連續(xù)流動(dòng)分析法測(cè)定堅(jiān)果中總氰

陳祝軍，秦園，吳梅，吳建兵，朱楠，沈怡佳

張家港市疾病預(yù)防控制中心（蘇州 215600）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的日益提高，腰果、核桃、開(kāi)心果、杏仁、碧根果等堅(jiān)果業(yè)已成為人民休閑食品首先[1]。氰化物在自然界中廣泛存在，在食品中主要以氰苷形式存在，含有這些有毒物質(zhì)的食物被食用后，在人體β-葡萄糖苷酶等酶或者胃酸的作用下，可水解成氫氰酸，可以引起慢性、急性中毒，同時(shí)伴有蛋白質(zhì)代謝障礙，容易引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2-5]。目前，食品中氰化物的測(cè)定方法有銀量法[6-7]、比色法[8-9]、極譜法[10-11]、離子色譜法[12-13]、氣相色譜法[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]等。GB 5009.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測(cè)定》[18]中氰化物的測(cè)定采用比色法、氣相色譜法，需要對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾、衍生處理，步驟復(fù)雜，消耗化學(xué)試劑多，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染且耗時(shí)耗力。文章參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]，采用0.30 mol/L NaOH溶液、70 ℃超聲60 min，取上清液離心后經(jīng)連續(xù)流動(dòng)注射儀分析，樣品不需要預(yù)蒸餾，簡(jiǎn)化了操作步驟，減少了試劑的使用，適合用于大批量樣品的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏仁、腰果、南瓜子、葵花子、巴旦木、核桃（市售），各0.5 kg，分別用粉碎機(jī)粉碎成均勻的粉末，經(jīng)0.125 mm過(guò)篩，保存至密封罐中待用。

氰化物標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)BW 20005-50-W-50，質(zhì)量濃度為50.0 mg/L，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；檸檬酸（分析純，天津市博迪化工有限公司）；氫氧化鈉（分析純，上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠）；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；氯胺T、1, 3-二甲基巴比妥酸、異煙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉（分析純，江蘇永華精細(xì)化學(xué)有限公司）。

SAN++型連續(xù)流動(dòng)分析儀，配備全自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，600 nm濾光片（荷蘭SKALAR公司）；TU-1901分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；Simplicity? UV型純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；KQ-300 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA 2004電子天平（上海上平儀器有限公司）；MIKRO 22離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.001 g）樣品粉末于250 mL碘量瓶中，加入50 mL 0.30 mol/LNaOH浸提液，加蓋密封后，振蕩渦旋混勻，經(jīng)70 ℃超聲提取60 min，取出冷卻，取浸提液離心后，供測(cè)定使用。

1.2.2 工作試劑及儀器參數(shù)

1.2.2.1 工作試劑

連續(xù)流動(dòng)分析法：（A）蒸餾試劑，20 g檸檬酸+100 mL 氫氧化鈉（0.4 mol/L）+25 mL鹽酸（1.0 mol/L），用純水定容至1.0 L；（B）緩沖試劑：2.3 g NaOH+20.5 g鄰苯二甲酸氫鉀溶解于1.0 L純水中；（C）氧化劑：2.0 g氯胺T溶解于1.0 L純水中；（D）顯色劑：16.8 g 1, 3-二甲基巴比妥酸+13.6 g異煙酸+7.0 g NaOH溶解于1.0 L純水中，并用鹽酸（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)pH至5.2。

分光光度法：（A）緩沖試劑：34.0 g磷酸二氫鉀+35.5 g磷酸二氫鈉溶解于1.0 L純水中；（B）氧化劑：1.0 g氯胺T溶解于100 mL純水中；（C）顯色劑：1.5 g異煙酸溶于24.0 mL NaOH（20.0 g/L）溶液中+0.25 g吡唑酮溶于20 mLN-二甲基甲酰胺中。

1.2.2.2 儀器參數(shù)

連續(xù)流動(dòng)分析儀樣品檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm，起始忽略時(shí)間為1 000 s，終末忽略時(shí)間為120 s，自發(fā)時(shí)間為1 800 s，蒸餾溫度125 ℃，檢測(cè)溫度為37 ℃。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置

準(zhǔn)確吸取1.0 mL總氰標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶中，用0.03 mol/L NaOH溶液稀釋并定容至刻度，配制成1 mg/L總氰標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，待用。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：將100 μg/L總氰標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.0，10，20，50，80和100 μg/L的工作液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 計(jì)算公式

樣品中總氰的含量按式（1）計(jì)算。

式中：W為樣品中總氰的含量，mg/kg；C為浸提液中總氰的質(zhì)量濃度，μg/L；V為浸提液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；F為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件，整理、計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)。使用SPSS 18.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)數(shù)據(jù)采樣Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 浸提液濃度的選擇

杏仁中的總氰可由NaOH溶液浸出提取。此次試驗(yàn)考察了不同濃度0.05，0.10，0.15，0.30，0.50 mol/L NaOH溶液對(duì)杏仁中總氰的浸提效力。試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著NaOH濃度升高，總氰的浸出含量增高，NaOH溶液濃度為0.30 mol/L時(shí)，杏仁中總氰的浸出含量達(dá)到最高（見(jiàn)圖1），因此選擇0.30 mol/L NaOH溶液用于樣品浸提。

圖1 不同濃度浸提液對(duì)總氰的浸提效力

2.1.2 浸提時(shí)間的優(yōu)化

此次試驗(yàn)進(jìn)一步考察了浸提時(shí)間對(duì)樣品中總氰的浸提效力影響。樣品在0.30 mol/L NaOH浸提液中70 ℃超聲分別提取30，60和90 min（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明，總氰的浸出含量在60 min時(shí)達(dá)到峰值，之后趨于穩(wěn)定，為防止浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)總氰揮發(fā)減少，選擇60 min作為超聲提取時(shí)間。

圖2 不同浸提液時(shí)間對(duì)總氰的浸提效力

2.1.3 浸提溫度的優(yōu)化

此次試驗(yàn)進(jìn)一步考察了浸提時(shí)間對(duì)樣品中總氰的浸提效力影響。樣品在0.30 mol/L NaOH浸提液中分別在30，50，70和90 ℃溫度下超聲提取60 min（見(jiàn)圖3），結(jié)果表明，總氰的浸出含量在70 min時(shí)達(dá)到峰值，之后趨于穩(wěn)定，為防止浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致總氰受熱分解揮發(fā)，選擇70 ℃作為超聲提取溫度。

圖3 不同浸提液溫度對(duì)總氰的浸提效力

2.2 檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

以100 μg/L總氰標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為初始溶液，用0.03 mol/L NaOH溶液稀釋成5.0 μg/L總氰工作液，重復(fù)測(cè)定11次，以其響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為儀器檢出限為0.5 μg/L，此方法中總氰的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg（樣品量以0.5 g計(jì)）。以總氰溶液濃度（x，μg/L）對(duì)各濃度對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰高（y）作線性回歸分析，總氰在0～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好線性方程：y=0.000 6x+0.000 2，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 5。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

對(duì)杏仁樣品做2.50，7.50和12.50 mg/kg三個(gè)水平總氰添加試驗(yàn)，按1.2.1小節(jié)進(jìn)行樣品處理后，經(jīng)連續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)濃度水平單獨(dú)測(cè)定6次。試驗(yàn)結(jié)果顯示：在不同加標(biāo)水平下，總氰的回收率為92.4%～108.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.3%～2.0%，見(jiàn)表1。

表1 連續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)杏仁中總氰加標(biāo)回收率和SRSD結(jié)果（n=6）

2.4 方法對(duì)比

運(yùn)用超聲提取-連續(xù)流動(dòng)分析法和GB 5009.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測(cè)定》[18]第一法分光光度法同時(shí)檢測(cè)6種堅(jiān)果樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，Z=-0.105，P=0.917＞0.05，顯示兩種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩種方法對(duì)不同樣品中總氰含量的檢測(cè)結(jié)果單位：mg/kg

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)對(duì)堅(jiān)果中總氰浸提的前處理?xiàng)l件進(jìn)行了考察，以0.30 mol/L NaOH溶液、70 ℃超聲60 min為優(yōu)化的前處理方法，有效地提取了堅(jiān)果中總氰，并通過(guò)連續(xù)流動(dòng)分析法進(jìn)行總氰濃度檢測(cè)。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法總氰的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg，加標(biāo)回收率為92.4%～108.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～2.0%（n=6）。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，超聲提取-連續(xù)流動(dòng)分析法測(cè)定結(jié)果與GB 5009.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測(cè)定》[18]第一法分光光度法測(cè)定結(jié)果相比較，Z=-0.105，P=0.917＞0.05，測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明方法可靠。此次試驗(yàn)所建立的超聲提取-連續(xù)流動(dòng)分析法利用電腦軟件整合了試劑混合、加熱、蒸餾等程序，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)自動(dòng)化，減少試劑用量，且靈敏度高、精密度、準(zhǔn)確度好，可作為大批量食品樣品中氰化物的檢測(cè)方法之一。