奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的研究及消除

劉超，呂雪梅，景贊

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺是一種三嗪類含氮環(huán)有機化合物[1]，被廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、建筑等領域。由于對身體有害，在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考中，三聚氰胺就在2B類致癌物清單中[2-4]。三聚氰胺的檢測方法主要有重量法、電位滴定法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法[5-7]。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）具有選擇性好、分析效率高、靈敏度高、定性能力強、定量準確等優(yōu)點[8-9]，成為檢測原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的主要方法。但液質(zhì)聯(lián)用檢測食品中三聚氰胺時存在顯著的基質(zhì)效應，必須采取有效的措施減弱或消除基質(zhì)效應才能得到準確結(jié)果[10]。

基質(zhì)效應是指因目標分析物不穩(wěn)定或基質(zhì)中干擾組分讓目標分析物發(fā)生改變，如聚合、酯化等，或是干擾組分與目標分析物的保留時間相同，干擾組分弱化目標分析物的離子化[11-13]。

基于此，試驗考察取樣量、凈化方式、溶劑種類、溶劑用量、三聚氰胺不同濃度等可能影響基質(zhì)效應的因素，并采用同位素內(nèi)標法[14-17]消除樣品中的基質(zhì)效應，提高試驗的準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

DGU-20A-API3200高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)者儀（AB SCIEX公司）；ES-E120B II電子天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；TS209358氮吹儀（塔爾博伊斯有限公司）；FUP PT18H高速冷凍離心機（青島法特通訊科技有限公司）；SHA-B數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（唐山力辰科技有限公司）；KQ-1000VDE數(shù)控超聲波清洗機（昆山舒美超聲儀器有限公司）；UPA-L超純水機（唐山力辰科技有限公司）；JRY12固相萃取儀（湖南金蓉儀器設備有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL，沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；三聚氰胺標準品（99.0%，批號：G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內(nèi)標標準品（Melamine-13 C3 100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；水為實驗室一級用水。

奶粉樣品：蒙牛成人奶粉、荷蘭乳牛中老年配方奶粉、蒙牛女士高鈣脫脂奶粉、光明全脂奶粉、河套脫脂奶粉、伊利全脂甜奶粉、飛鶴全脂甜奶粉，均為市售，標為1～7。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中4.4.1.1提取、4.4.2凈化的方法。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標準及內(nèi)標中間液

三聚氰胺標準中間液：準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

三聚氰胺內(nèi)標中間液：準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測條件

1.6.1 液相條件

色譜柱為強陽離子交換與C18混合填料，混合比例（1∶4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液-乙腈（1∶1，V/V），用乙酸調(diào)至pH 3；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min。

1.6.2 質(zhì)譜條件

掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；霧化氣為氮氣，30 psi；干燥氣為氮氣，30 psi；離子化溫度450 ℃。

1.7 基質(zhì)效應評價方法

運用定量測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應程度，通過式（1）計算二者比值來評價基質(zhì)效應。

式中：A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。A/B＜80%，對分析物的響應產(chǎn)生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產(chǎn)生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對基質(zhì)效應的影響

各種奶粉分別取0.50和1.00 g（精確至0.01 g）樣品，按照1.3進行樣品處理，處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質(zhì)效應是否有顯著性影響，結(jié)果見表1和圖1。

圖1 取樣量對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表1 取樣量對基質(zhì)效應的影響

取樣量對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的統(tǒng)計分析結(jié)果如表1所示。因全粉P值＜0.05，因此取樣量對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應存在顯著性差異，即存在明顯基質(zhì)效應。由圖1可知，取樣量0.50和1.00 g對奶粉中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別為37.7%～30.6%和21.0%～28.3%。

2.2 溶劑種類對基質(zhì)效應的影響

各種奶粉分別取4份1.00 g（精確至0.01 g樣品），分別編號①②③④。編號①，每份奶粉都加入10 mL水；編號②，每份奶粉都分別加入6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水；編號③，每份奶粉都分別加入10 mL三氯乙酸（1%）；編號④，每份奶粉都分別加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈。所有樣品超聲提取10 min后，按照1.3處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質(zhì)效應是否有顯著性影響，結(jié)果見表2和圖2。

圖2 不同溶劑對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表2 溶劑種類對基質(zhì)效應的影響

不同溶劑對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的統(tǒng)計分析結(jié)果如表2所示。因奶粉P值均＜0.05，因此溶劑種類對分析奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應存在顯著性差異，即存在明顯基質(zhì)效應。由圖2可知，提取溶劑種類對分析物的基質(zhì)效應差異性除三氯乙酸與V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之間沒有顯著性差異，其余均有差異顯著。進一步計算水、V乙腈∶V水=3∶2、三氯乙酸和V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1對奶粉中三聚氰胺的基質(zhì)效應，分別為30.7%～39.3%，23.8%～32.4%，14.9%～23.1%及15.9%～24.8%。提取溶劑種類對分析物的基質(zhì)效應差異性除三氯乙酸與V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之間沒有顯著性差異，不存在基質(zhì)效應，其余存在基質(zhì)效應。

2.3 溶劑用量對基質(zhì)效應的影響

分別取3份各奶粉樣品1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的3份樣品分別編號為①②③。編號①，每個樣品分別加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈；編號②，每個樣品分別加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈；編號③，每個樣品分別加入12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。按照1.3處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質(zhì)效應是否有顯著性影響，結(jié)果見表3和圖3。

圖3 溶劑用量對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表3 溶劑用量對基質(zhì)效應的影響

溶劑用量對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的統(tǒng)計分析結(jié)果如表3所示。結(jié)合圖3可知，溶劑用量對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應除10 mL與15 mL無顯著性差異，不存在基質(zhì)效應。其余均存在基質(zhì)效應。因此溶劑用量是影響奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的主要因素之一。由圖3可得，溶劑用量為5，10和15 mL對奶粉中三聚氰胺的基質(zhì)效應，分別為22.1%～32.2%，16.5%～25.5%和12.0%～21.5%。

2.4 不同濃度三聚氰胺對基質(zhì)效應的影響

分別取各種奶粉樣品3份1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的3份樣品分別編號為①②③。按照1.3處理后制備成空白溶液，分別取10，50和100 μL三聚氰胺標準中間溶液，用①②③號各空白容易定容至1 mL，搖勻。通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將各奶粉峰面積A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同三聚氰胺濃度對基質(zhì)效應是否有顯著性影響，結(jié)果見表4和圖4。

圖4 不同濃度三聚氰胺對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表4 不同濃度三聚氰胺對基質(zhì)效應的影響

奶粉中不同濃度三聚氰胺對基質(zhì)效應影響的統(tǒng)計分析結(jié)果如表4所示。由表4可知，不同濃度三聚氰胺對基質(zhì)效應的影響不存在顯著性差異，不存在基質(zhì)效應。

2.5 凈化方式對基質(zhì)效應的影響

分別取各種奶粉4份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每種奶粉的4份樣品分別編號為a、b、c和d。按照1.3提取后，編號a的待凈化液不過柱；編號b的待凈化液過WCX固相萃取柱；編號c的待凈化液過Cleanert PCX固相萃取柱；編號d的待凈化液移過Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱。以上溶液分別通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將A和B代入式（1）及SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質(zhì)效應是否有顯著性影響，結(jié)果見表5和圖5。

圖5 凈化方式對不同奶粉三聚氰胺ME的影響

表5 凈化方式對基質(zhì)效應的影響

凈化方式對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的統(tǒng)計分析結(jié)果如表5所示。由圖5進一步可知，凈化類型不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對全脂奶粉中三聚氰胺的基質(zhì)效應，分別為12.5%～21.2%，15.6%～24.9%，15.1%～26.0%和17.3%～27.0%。

2.6 基質(zhì)效應的消除

標準曲線的制備：分別移取不同體積的三聚氰胺中間液及相同體積的三聚氰胺內(nèi)標工作液至6個25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度依次為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺內(nèi)標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標，三聚氰胺峰面積/內(nèi)表峰面積為縱坐標得標準曲線回歸方程，見表6。

表6 三聚氰胺標準曲線

稱取9份空白樣品至9支50 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標中間溶液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺標準中間溶液，按照1.3提取后做三水平三平行回收試驗，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內(nèi)標峰面積，計算加標回收率。

由表7可知，奶粉回收率在101%～106%之間。數(shù)據(jù)表明，奶粉回收率較好，內(nèi)標法徹底消除因基質(zhì)效應而導致的檢測數(shù)據(jù)不準確，因此內(nèi)標法能徹底消除三聚氰胺基質(zhì)效應帶來影響。

表7 奶粉加標回收率（n=3）

3 結(jié)論

試驗借助單因素方差分析探討取樣量、溶劑種類、溶劑用量、不同濃度三聚氰胺、凈化方式等因素對奶粉中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響。試驗結(jié)果表明除了不同濃度三聚氰胺，其余因素均存在明顯的基質(zhì)效應。為消除基質(zhì)效應帶來的檢測偏差，試驗研究內(nèi)標法對基質(zhì)效應的消除，取得明顯效果，得到可靠的試驗結(jié)果。