腫瘤靶向肽在多肽偶聯(lián)藥物中的研究進展

陳婉婷,鄭仁林

(西南科技大學 生命科學與工程學院,四川 綿陽 621100)

腫瘤靶向治療正在成為抗擊癌癥的一顆新星,靶向肽是一類靶向腫瘤細胞和組織的多肽,毒副作用小,可與抗癌藥物偶聯(lián)用于早期腫瘤病變部位的診斷和特異性給藥,在治療癌癥方面有著良好前景。PDC將細胞靶向多肽與藥物分子偶聯(lián)起來,以增加藥物分子的靶向性,將藥物分子集中在目標組織,并降低在其他組織的相對濃度,進而提高藥物的療效并減少副作用[1]。作為腫瘤靶向載體,腫瘤靶向肽的優(yōu)點很多,比如它易于合成,可以輕松引入結構修飾,支持合理的藥物設計,提高穩(wěn)定性、親和力和生物利用率。此外,腫瘤靶向肽還具有低免疫原性。腫瘤靶向肽不僅可以與抗腫瘤藥物偶聯(lián)而起到靶向治療腫瘤的作用,也可以與成像試劑和腫瘤診斷試劑偶聯(lián),以實現(xiàn)腫瘤顯影和標記的目的。迄今,人們已經(jīng)對多肽偶聯(lián)藥物有相當多的報道,然而,腫瘤靶向肽在多肽偶聯(lián)藥物中的使用相關的詳細報道尚很少見。本文綜述了腫瘤靶向肽在多肽偶聯(lián)藥物中的研究進展,詳細介紹了腫瘤靶向肽的篩選方法、分類以及已上市多肽偶聯(lián)藥物使用的靶向肽。

1 腫瘤靶向肽的篩選方法

腫瘤靶向肽可以對腫瘤的血管和腫瘤的相關受體進行特異性的識別,然后實現(xiàn)其靶向性。不斷發(fā)展的抗腫瘤研究技術,讓很多靶向腫瘤的肽被發(fā)掘出來。目前主要有三種方法對腫瘤靶向肽進行篩選:噬菌體展示技術、化學合成肽庫篩選、計算機模擬設計腫瘤特異性靶點。

1.1 噬菌體展示技術篩選

噬菌體展示技術篩選目標多肽的基本原理是將指定多肽一段基因序列插入到噬菌體的基因序列中,讓植入外源基因的噬菌體感染細菌,多次轉染篩選及淘汰、洗脫擴增后得到通過噬菌體表達的目標多肽。

固相與肽庫的靶蛋白分子經(jīng)過一段時間的孵育后,會產(chǎn)生未結合的游離噬菌體被洗去,然后競爭受體或酸洗脫與靶分子吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細胞,經(jīng)過繁殖擴增,再進行下一輪的洗脫,一個“吸附-洗脫-擴增”的過程就產(chǎn)生了。與靶分子特異性結合的噬菌體,經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴增”,得到高度濃縮。由此產(chǎn)生的噬菌體制劑可用于進一步富集具有所需結合特性的目標多肽。這種從組合庫中高通量篩選特定噬菌體和提取多肽的方法,對研究多肽對腫瘤細胞的親和力很有幫助,應用較為廣泛。

1.2 化學合成肽庫篩選

化學合成肽庫(Synthetic Peptide Library)是以化學合成法隨機合成特定長度的多肽集合。由組成多肽的氨基酸數(shù)量決定庫容量大小的20種天然氨基酸,可作為合成肽庫時的構建單元。化學合成肽庫與生物合成肽庫相比,其優(yōu)點在于氨基酸構成肽,可以是非天然氨基酸。

各種偶聯(lián)縮合劑和固相多肽合成儀的發(fā)展使研究人員能夠獲得大量不同序列的短肽,這些肽一般由4～12個非天然或天然構型的氨基酸組成。通過修飾氨基酸、改變氨基酸的序列順序、替換氨基酸等方法,能夠構建大量的多肽化合物庫,獲得多肽后再建立適合的親和色譜體系,以測定優(yōu)先序列和先導序列的表觀解離常數(shù),經(jīng)過優(yōu)化和篩選,可以得到對配體具有高親和力的短肽[2]。Teerapat Ananuchatkul等人利用化學修飾方法設計的肽庫通過添加人工功能團進行修飾而得到擴展。他們利用噬菌體展示和化學修飾相結合的方法,創(chuàng)建了一個吻合器α-螺旋肽庫,其結構受短鏈連接處的限制,從而推動了一項發(fā)現(xiàn)具有高親和力和特異性的肽配體。不復雜的多肽固相合成和高純度的產(chǎn)物,可以通過人工修飾得到多種非天然多肽,這提供了一個珍貴的多肽化合物庫,以找到適合的腫瘤靶向多肽。

1.3 計算機輔助肽設計

結構生物學研究發(fā)現(xiàn),許多沒有固定形態(tài)的蛋白質通過含有柔性肽段的肽識別域(Peptide-recognition Domain)與靶標蛋白結合,介導瞬時可逆的動態(tài)蛋白-蛋白之間的相互作用。蛋白質組學和基因組學的迅速發(fā)展積累了大量的序列信息和結構數(shù)據(jù),僅靠人工實驗方法加工處理這些信息成本較高、耗時耗力。計算機輔助肽設計(Computer Aided Peptide Design)應運而生,它在充分發(fā)揮計算機人工智能、圖形處理和數(shù)據(jù)挖掘等技術作用的基礎上,結合分子動力學模擬、分子對接和定量構效關系等方法,將合理的藥物設計過程與計算機輔助設計技術相結合,為多肽設計提供高效合理的理論指導。在結合腫瘤靶點時,腫瘤靶點肽和腫瘤靶點有關鍵的錨定殘基。研究人員開發(fā)了一系列計算機模擬計算軟件,能夠根據(jù)蛋白質結構庫(Protindbank,PDB)提供的腫瘤靶點的蛋白質晶體結構分析蛋白質與多肽作用力,并利用模擬計算獲得配體與受體相互作用力的能量、類型、氨基酸殘基制程之間的距離等信息,通過分析大量腫瘤靶點與非靶點的數(shù)據(jù),設計出一系列靶向多肽,篩選出更優(yōu)秀的多肽。

2 腫瘤靶向肽分類

研究表明,腫瘤細胞和腫瘤血管內(nèi)皮細胞表面的各種受體的表達狀態(tài)與正常細胞有所不同[3]。此外,腫瘤微環(huán)境在有氧呼吸、血管生成及代謝狀態(tài)等方面與正常組織有明顯差異。具體表現(xiàn)為酸中毒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)表達異常、基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)表達異常等[4]。因此,在腫瘤細胞表面、腫瘤血管內(nèi)皮細胞表面和腫瘤微環(huán)境中具有高表達受體的配體多肽對腫瘤組織具有天然的靶向性。此外,還有許多多肽對細胞中的各種亞細胞器也具有靶向性,如核定位信號肽[5]和線粒體靶向肽[6]。當細胞毒性藥物與這些靶向肽結合后,就可以被靶向傳遞到腫瘤組織中,從而提高藥物的療效和生物利用度,有效避免對正常細胞的損害,降低藥物的全身系統(tǒng)毒性(Systempoxicalpoxide)。

2.1 腫瘤細胞靶向肽

靶向腫瘤細胞多肽的受體往往高度表達在腫瘤細胞表面,如促性腺激素釋放激素受體(GNRHR)、表皮生長因子受體(EGFR)、胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)等。通過靶向腫瘤細胞表面受體的靶向肽對載體材料進行化學修飾,通過包裹藥物制造的PDC,以及患者對藥物的適應性,有效提高細胞毒性藥物的臨床療效和安全性,從而達到直接靶向腫瘤細胞的目的[7]。

Pham等利用轉肽酶A和一種蛋白連接酶在人類紅細胞外囊泡與EGFR靶向肽之間建立共價鍵進行偶聯(lián),促進了體內(nèi)EGFR陽性肺癌細胞對RBCEVs的特異性攝取[8]。此外,將EGFR靶向肽與包載著紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的細胞外囊泡偶聯(lián),顯著增強了該藥物抑制EGFR陽性腫瘤生長的功效。

2.2 腫瘤血管靶向肽

腫瘤生長和增殖、侵襲和轉移對營養(yǎng)的需求較高,在結構和功能上與正常血管不同。因此,腫瘤靶向治療的一種有前景的策略是以腫瘤內(nèi)皮細胞為靶點,向腫瘤組織輸送藥物,避免損傷正常組織。

在血管靶向肽中,研究最多的是能識別腫瘤內(nèi)皮細胞上表達的V3和V5整合素的RGD肽和NGR肽,它們與整合素發(fā)生交聯(lián),進而將目標鎖定在腫瘤血管上。在腫瘤細胞和腫瘤血管內(nèi)皮細胞上,整合素分子僅在正常細胞上有微量的表達。NGR肽能識別并與多種腫瘤血管內(nèi)皮細胞過度表達、對腫瘤選擇性較好的氨基肽酶N(又稱CD13)結合。通過與藥物偶聯(lián)血管靶向肽,實現(xiàn)主動的藥物靶向。當RGD肽(GSSSGRGDSPA)與PEG修飾過的硬脂酸膠束耦合時,通過表達整合素的腫瘤會增加對其的攝取量,從而使膠束攜帶的藥物更多地進入腫瘤細胞。也有研究用C(RGDyK),即環(huán)狀RGD肽,將含有疏水性化療藥物的膠束輸送給癌細胞,使其過度表達整合素。也有報告指出,NGR肽與鉑類抗癌藥的耦合,使腫瘤具有更強的定位和結合性。在脂質上的PEG末端附著NGR和STR-R4肽,促使CD13陽性細胞攝取膠質體[9]。

2.3 細胞器靶向肽

細胞器的獨特生理功能對細胞核、線粒體等細胞器可作為腫瘤治療的目標,對腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移起著至關重要的作用。細胞核(Cellnuclear)是真核細胞中重要的細胞結構,是細胞遺傳與代謝調節(jié)的核心。將藥物靶向到細胞核,可以克服耐藥細胞的外排作用,有效地破壞腫瘤細胞核的結構和功能,造成生理紊亂和細胞凋亡。然而,細胞核外的核膜抑制了細胞核與細胞質的物質運輸,而大分子活性物質進入細胞核需要核靶向分子。細胞核靶向肽可以成功地將細胞毒性藥物運送到細胞核中,被廣泛用于協(xié)助藥物進入細胞核。

線粒體是細胞代謝和有氧呼吸的主要場所,為細胞代謝提供能量。傳統(tǒng)線粒體靶向腫瘤治療由于傳統(tǒng)線粒體靶向藥物系統(tǒng)對腫瘤細胞選擇性低、腫瘤細胞富集少、全身系統(tǒng)毒性較高等缺點,削弱了腫瘤治療效果,因此采用親脂陽離子(如三苯基)作為線粒體靶向基團向線粒體遞送細胞毒性物質。線粒體靶向肽為了克服這些缺點,通常包含線粒體穿膜肽、Szeto-Schiller肽、線粒體靶向序列[10]等帶有正電荷和疏水性的氨基酸,并被提出取代線粒體靶向分子的親脂性陽離子。受損的線粒體會產(chǎn)生激活CASPASE家族蛋白以啟動細胞凋亡的信號,例如活性氧和細胞色素C。所以線粒體是最合適的通過腫瘤光動力治療(Photo Dynamic Therapy,PDT)引發(fā)細胞凋亡的細胞器。Sun等人[11]以RGD肽和KLA肽開發(fā)了一種多階段腫瘤靶向脂質體(RGD/KLA-modified liposome,RGD-KLA-Lip)負載紫杉醇(Paclitaxel,PTX),RGD-KLA-Lip具有對腫瘤細胞和腫瘤血管內(nèi)皮細胞線粒體的靶向運輸作用,促進線粒體介導的細胞凋亡,有效降低細胞毒性藥物的全身系統(tǒng)毒性。

2.4 細胞穿膜肽

細胞穿透肽(Cell-penetratingpeptide,CPP)通常由30個以下的氨基酸組成,主要是堿性氨基酸,是一類能穿透腫瘤細胞的肽類。按有無靶向性分為兩類:以TAT為代表的非靶向穿透肽和以iIRGD為代表的靶向穿透肽。

2.4.1 非靶向穿透肽

TAT蛋白轉導肽是由人類免疫缺陷病毒(Human immun odeficiency virus typel)組成的具有正電的富含堿性氨基酸的多肽,由HIV-1編碼。研究發(fā)現(xiàn),其全長序列和11個堿性氨基酸富集區(qū)的核心肽段(YGRKRQRRR),能攜帶這些外源生物大分子穿透活體細胞的各種生物膜性結構(細胞膜和血腦屏障等),進入胞內(nèi)發(fā)揮生理功能,在包括蛋白質、多肽和核酸在內(nèi)的多種外源生物大分子跨膜轉導過程中發(fā)揮著重要作用,但跨膜傳遞的機理尚待明確。

2.4.2 靶向穿透肽

靶向穿透肽的作用是既能針對目標,又能穿透膜。在腫瘤血管生成過程中,具有RGD(Argine-Glycine-Aspartic,精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)序列的肽能有效誘導內(nèi)皮細胞選擇性地將整合素受體大量表達出來,使之與αvβ3受體結合在腫瘤內(nèi)皮細胞上。經(jīng)RGD靶向肽修飾的納米載體已證實可向腫瘤斑塊血管傳遞藥物、SIRNA、造影劑等[12]。但腫瘤靶向治療的主要障礙是腫瘤血管靶向僅在腫瘤血管內(nèi)和腫瘤血管周圍聚集藥物載體,如何有效地將藥物載體穿透血管壁進入腫瘤本質。

2.5 腫瘤微環(huán)境敏感肽

腫瘤微環(huán)境由免疫細胞、基質細胞、腫瘤細胞和細胞外間質組成,在有氧呼吸、血管生成和代謝狀態(tài)方面與正常組織有明顯不同。腫瘤微環(huán)境的主要生理特征包括微酸度、細胞內(nèi)外巰基物質的不同濃度、部分酶的過度表達和低氧。因此,腫瘤微環(huán)境和正常細胞之間的主要差異為腫瘤靶向治療提供了更多有效的靶點選擇。在眾多的腫瘤微環(huán)境響應肽中,酶敏感、pH敏感[13]和還原敏感的肽已被研究人員廣泛使用。例如,MMP家族參與人體重要的生理和病理過程,在正常組織中少量存在,但在腫瘤微環(huán)境中可高度表達,對腫瘤細胞轉移和侵襲有重要作用。

Qiu等[14]利用含有MMP-2敏感多肽GPLGLAG的可活化細胞穿膜肽(Activatable Cell-penetrating Peptide,ACPP)作為橋梁,在金納米棒(Gold Nanorods,GNRs)表面修飾原啉IX(PPIX),得到GNR-ACPP-PIX納米給藥系統(tǒng)。由于ACPP獨特的U型結構和GNR強烈的近紅外區(qū)光吸收,PpIX的光活性被抑制。當納米系統(tǒng)到達腫瘤組織時,嵌合肽的GPLGLAG肽序列被MMP-2降解,使PEG外殼脫落,細胞穿膜肽暴露,PPIX的光活性得以恢復,從而促使光敏劑富集于過度表達MMP-2的腫瘤細胞。

2.6 治療肽

腫瘤抗原通過人體白細胞抗原(Human Leukocyfe Antigen,HLA)輸送到免疫系統(tǒng)中,由抗原遞呈細胞(APC)攝取和處理腫瘤抗原,并將抗原輸送到T淋巴細胞中的一類免疫細胞中,使免疫系統(tǒng)區(qū)分出正常細胞和腫瘤細胞。從而造成免疫反應。因此,腫瘤抗原多肽尤其是只在腫瘤細胞表達的腫瘤特異性表達抗原肽均可作為免疫治療肽,在以APC和T淋巴細胞為靶點對腫瘤細胞進行免疫治療方面有著巨大潛力。

Bo?l等人[15]報道了一個編碼腫瘤抗原的新基因BAGE,其編碼的ARAVFLAL肽可被T淋巴細胞識別。BAGE 基因在正常組織中沉默,在腫瘤部位特異性表達,編碼的抗原作為細胞毒性T淋巴細胞的靶向肽,引發(fā)免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫應答。

3 已上市PDC藥物使用的靶向肽

目前FDA批準的用于臨床癌癥治療的PDC只有兩種:Melflufen和177Lu-Dotatate。

3.1 Melflufen:靶向氨肽酶的多肽

2021年2月27日,美國食品和藥物管理局(FDA)批準了Oncopeptides公司研發(fā)的用于治療復發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤(RRMM)的melflufen(PEPAXTO?)。Melflufen在總體人群中的總響應率(Overall Response Rate,ORR)為29%,在三級難治性MM患者中的ORR為26%。該藥物將烷基化劑與靶向氨基酶的多肽偶聯(lián)起來,是一種親脂性二肽的乙基酯化物,由美法蘭和對氟-L-苯丙氨酸組成。由于其親脂性,melphalan flufenamide可迅速穿過細胞膜,并幾乎立即被細胞質中的氨基肽酶水解,產(chǎn)生更多的親水烷基分子,如melphalan和desethl-melflufen。所有人類細胞中都存在氨肽酶,并過度表達于包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的各種腫瘤中。

3.2 Lutathera:生長激素抑制素

2018年1月26日,由諾華公司研制出的Lutathera(Lutetium Lu 177 dotatate;Advanced Accelerator Applications)注射液獲得FDA批準上市,是一種放射性標記的體肽類似物,用于治療體肽受體陽性的GEP-NETs成人患者,包括前中后腸的NETs。

177Lu-dotatate是根據(jù)第三階段NETTER-1研究的結果而被批準的。在這項研究中,轉移性中腸神經(jīng)內(nèi)分泌的腫瘤患者每8周接受一次177Lu-dotatate(總劑量為四次)與奧曲肽LAR聯(lián)合使用,與單獨使用LAR相比,在PFS、ORR和OS( Overall Survival,總生存期)方面均有明顯優(yōu)勢。177Lu-Dotatate利用生長激素抑制素作為靶向多肽,結合放射性元素177Lu,在80%以上的高分化神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達出生長抑素受體,從而為將生長抑素類似物作為PDC的歸巢肽提供了理想的靶點。

4 結論

隨著噬菌體展示技術、多肽固相合成技術和計算機輔助多肽設計等技術的快速發(fā)展,越來越多的新型腫瘤靶向多肽偶聯(lián)藥物被開發(fā)出[16]。靶向多肽因其多重優(yōu)勢而被廣泛用于早期癌癥檢測、癌癥靶向治療和腫瘤治療劑的合成。然而,特異性強、毒性較小的多肽的高效篩選、靶向多肽藥物的作用機制和臨床應用,以及尋找更有效的靶點,是需要不斷研究的問題。