超聲輔助提取玄米茶多酚工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究

馬艷，姜亦超，董格格，劉新宇，費鵬*，陳夢

1. 南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院（南陽 473000）；2. 佳木斯市向陽區(qū)市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法大隊（佳木斯 154002）

玄米茶是以大米為基礎，經浸泡、蒸熟、加入茶葉滾炒等步驟制作而成的產品，既有淡淡的綠茶香味，又有烘炒大米的香氣[1]。玄米茶含有豐富的蛋白質，還含有人體所需的維生素、礦物質等多種微量元素，因此深受消費者的喜愛[2]。同時，玄米茶具有多種生理功能，包括緩解壓力、降低血糖、減肥、緩解便秘、暖胃健脾，對改善人體的消化系統(tǒng)有很大幫助，同時研究表明玄米茶的上述生理功能與玄米茶中所含的多酚物質密切相關[3]。多酚物質能夠有效清除人體自由基、延緩衰老，是天然的抗氧化劑[4]，對其進行提取可以更好地發(fā)揮玄米茶的功效。傳統(tǒng)提取多酚的方法有機械攪拌固液萃取與索氏萃取[5-6]，但這2種方法萃取時間過長，提取物質可能在萃取中發(fā)生化學反應，而超聲波輔助萃取和微波輔助萃取可以避開這些缺點，提取多酚更高效且雜質少[7-9]。

試驗以玄米茶為原料，采用單因素試驗和響應面法優(yōu)化玄米茶多酚提取工藝，并對其抗氧化性進行研究。選擇乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲功率4個處理參數作為變量進行試驗，在單因素試驗基礎上，采用響應面法確定超聲輔助乙醇提取法提取多酚的最優(yōu)提取工藝。利用Fenton反應法、鄰苯三酚自氧化法及DPPH比色法分析法測定玄米茶多酚對羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-）和DPPH自由基的清除能力，從而揭示玄米茶多酚的抗氧化活性，以期為玄米茶多酚的高效提取和深度開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玄米茶（陌上花開茶葉有限公司）；沒食子酸標準品（天津市大茂化學廠）；福林酚、無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、L-抗壞血酸、鹽酸（分析純，天津市大茂化學廠）；無水乙醇（分析純，赤峰瀚森化工有限公司）；過氧化氫（分析純，上海恤世科學技術有限公司）；鄰苯三酚（分析純，上海藍季科技發(fā)展有限公司）；DPPH（北京謹明生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

XL30C型多功能粉碎機（山東福鑫機械有限公司）；KQ-50DA型數控超聲波清洗器（北京海天友誠科技有限公司）；SHZ-95B循環(huán)水式真空泵（山東科博儀器有限公司）；PHS-3C型PH計（上海本昂科學儀器有限公司）；SHZ-B型恒溫水浴鍋（青島明博環(huán)保科技有限公司）；TDL-80-2B型多管架自動平衡離心機（上海安亭有限公司）；723PC型紫外可見分光光度計（青島明博環(huán)?？萍加邢薰荆?。

1.3 試驗方法

1.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制

配制質量濃度為0，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的沒食子酸溶液，并加入0.25 mL福林酚試劑，振蕩均勻后靜置3 min。向上述樣品中加入2 mL 15%Na2CO3溶液，避光靜置30 min。以蒸餾水作為空白對照，在波長760 nm處測定樣品的吸光度，試驗平行測定3次，取平均值。以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線[10]，最終的線性回歸方程為y=14.189x+0.005 3（R2=0.993 1）。

1.3.2 玄米茶多酚的提取

使用多功能粉碎機將玄米茶粉碎，取0.5 mg玄米茶粉末，按照不同的乙醇體積分數、料液比、超聲時間和超聲功率處理后，吸取1 mL浸提液并加入0.25 mL福林酚試劑，振蕩均勻，放置3 min。向樣品中加入2 mL 15% Na2CO3溶液，靜止30 min，按3 500 r/min離心3 min，使用紫外分光光度計在波長760 nm處測定樣品吸光度，玄米茶多酚提取率按式（1）計算[11]。

式中：W為多酚提取率，mg/g；C為多酚質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為玄米茶粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

為探究不同工藝參數處理對玄米茶多酚提取率的影響，試驗選擇工藝參數超聲功率（200，250，300，350和400 W）、超聲處理時間（20，40，60，80和100 min）、乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%，80%）和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）為變量進行單因素試驗。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上進行響應面分析。選擇超聲功率、超聲時間、乙醇體積分數、料液比為試驗因素，每個因素選擇3個水平，進行Box-Behnken中心組合試驗。通過響應面法分析的結果找到最優(yōu)的處理參數。因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素與水平表

1.3.5 體外抗氧化活性試驗設計

以VC為對照，分別配制0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的最優(yōu)提取條件下的玄米茶多酚提取液和VC溶液，采用Fenton反應法[12]、鄰苯三酚自氧化法[13]和DPPH-比色法[14]測定其對·OH、O2-和DPPH的清除率，從而評價玄米茶多酚的抗氧化活性。

1.4 數據分析

每組數據均重復3次取平均值，響應面試驗設計及分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，抗氧化數據采用Office 2019進行處理，P＜0.05時被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對玄米茶多酚提取率的影響

料液比對玄米茶多酚提取率的影響見圖1。結果顯示隨著液體占比的增加，玄米茶多酚提取率先增加后減少，料液比1∶30 g/mL時，玄米茶多酚提取率達到最大值，為16.5 mg/g。提取溶劑比例增加有助于玄米多酚的溶解和提取，然而比例過大時會導致其他雜質溶解，反而會阻礙多酚的溶出，導致提取率下降[15]。因此，最佳料液比為1∶30 g/mL。

圖1 料液比對玄米茶多酚提取率的影響

2.1.2 超聲處理時間對玄米茶多酚提取率的影響

超聲處理時間對玄米茶多酚提取率的影響見圖2。超聲處理時間80 min處，玄米茶多酚提取率最大，為13.8 mg/g。但隨著提取時間的增加，茶多酚含量逐漸減少，其原因可能是超聲波熱效應會導致玄米茶中一些不穩(wěn)定的多酚轉化成其他物質[16]，最終使得玄米茶多酚提取率變小。因此，選擇超聲處理時間80 min最合適。

圖2 超聲處理時間對玄米茶多酚提取率的影響

2.1.3 超聲功率對玄米茶多酚提取率的影響

超聲功率對玄米茶多酚提取率的影響見圖3。超聲波功率350 W時，玄米茶多酚提取率最大，為9.78 mg/g；超聲功率繼續(xù)增大，多酚的提取率減少。研究表明，發(fā)生此現象的原因可能是在超過一定范圍后，過大的超聲功率會破壞多酚結構，最終導致多酚提取率的降低[17]。因此，超聲功率350 W為最佳。

圖3 超聲功率對玄米茶多酚提取率的影響

2.1.4 乙醇體積分數對玄米茶中多酚提取率的影響

多酚類物質會通過化學鍵與一些大分子物質形成復合物，如果乙醇體積分數過低而水分高時，對化學鍵的破壞作用過小，便會不易溶出多酚類物質；乙醇體積分數升高時，脂類、色素等雜質就會被溶解，與多酚物質一樣和乙醇水分子進行結合，會降低多酚活性物質的溶解度，進而會影響多酚物質的提取率[18]。乙醇體積分數對玄米茶中多酚提取率的影響見圖4。玄米茶中多酚提取率隨著乙醇體積分數的增加先增加后下降，乙醇體積分數達到70%時，玄米茶中的多酚提取率達到最大值，為8.09 mg/g。

圖4 乙醇體積分數對玄米茶多酚提取率的影響

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

在單因素試驗基礎上，以玄米茶多酚提取率為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行分析[18]。響應面設計和結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計及響應結果

表3 方差分析

從表3可以看出：回歸模型P＜0.000 1，極其顯著；失擬項無顯著性差異（P=0.715 4＞0.05）。另外，R2=0.989 1，Radj2=0.978 2，C.V.=2.80%被確定為該模型的參數，表明回歸模型擬合良好[19-20]，檢驗誤差小。根據回歸系數，得到玄米茶多酚提取率的二次多元回歸方程：Y=33.53+1.99A+0.25B+0.59C+4.63D-0.50AB-0.12AC-0.85AD-2.50×10-3BC-0.087BD+5.0×10-3CD-4.13A2-4.53B2-4.44C2-5.30D2。

由表3中方差分析結果可以看出，超聲輔助乙醇提取玄米茶多酚的各種工藝參數中，對多酚提取率的影響順序為乙醇體積分數（D）＞A（料液比）＞超聲功率（C）＞超聲時間（B），其中A（料液比）和D（乙醇體積分數）對多酚提取的影響達到極顯著的水平，C（超聲功率）對多酚提取的影響也達到了顯著的水平。綜合考察AB、AC、AD、BC、BD、CD交互項對玄米茶多酚提取率的影響，得出其中AD達到顯著水平。

2.2.2 兩因素交互作用響應面分析

根據回歸方程繪制三維響應面圖。通過觀察響應面的變化和稀疏性，揭示各種因素之間的相互作用對玄米茶多酚提取率的影響，三維響應面圖的結果如圖5所示。

圖5 兩因素交互作用對多酚提取率的響應面圖

圖5（c）的坡度較陡峭、等高線較密集，響應面斜率越大，輪廓線越密集，形狀呈扁平圓形或馬鞍形，說明2個因素之間的相互作用對多酚的提取影響越大，則可以表明料液比（A）和乙醇體積分數（D）的2個交互項對玄米茶多酚提取率的影響作用明顯，與表3分析結果一致。

2.2.3 最佳條件的確定和模型的驗證

通過對比響應面圖的結果，并運用Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式試驗模型進行優(yōu)化，確定超聲輔助提取玄米茶多酚的最佳工藝參數：超聲功率353.19 W、超聲時間80.24 min、料液比1∶31.96 g/mL、乙醇體積分數74.21%，并預測多酚提取率，結果為34.723 1 mg/g?？紤]到試驗設備的實際情況和可操作性，最佳工藝參數為超聲功率350 W、超聲時間80 min、料液比1∶32 g/mL、乙醇體積分數74%。在此條件下，3次試驗的提取率平均值為34.76 mg/g，與預測值接近，說明該模型可靠。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 玄米茶多酚對·OH的清除能力

玄米茶多酚對·OH的清除能力如圖6所示。隨著玄米茶多酚質量濃度的增加，其對·OH的清除率也不斷提高，玄米茶多酚質量濃度0.5 mg/mL時，對·OH的清除率達82.01%。雖然玄米茶多酚對·OH的清除率略低于同濃度下VC清除率，但VC屬于強抗氧化劑，因此玄米茶多酚對·OH的清除率仍較高。此外，邢敏等[19]利用超聲輔助法提取杜仲雄花多酚時發(fā)現，0.5 mg/mL的提取物對·OH的清除率為72.01%，低于試驗中玄米茶多酚的·OH清除率。

圖6 玄米茶多酚·OH清除率的影響

2.3.2 玄米茶多酚對O2

-的清除能力

玄米茶多酚對O2-的清除能力如圖7所示。玄米茶多酚濃度與對O2-的清除能力呈現一定線性關系，玄米茶多酚濃度0.5 mg/mL時，清除率最高，達到82.57%。略低于VC的清除活性。研究發(fā)現0.5 mg/mL的胎菊多酚、大麥多酚和杜仲胸花多酚對O2-的清除分別為23.08%，19.31%和32.33%，均低于玄米茶多酚對O2-的清除能力[19-21]。

圖7 玄米茶多酚對O2-清除率的影響

2.3.3 DPPH自由基清除作用

玄米茶多酚對DPPH自由基的清除能力如圖8所示。玄米茶多酚對DPPH自由基的清除能力隨著玄米茶多酚質量濃度的增加而提高，玄米茶多酚質量濃度0.5 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達95.33%，與強抗氧化劑VC對DPPH自由基的清除率相比沒有顯著性差異（P＞0.05），可見玄米茶多酚對DPPH自由基具有強的清除能力。

圖8 玄米茶多酚和VC對DPPH自由基清除率的影響

3 結論

利用超聲輔助法提取玄米茶多酚，對其提取工藝進行優(yōu)化，并對提取物的抗氧化活性進行評估。響應面分析方法對玄米茶多酚超聲提取工藝參數進行優(yōu)化，并得出最佳工藝參數：超聲功率350 W、超聲時間80 min、料液比1∶32 g/mL、乙醇體積分數74%。在此工藝條件下，玄米茶多酚提取率為34.76 mg/g。探索玄米茶多酚的體外抗氧化活性，結果表明，玄米茶多酚濃度0.5 mg/mL時，其對·OH、O2-和DPPH自由基的清除率分別為82.01%，82.57%和95.33%，說明玄米茶多酚具有良好的體外抗氧化活性。試驗結果為玄米茶多酚的提取工藝優(yōu)化提供數據支持，為將玄米茶多酚開發(fā)成具有抗氧化活性的功能食品或天然抗氧化劑提供理論依據。