組熒光強(qiáng)度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05），見(jiàn)圖1B。與Sham組比較，MCM組心肌細(xì)胞中MDA含量顯著增加 （P＜ 0.05）；與MCM組比較，Tub A組MDA含量顯著減少 （P＜ 0.05）。見(jiàn)圖1C。

圖1 各組心肌細(xì)胞中ROS及MDA水平比較Fig.1 Comparison of ROS and MDA levels in each group

2.3 各組心肌細(xì)胞損傷情況比較

與Sham組比較，MCM組心肌細(xì)胞釋放的LDH水平明顯升高 （P＜ 0.05）；與MCM組比較，Tub A組LDH水平明顯下降 （P＜ 0.05），見(jiàn)圖2A。與Sham組比較，MCM組CK-MB水平明顯升高 （P＜ 0.05），與MCM組比較，Tub A組CK-MB水平有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05），見(jiàn)圖2B。

圖2 各組心肌細(xì)胞損傷情況比較Fig.2 Comparison of myocardial cell injury in each group

2.4 各組心肌細(xì)胞活性比較

結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與Sham組比較心肌細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05）。與Sham組比較，MCM組與Tub A組心肌細(xì)胞活性明顯降低 （P＜ 0.001）；與MCM組比較，Tub A組心肌細(xì)胞活性明顯升高 （P＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肌細(xì)胞活性比較Fig.3 Comparison of myocardial cell activity in each group

3 討論

3.1 經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷

本研究結(jié)果顯示，使用經(jīng)LPS刺激巨噬細(xì)胞的上清液培養(yǎng)心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS 及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平均顯著增加，LDH和CK-MB釋放明顯增加，同時(shí)細(xì)胞活性明顯下降，提示經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷。

JI等［16］、RUAN等［18］研究結(jié)果與本研究相似，經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，加劇細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。過(guò)量產(chǎn)生的ROS可抑制線粒體氧化磷酸化，減少細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，使細(xì)胞活性下降。另外，磷脂膜對(duì)ROS的攻擊十分敏感，可發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生MDA和4-羥基壬烯酸等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物［19］，這些產(chǎn)物可以破壞DNA、蛋白質(zhì)和酶活性，并激活信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞的自噬、凋亡、鐵死亡等［20］；大量ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化還可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通透性增加，大量釋放心肌酶及其他細(xì)胞損傷標(biāo)志物［21］。

3.2 Tub A可減輕經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞所致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用Tub A對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS 及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平均明顯降低，細(xì)胞釋放LDH明顯減少，CK-MB作為臨床和體外實(shí)驗(yàn)中診斷膿毒癥心肌損害的關(guān)鍵指標(biāo)，同樣呈下降趨勢(shì)。此前已有研究［14］證實(shí)，Tub A在星形膠質(zhì)細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等的膿毒癥模型中具有減輕氧化應(yīng)激損傷的作用，且在缺氧/復(fù)氧的H9C2心肌細(xì)胞中也具有減少ROS產(chǎn)生的作用［17］，因此Tub A可能通過(guò)降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，減輕經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞所致的心肌細(xì)胞損傷。

大量研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞受LPS等刺激發(fā)生M1極化，形成促炎表型，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，而NO可作為巨噬細(xì)胞發(fā)生M1極化的標(biāo)志物之一。本研究中LPS刺激后的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量NO，可以認(rèn)為其發(fā)生了M1極化，形成促炎表型。膿毒癥引起的靶器官損傷來(lái)自于PAMPs、DAMPs的共同作用［7］。本研究應(yīng)用LPS刺激巨噬細(xì)胞獲得的上清液，同時(shí)具備了PAMPs和DAMPs，模擬膿毒癥時(shí)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，成功構(gòu)建體外細(xì)胞模型，符合膿毒癥心肌損害的病理機(jī)制。此外，眾多研究［22-24］表明，氧化應(yīng)激損傷是膿毒癥心肌損害發(fā)生的重要病理生理過(guò)程，即心肌細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量、心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物的釋放水平及細(xì)胞活性的改變，與本研究結(jié)果一致。JI等［16］、RUAN等［18］同樣應(yīng)用本研究方法成功建立了膿毒癥心肌損害體外模型，故應(yīng)用此方法建立體外膿毒癥心肌損傷模型具有較高科學(xué)性。

綜上所述，心肌損傷作為急診科常見(jiàn)的膿毒癥并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷有著十分密切的關(guān)系。Tub A可以通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生，減輕膿毒癥導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞，提高心肌細(xì)胞的生存率，維持心臟功能的穩(wěn)定。本研究為體外實(shí)驗(yàn)，無(wú)法完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)過(guò)程，因此有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。