黑豆不同發(fā)芽期多酚、黃酮及抗氧化活性分析

李楠，孟航婷，孫元琳，王芮東

1. 運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系（運(yùn)城 044000）；2. 運(yùn)城學(xué)院理科實(shí)驗(yàn)中心（運(yùn)城 044000）

黑豆（Glycine maxVar）是豆科植物的黑色種子，含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素、酚類物質(zhì)、異黃酮、花青素等，可以降低血脂，促進(jìn)膽固醇的代謝，具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤等作用[1-2]。但黑豆中也含有蛋白酶抑制劑、植酸、脂肪氧化酶等抗?fàn)I養(yǎng)成分，影響黑豆在體內(nèi)的生物利用度，因此，如何消除這些抗?fàn)I養(yǎng)成分，并最大限度保留黑豆中原有的營養(yǎng)素，成為亟待解決的問題。有研究表明，發(fā)芽能夠激活種子的內(nèi)源酶和代謝通路，豆類等經(jīng)過發(fā)芽后，其化學(xué)組分會(huì)發(fā)生改變，抗?fàn)I養(yǎng)因子減少，某些活性成分增加，食品的感官性能和風(fēng)味得以改善，實(shí)用價(jià)值及保健功能提高[3-5]。Okumura等[6]的研究發(fā)現(xiàn)蠶豆芽中的酚類化合物為山奈酚，蠶豆發(fā)芽后其抗氧化性高于未發(fā)芽蠶豆和其他豆類。羅旭等[7]通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大豆萌芽過程中活性物質(zhì)增加，特別是總多酚和總黃酮含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)。杜高發(fā)等[8]發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆在發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)含量下降而氨基酸含量升高，不溶性膳食纖維含量下降而可溶性膳食纖維含量升高。鮑會(huì)梅[9]發(fā)現(xiàn)黑豆發(fā)芽過程中葉綠素、維生素C、異黃酮、多酚等成分增加，發(fā)芽5～6 d營養(yǎng)價(jià)值最高。所以，豆類發(fā)芽并開發(fā)芽苗菜產(chǎn)品受到密切關(guān)注。

黑豆在水培發(fā)芽過程中，多酚、黃酮等活性物質(zhì)含量及抗氧化活性如何變化尚不清楚，因此以黑豆為原料，于25 ℃水培發(fā)芽，每隔12 h采樣，測(cè)定黑豆不同發(fā)芽期多酚、黃酮、花青素含量的變化和對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力，并分析活性物質(zhì)與抗氧化活性之間的相關(guān)性，以期為黑豆資源的多元化利用、黑豆芽苗菜的選育及黑豆芽苗菜功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆（產(chǎn)自山東省濟(jì)寧市）。沒食子酸、福林酚、蘆丁、DPPH、ABTS（合肥博美生物科技有限公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫等（均為市售，分析純）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV 5500PC紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；FA1604電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；LK-800A搖擺式中藥粉碎機(jī)（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；TDL6M離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)（杭州奧立龍儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑豆發(fā)芽條件

選取顆粒飽滿的黑豆，用蒸餾水沖洗以去除表面灰塵，用蒸餾水浸泡8 h，將黑豆單層均勻平鋪于發(fā)芽器網(wǎng)格盤中，底盤中加入適量蒸餾水，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每6～8 h噴1次水，每隔12 h收集發(fā)芽的黑豆[10]。

1.3.2 樣品前處理

將收集的樣品置于50 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，直至恒重，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過0.180 mm孔徑（80目）篩。將樣品粉末用沸程30～60 ℃的石油醚浸泡12 h，以除去其中的油脂，脫脂后的樣品粉末置于通風(fēng)處，揮干溶劑，置于密封袋中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹11]。

稱取1 g脫脂樣品粉末，加入30 mL 70%乙醇，避光超聲提取30 min，提取溫度70 ℃，功率300 W，在3 000 r/min下離心15 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液并定容至100 mL得樣品提取液[12]。

1.3.3 活性物質(zhì)測(cè)定方法

1.3.3.1 多酚含量測(cè)定

參考王飛霞等[13]的方法并稍做修改。準(zhǔn)確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL的0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mL福林酚試劑，反應(yīng)5 min，加入2 mL 15%的NaCO3，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)60 min，于765 nm波長處測(cè)定其吸光度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.916 9x+0.117 8，R2=0.971 1，其中x為沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL），y為吸光度。準(zhǔn)確吸取1 mL樣品提取液，按照上述方法測(cè)定其吸光度，并將結(jié)果換算成多酚含量。

1.3.3.2 黃酮含量測(cè)定

參考南海娟等[14]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL的0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加0.2 mL 5% NaNO2；6 min后，加0.2 mL 10% Al(NO3)3；6 min后，加入2 mL 4% NaOH，用60%乙醇定容至10 mL，混勻，避光反應(yīng)15 min，在波長510 nm處測(cè)定吸光度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.086 8x-0.002 1，R2=0.996 3，其中x為蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），y為吸光度。準(zhǔn)確吸取1 mL樣品提取液，按照上述方法測(cè)定其吸光度，并將結(jié)果換算成黃酮含量。

1.3.3.3 花青素含量測(cè)定

參考汪洋等[15]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂樣品粉末，加入1%鹽酸-乙醇混合液40 mL，于55℃水浴浸提120 min。冷卻至室溫后過濾，得樣品溶液。采用消光系數(shù)法測(cè)定花青素含量。在波長525 nm下測(cè)定樣品的吸光度，按照式（1）計(jì)算花青素含量（mg/g）。

式中：A為樣品吸光度；V為定容體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；98.2為花色苷平均消光系數(shù)。

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定方法

1.3.4.1 對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定

參考趙巧玲等[16]的方法并稍作修改。取2.0 mL樣品提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測(cè)定樣品組吸光度。根據(jù)式（2）求DPPH·清除率。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為樣品本底吸光度；A0為以蒸餾水代替樣品提取液的空白對(duì)照吸光度。

1.3.4.2 對(duì)ABTS+·清除率的測(cè)定

參考胡治遠(yuǎn)等[17]的方法并取樣品提取液0.1 mL測(cè)定對(duì)ABTS+·清除率，根據(jù)式（2）計(jì)算對(duì)ABTS+·清除率。

1.3.4.3 對(duì)·OH清除率的測(cè)定

參考蔡萌等[18]的方法，根據(jù)式（2）求對(duì)·OH清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量變化

由圖1可知，多酚含量在前48 h變化不顯著（P＜0.05），后呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，發(fā)芽至84 h時(shí)，多酚含量達(dá)到最大值，為8.3 mg/g，與發(fā)芽72 h和96 h差異顯著（P＜0.05）。推測(cè)是因?yàn)楹诙拱l(fā)芽后，會(huì)激活苯丙烷代謝途徑，相關(guān)酶活力增加，降解細(xì)胞壁周圍的成分，因而酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖之間的共價(jià)鍵被破壞，結(jié)合酚被釋放從而游離出來，使總酚含量呈上升趨勢(shì)[19]。另外，多酚含量變化趨勢(shì)與多酚氧化酶的含量及活性相關(guān)，發(fā)芽初期，多酚氧化酶活性較高，會(huì)氧化分解一部分多酚化合物，因而發(fā)芽前48 h多酚含量變化不顯著，隨著發(fā)芽時(shí)間延長，多酚氧化酶的活力逐漸下降，多酚含量也隨之增加[20]。結(jié)果表明黑豆發(fā)芽后，多酚含量會(huì)顯著增加。

圖1 黑豆不同發(fā)芽期多酚含量的變化

2.2 黃酮含量變化

由圖2可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，黃酮含量呈上升趨勢(shì)，從發(fā)芽12 h到發(fā)芽96 h，其含量增加3.9 mg/g，表明黑豆在發(fā)芽過程中進(jìn)行黃酮的合成。有研究表明，苯丙氨酸氨解酶是黃酮類次生代謝產(chǎn)物形成的關(guān)鍵酶，在種子發(fā)芽初期，酶活力較低，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，呼吸作用增強(qiáng)，酶的種類和數(shù)量增加，酶活性不斷提高[9]，所以黑豆發(fā)芽過程中黃酮含量不斷上升。

圖2 黑豆不同發(fā)芽期黃酮含量的變化

2.3 花青素含量變化

由圖3可知，花青素含量在黑豆發(fā)芽過程中不斷下降。黑豆在發(fā)芽12 h時(shí)，其花青素含量最高，為3.635 mg/g，發(fā)芽96 h時(shí)其含量最低，為0.267 mg/g，下降值為3.369 mg/g。不同發(fā)芽時(shí)間花青素含量存在顯著性差異（P＜0.05）。趙巧玲等[16]研究結(jié)果表明，在武鄉(xiāng)小黑豆發(fā)芽過程中，其種皮花色苷含量逐漸降低，與試驗(yàn)結(jié)果相似。黑豆中花青素主要集中在黑豆表皮，是一種水溶性植物色素，浸泡黑豆時(shí)，花青素溶解在水中，含量降低，發(fā)芽過程中淋水也會(huì)造成花青素含量的損失[21]。所以隨發(fā)芽時(shí)間延長，花青素含量降低。

圖3 黑豆不同發(fā)芽期花青素含量的變化

2.4 抗氧化活性變化

由圖4（A）可知，黑豆發(fā)芽過程中，對(duì)DPPH·清除率先略微下降后呈一直上升趨勢(shì)，發(fā)芽24 h時(shí)對(duì)DPPH·清除率最弱，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，在84 h時(shí)達(dá)到最大值，為57.18%。由圖4（B）可知，其對(duì)ABTS+·清除率呈上升趨勢(shì)，在96 h時(shí)達(dá)到最大值，為54.78%。由圖4（C）可知，其對(duì)·OH的清除率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，在72 h時(shí)清除率最大，為26.13%。

圖4 黑豆不同發(fā)芽期對(duì)不同自由基清除率的變化

多酚與黃酮類化合物是植物的主要次生代謝產(chǎn)物，種子萌芽會(huì)激發(fā)種子內(nèi)大量酶的活性，使多酚與黃酮等次級(jí)代謝產(chǎn)物大量生成，而多酚和黃酮是天然的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化及清除自由基的能力，所以，在黑豆發(fā)芽過程中，隨著發(fā)芽時(shí)間延長，對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率逐漸升高。李麗等[22]研究表明，赤小豆在發(fā)芽過程中抗氧化能力明顯提升，在第5天達(dá)到最高，并得出發(fā)揮抗氧化作用的主要成分為4種酚酸和7種黃酮類物質(zhì)。呂俊麗等[19]在研究發(fā)芽對(duì)莜麥體外抗氧化能力的影響時(shí)，得出隨著發(fā)芽時(shí)間延長，莜麥總還原能力、對(duì)DPPH·和羥基自由基的清除能力增強(qiáng)的結(jié)論，與試驗(yàn)結(jié)果相似。

2.5 相關(guān)性分析

用SPSS軟件對(duì)不同發(fā)芽時(shí)間黑豆多酚、黃酮、花青素含量與其對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率做相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1 多酚、黃酮、花青素含量與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)

不同發(fā)芽時(shí)間黑豆多酚、黃酮含量與其對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相關(guān)性（P＜0.05），多酚含量和3種自由基清除率相關(guān)系數(shù)分別為0.950，0.767和0.778，黃酮含量和3種自由基清除率相關(guān)系數(shù)分別為0.830，0.959和0.761，表明多酚、黃酮含量均和3種自由基清除率顯著正相關(guān)?；ㄇ嗨睾颗c上述自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。馬燕等[23]在研究發(fā)芽對(duì)小麥抗氧化能力的影響時(shí)證實(shí)，不同生長階段的小麥總酚含量與自由基清除率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與試驗(yàn)結(jié)果相同。趙齊燕等[24]的研究發(fā)現(xiàn)紫云英苗菜的總酚、總黃酮含量與DPPH·、ABTS+·清除能力顯著相關(guān)，且貢獻(xiàn)率較大的活性物質(zhì)為山奈酚、槲皮素和阿魏酸。趙天瑤等[25]發(fā)現(xiàn)豆類種子中酚類物質(zhì)含量與抗氧化性存在正相關(guān)關(guān)系，在黑豆發(fā)芽過程中，會(huì)積累多酚及黃酮類物質(zhì)，其清除自由基能力增加，所以，黑豆發(fā)芽后，營養(yǎng)價(jià)值及保健功能得以提升。

3 結(jié)論

探究黑豆水培發(fā)芽過程中多酚、黃酮等活性物質(zhì)和抗氧化活性的變化，結(jié)果表明黑豆發(fā)芽過程中多酚、黃酮含量呈不斷上升趨勢(shì)，花青素呈下降趨勢(shì)，相對(duì)于萌芽初期，多酚及黃酮含量增加顯著（P＜0.05）。黑豆發(fā)芽過程中對(duì)DPPH·清除率先略微下降后一直上升，對(duì)ABTS+·清除率一直增加，對(duì)·OH清除率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明，不同發(fā)芽期多酚、黃酮含量與其對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相關(guān)性（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果為黑豆的綜合利用和進(jìn)一步開發(fā)黑豆芽苗菜功能性食品提供數(shù)據(jù)支撐。