谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對酒精性肝損傷的保護(hù)作用

孫錦，張小麗，王瑩瑩，唐銅，程倩，陳智仙

1. 酵母功能湖北省重點實驗室（宜昌 443000）；2. 宜昌市營養(yǎng)健康食品工程技術(shù)研究中心（宜昌 443000）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸縮合而成的三肽化合物，大量存在于酵母、小麥胚芽、動物和人體肝臟、腎臟及紅細(xì)胞中[1]。GSH主要以還原型形態(tài)存在于真核細(xì)胞，約90%分布于胞漿，還有少量分布在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核[2]，其極易被氧化為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），因此對維持細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原環(huán)境具有重要作用[3]。藥理學(xué)研究證實谷胱甘肽具有抗氧化[4]、解毒[5]、調(diào)控免疫[6]等作用，臨床上用于治療或輔助治療肝臟疾病[7]、胰腺疾病[8]、腎臟疾病[9]、帕金森病[10]、急性心肌梗死[11]等。硒是生物體所必需的微量營養(yǎng)元素之一，其作為谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）的活性中心，在清除體內(nèi)活性氧自由基方面有重要作用[12]。酵母具有較高的富硒能力，能將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，降低無機(jī)硒的毒性、提高生物利用度。另外，除了補充硒元素外，富硒酵母還能同時提供豐富的B族維生素、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[13]。已有研究表明富硒酵母具有預(yù)防腫瘤[14]、降血糖[15]、降血脂[16]、降血壓[17]、增強(qiáng)人體免疫力[18]等諸多功效。

我國酒文化源遠(yuǎn)流長，無酒不成席的飲食習(xí)俗也導(dǎo)致酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是我國常見的肝臟疾病之一，并且發(fā)病年齡逐漸年輕化。肝實質(zhì)細(xì)胞是乙醇代謝的主要場所，長期或過量飲酒使得肝實質(zhì)細(xì)胞一直受到乙醇及其代謝產(chǎn)物的刺激，從而誘導(dǎo)線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積、脂肪堆積等，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[19]。已有研究證實谷胱甘肽能明顯改善酒精性肝損傷，促進(jìn)酒精性肝病的恢復(fù)[20]。此外，有研究指出富硒酵母對化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[21]。然而，谷胱甘肽和富硒酵母聯(lián)合對酒精性肝損傷的保護(hù)作用尚鮮見報道。因此，試驗將谷胱甘肽與富硒酵母混合制得谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑，通過小鼠試驗研究其對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為保健食品的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑（安琪酵母股份有限公司），成人體重按60 kg計算，折合人體推薦量為0.016 7 g/（kg·Bw）。

1.2 儀器及試劑

T6新世紀(jì)紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS-420全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；RM2235切片機(jī)（德國Leica公司）；YABO-400組織包埋機(jī)（常州雅博電子設(shè)備有限公司）；HD-330攤片烤片機(jī)（湖北慧達(dá)儀器有限公司）。

丙二醛（MDA）測定試劑盒、還原型GSH測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、無水乙醇（分析純）、甲醛等。

1.3 試驗動物

由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的S P F 級昆明種雄性小鼠5 0 只（質(zhì)量合格證號61001700003135），體重18～22 g，生產(chǎn)許可證號SCXK（陜）2018-001。試驗動物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號SYXK（陜）2018-009，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%。動物飼料、墊料均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

分別稱取0.50，0.33和0.17 g樣品，依次加蒸餾水至20 mL，混合混勻，分別配成濃度為2.50%，1.65%和0.85%的混懸液，備用。

1.4.2 動物分組及處理

隨機(jī)將雄性小鼠分為5組，每組10只，分別為陰性對照組、模型對照組及高、中、低3個劑量組。3個劑量組分別給予0.50，0.33和0.17 g/（kg·Bw）的樣品（相當(dāng)于人體每日推薦量的30，20和10倍），陰性對照組和模型對照組給予同等體積的蒸餾水，按20 mL/（kg·Bw）每天經(jīng)口灌胃1次。每周稱2次體重，以此調(diào)整受試樣品灌胃體積。在試驗第30天時將模型對照組和3個劑量組，一次經(jīng)口灌胃50%乙醇溶液，劑量為12 mL/（kg·Bw），陰性對照組給予同體積的蒸餾水，禁食不禁水16 h后稱終體重，頸椎脫臼處死。

1.4.3 小鼠肝臟組織生化指標(biāo)的檢測

取0.50 g處死后小鼠的肝臟，按1∶9 g/mL加入生理鹽水，勻漿后按3 000 r/min離心10 min，取上清液，制得10%肝勻漿，然后按照試劑盒要求進(jìn)行各項指標(biāo)（MDA、還原型GSH、TG）的檢測。

1.4.4 小鼠肝臟組織病理學(xué)診斷

將各組動物肝臟從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹Ⅲ染色。在光學(xué)顯微鏡下采用40倍物鏡從肝臟的一端視野開始連續(xù)觀察整個染色組織切片，主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積，分別記錄每個視野中的各種病變所占視野的面積，累計所有視野觀察情況，根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)分別對樣品的肝臟脂質(zhì)蓄積情況進(jìn)行評分，以此評估肝細(xì)胞損傷程度。詳細(xì)評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.4.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Minitab軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）測定統(tǒng)計學(xué)顯著性，P＜0.05被認(rèn)定為組間具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

1.5 評定標(biāo)準(zhǔn)

在酒精性肝損傷模型成立的前提下，肝臟MDA、還原型GSH和TG這3項檢測指標(biāo)結(jié)果陽性，或者肝臟MDA、還原型GSH和TG這3項指標(biāo)中任2項指標(biāo)陽性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果陽性，滿足以上任一條件，可判定受試樣品具有對酒精性肝損傷有輔助保護(hù)作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對小鼠體重的影響

試驗期間，各組小鼠生長發(fā)育良好，飲食飲水正常。通過對各組小鼠體重的檢測發(fā)現(xiàn)（表2），谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑各劑量組與陰性對照組比較，小鼠的體重增長無顯著變化（P＞0.05），表明谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對小鼠體重?zé)o影響，可初步判斷谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑具有一定安全性。另外，模型對照組小鼠與陰性對照組比較，體重增長也無顯著變化（P＞0.05），排除體重對結(jié)果的影響。

表2 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對各組試驗小鼠體重的影響

2.2 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對小鼠肝勻漿中MDA、還原型GSH、TG含量的影響

在試驗第30天按照12 mL/（kg·Bw）的劑量給予模型對照組和陰性對照組小鼠50%乙醇，以此建立急性酒精性肝損傷模型。由圖1所示，與陰性對照組比較，模型對照組小鼠肝組織中MDA值升高，還原型GSH值降低，TG值升高，差異均有極顯著性（P＜0.01），說明試驗?zāi)Ｐ统闪ⅰＳ蓤D1（a）所示，與模型對照組比較，各劑量組小鼠肝組織中MDA值均無明顯降低，差異均無顯著性（P＞0.05）。由圖1（b）所示，相比于模型對照組，高劑量小鼠組肝組織中還原型GSH值升高，差異有極顯著性（P＜0.01）。由圖1（c）所示，相比于模型對照組，高劑量組小鼠肝組織中TG值降低，差異有顯著性（P＜0.05）。由此判定還原型GSH和TG值2項指標(biāo)結(jié)果均為陽性。

圖1 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對肝組織中MDA（a）、還原型GSH（b）、TG（c）含量的影響

2.3 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

觀察各組小鼠肝組織病理切片，以肝臟脂質(zhì)蓄積情況進(jìn)行評分。由表3可見，模型對照組與陰性對照組比較，肝臟脂肪細(xì)胞變性評分在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異（P＜0.01），說明小鼠酒精性肝損傷模型造模成功。與模型組比較，各劑量組肝細(xì)胞脂肪變性程度均減輕，高、中劑量組與模型對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。病理組織學(xué)指標(biāo)可判斷為陽性。

表3 谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

3 結(jié)論

肝實質(zhì)細(xì)胞是乙醇代謝的主要場所，乙醇被細(xì)胞質(zhì)中的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成醛類，進(jìn)入線粒體，在乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的作用下還原為乙酸，從而排出體外起到解毒作用[22]。在乙醇代謝的過程中，會產(chǎn)生大量ROS。長期和/或大量飲酒使得ROS蓄積，造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷、脂肪變性、炎癥反應(yīng)等，最終造成嚴(yán)重的肝損傷[23]。過量的ROS與生物膜不飽和脂肪酸作用，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，引起MAD含量升高，因此MAD含量能間接反映肝細(xì)胞膜的受損程度[24]。另外，ROS的增加量也遠(yuǎn)高于還原型GSH等抗氧化劑的量，將消耗體內(nèi)的還原型GSH，使還原型GSH含量降低[25]。同時乙醇的攝入通過下調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)間接刺激固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)多種脂肪酶的合成，從而促進(jìn)TG的合成并在肝臟中沉積，使其含量不斷升高[26-27]。

試驗中，通過測定比較不同組別小鼠肝組織中的MDA、還原型GSH、TG的含量，評估酒精肝損傷模型的建立效果，以及受試樣品對肝臟的保護(hù)作用。將模型對照組與陰性對照組比較，其MDA值升高，還原型GSH值降低，TG值升高，且具有極顯著性差異，說明試驗中酒精性肝損傷的模型建立成功，試驗方法可靠。與模型對照組比較，受試樣品高劑量組的還原型GSH值顯著升高，TG值顯著降低，說明該受試樣品具有降低酒精性肝損傷小鼠肝臟TG含量，并升高還原型GSH含量的作用。同時，通過觀察肝臟組織病理變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組比較，模型對照組的肝組織病變嚴(yán)重，肝臟脂肪細(xì)胞變性評分顯著升高，進(jìn)一步驗證酒精肝損傷模型建立成功。而與模型對照組比較，受試樣品各劑量組肝細(xì)胞脂肪變性程度均減輕，且高、中劑量組有顯著性差異，說明該受試樣品能保護(hù)小鼠肝臟細(xì)胞，減輕脂肪變性。試驗結(jié)果證實，谷胱甘肽富硒酵母復(fù)合制劑對酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用。