凡納濱對(duì)蝦抗菌肽的篩選及與DNA 的結(jié)合機(jī)制

王銘遙，鄭明靜，2，3，任中陽，2，3，石林凡，2，3，鄧尚貴，楊 燊，2，3*

（1 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361021 3 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034 4 浙江興業(yè)集團(tuán) 浙江舟山 316014）

食源性疾病是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，每年約有420 萬人因食物中毒而死亡[1]。雖然我國食源性疾病的發(fā)生率整體呈下降趨勢，但是部分地區(qū)形勢仍然不容樂觀，特別是由細(xì)菌引起的食物中毒事件頻頻發(fā)生[2]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是變形菌門的一種游動(dòng)的、非孢子形成的、桿狀革蘭氏陰性菌，有嗜鹽和嗜溫的特性，它作為海洋食品主要的食源性致病菌，引起的食物中毒事件占水產(chǎn)食物中毒的60%以上[3-4]。該菌通過侵入宿主細(xì)胞（腸上皮細(xì)胞），在體內(nèi)釋放大量毒力因子，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，進(jìn)而引起腸胃炎等疾病[5-6]。

抗菌肽（AMPs）也被稱為宿主防御肽，廣泛存在于自然界的各種生物體內(nèi)，是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[7]。抗菌肽因快速、廣譜的抑菌活性和獨(dú)特的抑菌機(jī)制而被認(rèn)為是化學(xué)防腐劑潛在的替代品[8-9]。例如，抗菌肽mBjAMP1 可在短時(shí)間內(nèi)殺滅革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌，展現(xiàn)出較強(qiáng)的廣譜抑菌活性[10]。凡納濱對(duì)蝦又稱南美白對(duì)蝦，是對(duì)蝦科的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)蝦種，2020 年我國對(duì)蝦的年總產(chǎn)量高達(dá)近120 萬t[11]。副溶血性弧菌作為凡納濱對(duì)蝦的主要感染細(xì)菌，嚴(yán)重威脅著對(duì)蝦及其加工制品的食用安全。有研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦感染副溶血性弧菌后，其血清中能產(chǎn)生一定數(shù)量的抗菌片段來應(yīng)對(duì)感染[12]。如凡納濱對(duì)蝦抗菌肽LvALF8LBD對(duì)大腸桿菌、哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等展現(xiàn)出良好的廣譜抑菌活性[13]。雖然人們在海洋無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了許多抗菌肽，但是發(fā)現(xiàn)數(shù)量遠(yuǎn)不及陸地動(dòng)物，其原因是海洋無脊椎動(dòng)物中抗菌肽的質(zhì)量濃度通常小于1 mg/kg，且提取工藝復(fù)雜，很難從海洋無脊椎動(dòng)物中獲得足夠數(shù)量的抗菌肽，用于結(jié)構(gòu)鑒定及抗菌活性測定[14-16]。相比傳統(tǒng)的抗菌肽提取方法，生物信息學(xué)技術(shù)可以提供快速、準(zhǔn)確的抗菌肽篩選、識(shí)別方法[17-18]?；诖耍狙芯客ㄟ^超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)分子質(zhì)量為1 500～3 000 u 的多肽片段，再利用生物信息學(xué)對(duì)具有潛在抑菌活性的多肽片段進(jìn)行評(píng)估和篩選，并合成已確定的抗菌肽對(duì)象，探索抗菌肽對(duì)副溶血性弧菌的抑菌活性及與DNA 的結(jié)合機(jī)制，為抗菌肽在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌（副溶血性弧菌ATCC 17802 和金黃色葡萄球菌ATCC 29213）由廣東省汕頭大學(xué)海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，并于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；抗菌肽由北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度99%以上；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Gene Green 核酸染料，TIANGEN 公司；營養(yǎng)肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂糖，北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；所有試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

GelDoc XR 電泳成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 伯樂公司；Nano Acquity UPLC system、Thermo Scientific Q-Exactive，美國Waters 公司；Chirascan V100 圓二色譜儀，英國Applied Photophysics Ltd公司。

1.3 抗菌肽的質(zhì)譜分析

將凡納濱對(duì)蝦洗凈后加入100 mL PBS 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.2）中絞碎，取1 mL 絞碎后的懸濁液離心（15 min，10 000 r/min）取上層清液，再利用超濾膜截留分子質(zhì)量為1 500～3 000 u 的多肽，所得樣品于-20 ℃保存。利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行鑒定分析，液相色譜的流動(dòng)相分別是含0.1%甲醇的超純水溶液和乙腈，進(jìn)樣體積為5 μL，梯度洗脫條件如表1 所示。質(zhì)譜的一級(jí)掃描分辨率為70 000，掃描范圍是350～1 600m/z；二級(jí)掃描分辨率為17 500，動(dòng)態(tài)消除10.0 s。最后使用搜庫軟件MAXQUANT v1.6.5.0 和數(shù)據(jù)庫Uniprot 白腳蝦蛋白庫Penaeus vannamei（Whiteleg shrimp）進(jìn)行蛋白序列比對(duì)[19]。

1.4 生物信息學(xué)篩選及合成

分別使用在線軟件APD3（https：//aps.unmc.edu/AP/）和CAMP（http：//www.camp.bicnirrh.res.in/）計(jì)算多肽的電荷數(shù)和疏水率，并評(píng)估其抗菌肽的可靠性[20]。多肽采用固相合成法合成，首先將9-芴基甲氧羰基氨基酸（甲氨基甲酸）和2，6-二氯苯甲酰氯（DCB）添加到樹脂中以附著第1 個(gè)氨基酸，再向其中加入哌啶脫去保護(hù)基，不斷攪拌將活化的氨基酸連接到樹脂上以偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸殘基，如此往復(fù)循環(huán)，直至目標(biāo)肽段全部合成，最后用TFA 將目標(biāo)肽段從樹脂上切下得到較低純度的多肽。利用高效液相色譜法（HPLC）純化目標(biāo)肽段，使其純度≥99%，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定純化合成多肽的分子質(zhì)量[21]。

1.5 PV13 抑菌活性分析

1.5.1 最低抑菌濃度（MIC）取200 μL 副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌分別加于20 mL 營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)13 h 至細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期，再用0.01 mol/L，pH 7.2 的磷酸鹽緩沖溶液稀釋細(xì)菌濃度至106～107CFU/mL。取1 mg 抗菌肽于離心管中，加入1 mL 的磷酸鹽緩沖液使其溶解。將稀釋過的細(xì)菌和抗菌肽等比例混合，使抗菌肽最終質(zhì)量濃度分別為31.3，62.5，125，250，500 μg/mL，并于37 ℃條件下靜置孵育2 h。充分反應(yīng)后取20 μL 樣品涂布，并于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h 后，開始計(jì)算菌落總數(shù)，以0.01 mol/L，pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液代替抗菌肽做空白對(duì)照[22]。

1.5.2 時(shí)間殺傷曲線 取200 μL 副溶血性弧菌于20 mL 營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)13 h 至細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期，用0.01 mol/L，pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液稀釋細(xì)菌濃度至106～107CFU/mL。將1×MIC 的抗菌肽與106～107CFU/mL 的副溶血性弧菌等比例混合，以磷酸鹽緩沖液代替抗菌肽做空白對(duì)照，混勻后的樣品置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育，而后分別在0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h處，取20 μL 樣品加樣并涂布，37 ℃培養(yǎng)20 h 后開始菌落計(jì)數(shù)[23]。

1.6 PV13 抑菌機(jī)制分析

1.6.1 內(nèi)膜通透性測定 通過測量副溶血性弧菌細(xì)胞質(zhì)中β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的鄰硝基酚含量來確定抗菌肽的內(nèi)膜通透性。首先將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌置于離心機(jī)中離心（8 000 r/min，10 min），使最終菌體沉淀質(zhì)量大于0.1 g，接著將菌體沉淀重懸于以乳糖作為唯一碳源的M9 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600＞0.4。將100 μL 不同濃度抗菌肽（1/2×MIC和2×MIC）、100 μL 菌懸液與10 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的2-硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷（O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside，ONPG）溶液吸取到96 孔板中混勻，立即測定其在波長420 nm 處的吸光值，完成測定后將細(xì)胞懸浮液在37℃振蕩培養(yǎng)，每1 h 記錄一次數(shù)據(jù)，以0.01 mol/L，pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液做空白對(duì)照[24]。

1.6.2 透射電子顯微鏡觀察 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的副溶血性弧菌和抗菌肽PV13 分別用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至106～107CFU/mL 和2×MIC，再按照5∶1 的體積比將二者混合后，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液代替抗菌肽做空白對(duì)照。將充分反應(yīng)的樣品離心（8 000 r/min，10 min），棄上清液取下層沉淀，采用相同的PBS 緩沖液洗滌2 次，體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛和1%鋨酸溶液進(jìn)行雙重固定。之后使用乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，并在70 ℃條件下加熱過夜包埋。最后使用LEICA EM UC7 型超薄切片機(jī)得到70～90 nm的切片，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min，晾干后即可用透射電子顯微鏡觀察[25]。

1.6.3 圓二色譜 取抗菌肽于離心管中，分別加入磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）和25 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解，使抗菌肽最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，再吸取200 μL 溶解后的抗菌肽置于1 mm 石英比色皿中，在波長為180～260 nm 條件下2 次掃描光譜，掃描速度為130 nm/min，數(shù)據(jù)以1 nm 為間隔記錄，平均掃描時(shí)間為5 s[26]。之后用磷酸鹽緩沖液溶解后的抗菌肽與副溶血性弧菌基因組DNA 混合，使其質(zhì)量比為37∶1，并于37 ℃條件下靜置孵育2 h。接著稀釋樣品最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，以SDS 緩沖液稀釋的抗菌肽為對(duì)照，在圓二色譜儀下掃描，掃描條件如上所述。利用CD-Tool 軟件處理掃描數(shù)據(jù)，分析抗菌肽結(jié)構(gòu)以及與其副溶血性弧菌基因組DNA的結(jié)合效果。

1.6.4 DNA 凝膠阻滯 根據(jù)DNA 提取試劑盒方法提取副溶血性弧菌基因組DNA，通過在波長260 nm 和280 nm 處的光度密度比（OD260nm/OD280nm≥1.90）來測定基因組DNA 的純度。取1 mg 抗菌肽于離心管中，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液溶解，并按照抗菌肽與基因組DNA 質(zhì)量比為100∶1，50∶1，25∶1，25∶2，25∶4，25∶8 將二者混合，37 ℃條件下孵育2 h。而后加入上樣緩沖液，用微量移液器吸取8 μL 加到0.8%瓊脂糖凝膠樣品槽中進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)在紫外線照射下觀察DNA遷移結(jié)果[27]。

1.7 抗菌肽三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)由在線軟件I-TASSER（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/）預(yù)測，并在PyMol 2.3 程序中進(jìn)行編輯和修改，最終得到抗菌肽結(jié)構(gòu)[28]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每次試驗(yàn)獨(dú)立平行重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，利用軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果顯著性，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對(duì)蝦中抗菌肽的鑒定與篩選

采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從凡納濱對(duì)蝦中鑒定出13 個(gè)肽段序列（表2），多肽序列平均為20 個(gè)氨基酸序列長度，分子質(zhì)量從1 500～2 500 u。使用在線軟件APD3 對(duì)肽段序列的電荷數(shù)和疏水率進(jìn)行計(jì)算，其凈電荷數(shù)從-4～＋3，疏水率范圍從18%～60%，在線軟件CAMP 測得13 個(gè)肽段的抗菌肽可靠性范圍從0～0.873。

表2 凡納濱對(duì)蝦中小分子多肽片段的分析篩選Table 2 Analysis and screening of small molecular peptide sequence from Penaeus vannamei

一般來說，抗菌肽的抑菌活性與肽鏈的長度、凈電荷數(shù)和疏水性等因素有關(guān)[29]。有研究表明，抗菌肽的長度對(duì)于維持構(gòu)象十分重要，通常較長的肽鏈更有利于形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然而往往許多較短的多肽抑菌活性更強(qiáng)，這些抗菌肽大多由20～30 個(gè)氨基酸序列組成，分子質(zhì)量在2 000～3 000 u 范圍內(nèi)[30-31]。同時(shí)，凈電荷數(shù)也是影響抗菌肽抑菌活性的關(guān)鍵因素之一，陽離子抗菌肽通過和呈負(fù)電性的細(xì)胞膜之間產(chǎn)生靜電吸引作用來發(fā)揮抑菌活性，大多電荷數(shù)在＋2～＋9 之內(nèi)的抗菌肽具有更強(qiáng)的殺菌效果[32-33]。此外，疏水性對(duì)抑菌活性的調(diào)控也同樣重要，在30%～60%范圍內(nèi)，疏水率與抗菌活性成明顯的正相關(guān)。然而疏水率較小的抗菌肽，其與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的相互作用較弱，滲透性效應(yīng)減小，而高疏水性的抗菌肽可能導(dǎo)致細(xì)胞溶血[34-36]。因此，只有當(dāng)抗菌肽的序列長度、電荷數(shù)和疏水性等因素達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)時(shí)，才會(huì)發(fā)揮最大的抑菌活性[37]。經(jīng)篩選多肽序列ALPWVLPWALPRALPRVLPR（命名為PV13），其分子質(zhì)量為2 320 u，疏水率為60%，帶3 個(gè)凈正電荷是滿足以上條件的唯一肽段序列，抗菌肽可靠性評(píng)估為0.873（圖1），接下來對(duì)其抑菌活性做進(jìn)一步探究。

圖1 抗菌肽PV13 質(zhì)譜分析圖Fig.1 Mass spectrometry analysis of antimicrobial peptide PV13

2.2 抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌的抑菌活性分析

為探究多肽PV13 的抑菌活性，對(duì)副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度進(jìn)行測定。多肽PV13 對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎無抑菌活性（圖2），然而對(duì)副溶血性弧菌有較強(qiáng)的抑菌效果。當(dāng)PV13 質(zhì)量濃度為125 μg/mL 時(shí)，副溶血性弧菌總數(shù)減少了約92%；當(dāng)PV13 質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL 時(shí)，副溶血性弧菌減總數(shù)少了約81%；當(dāng)PV13 質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL 時(shí)，副溶血性弧菌總數(shù)減少了約60%，即隨著PV13 濃度減小，細(xì)菌總數(shù)隨之增多（圖3），由此可以判斷PV13 對(duì)副溶血性弧菌的最低抑菌濃度為62.5 μg/mL。

圖2 抗菌肽PV13 對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度Fig.2 Minimum inhibitory concentration（MIC）of antimicrobial peptide PV13 against Staphylococcus aureus

抗菌肽PV13 對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果遠(yuǎn)優(yōu)于革蘭氏陽性菌，這可能是由于細(xì)胞外的獨(dú)特成分導(dǎo)致，革蘭氏陽性細(xì)菌表面較厚的肽聚糖層使得抗菌肽很難穿透細(xì)胞壁[38]。而革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜表面特有的成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）為抗菌肽的結(jié)合提供了更大的可能性，Shang 等[39-40]證明了抗菌肽可以通過直接結(jié)合脂多糖或穿過脂多糖層靶向細(xì)胞內(nèi)功能成分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性菌抑制作用。

從圖4 可知PV13 對(duì)副溶血性弧菌的生長有明顯的抑制效果。沒加入抗菌肽之前，細(xì)菌的時(shí)間殺傷曲線較為平緩，僅在1 h 后有較少的衰亡，加入抗菌肽PV13 后，曲線呈明顯的下降趨勢，1 h后細(xì)菌總數(shù)減少了51.7%，2 h 后細(xì)菌全部死亡。結(jié)果表明，抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌具有很高的殺菌效率。與本課題組前期發(fā)現(xiàn)的泥蚶血紅蛋白抗菌肽TGH1 相比，TGH1 在5 h 后才殺死99.1%的副溶血性弧菌，因此PV13 對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效率更高[28]。

圖4 抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌的時(shí)間殺傷曲線Fig.4 Time-kill curve of antimicrobial peptide PV13 against V.parahaemolyticus

2.3 抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌的抑菌機(jī)制分析

2.3.1 抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌內(nèi)膜通透性的影響 β-半乳糖苷酶是一種膜內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膜產(chǎn)生通透性后，磷脂雙分子層間的孔洞擴(kuò)張，β-半乳糖苷酶泄漏到細(xì)胞外，將無色的ONPG 降解產(chǎn)生黃色的鄰硝基苯酚和半乳糖，因此本研究通過添加ONPG 來評(píng)估抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌內(nèi)膜通透性的影響[41]。由圖5 可知，細(xì)菌吸光度值整體呈上升的趨勢，并且隨著抗菌肽PV13 濃度的增加，細(xì)菌的吸光度也隨之增大，這表明PV13 可對(duì)副溶血性弧菌的細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生影響，膜的通透性與PV13 質(zhì)量濃度成正比。細(xì)胞膜是細(xì)胞阻礙外界干擾的第一道屏障，因此大多數(shù)已知的抗菌肽直接作用于細(xì)胞膜，如抗菌多肽Hp1404 就是通過靶向鮑曼不動(dòng)桿菌的細(xì)胞膜，使膜的完整性喪失從而發(fā)揮其抗菌活性[42]。然而靶向細(xì)胞膜不是抗菌肽唯一的作用機(jī)制，抗菌肽NP-6 通過破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，抑制了β-半乳糖苷酶的活性，并與其DNA/RNA 結(jié)合[43]；BO18 也通過穿透溶藻弧菌細(xì)胞膜，結(jié)合細(xì)菌基因組DNA和總RNA 發(fā)揮抑菌活性[44]。然而，抗菌肽PV13 是否也可以靶向胞內(nèi)成分尚不清楚。

圖5 抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌的內(nèi)膜通透性Fig.5 Inner membrane permeability of V.parahaemolyticus treat with antimicrobial peptide PV13

2.3.2 副溶血性弧菌超微結(jié)構(gòu)變化 為進(jìn)一步探究抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌細(xì)的作用機(jī)制，通過透射電子顯微鏡觀察菌體的微觀結(jié)構(gòu)變化。如圖6 所示，未經(jīng)處理的正常細(xì)菌表面完整光滑，組織分布均勻，無內(nèi)容物流出（圖6a）。而經(jīng)抗菌肽PV13 處理后，副溶血性弧菌表面變的模糊，細(xì)胞膜部分區(qū)域變薄，細(xì)胞開始萎縮和變形（圖6b），證實(shí)抗菌肽PV13 可以對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜造成損傷，迫使細(xì)胞膜通透性增加，從而加快了細(xì)胞內(nèi)容物的流出和抗菌肽的進(jìn)入。

圖6 副溶血性弧菌的透射電鏡圖像Fig.6 Transmission electron microscopy images of V.parahaemolyticus

由于陽離子型抗菌肽與陰離子型磷脂之間有較高的親和力，所以當(dāng)抗菌肽平行或插入細(xì)胞膜后會(huì)導(dǎo)致磷脂雙分子層中形成一定的 “自由空間”，從而容納更多的抗菌肽。這種現(xiàn)象將直接使細(xì)胞膜變薄，膜流動(dòng)性增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)成分重排，邊界產(chǎn)生缺陷[45]?？咕腜7 也是采用類似的抑菌機(jī)制殺滅沙門氏菌，即通過改變沙門氏菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使抗菌肽進(jìn)入胞內(nèi)并在細(xì)胞質(zhì)中積累，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起細(xì)胞膜通透性增加和變形[46]。而抗菌肽PV13 對(duì)副溶血性弧菌的細(xì)胞膜并未產(chǎn)生劇烈的破壞作用，結(jié)合時(shí)間殺傷曲線和細(xì)胞膜通透性結(jié)果來看，其可能存在胞內(nèi)作用機(jī)制，因此，對(duì)其DNA 結(jié)合活性做進(jìn)一步探索。

2.3.3 抗菌肽PV13 與菌體基因組DNA 的相互作用 通過DNA 凝膠阻滯試驗(yàn)來表征抗菌肽PV13 與副溶血性弧菌基因組DNA 之間的相互作用。未處理的細(xì)菌基因組DNA，凝膠電泳圖譜顯示清晰明亮的DNA 條帶，而經(jīng)抗菌肽PV13 處理過的基因組DNA，條帶亮度隨著PV13 質(zhì)量濃度的增大而變暗，說明PV13 可以直接與副溶血性弧菌的基因組DNA 結(jié)合，且結(jié)合程度與PV13 的質(zhì)量濃度成正相關(guān)（圖7），這與Yi 等[47]的研究發(fā)現(xiàn)一致，大腸桿菌O157：H7 基因組DNA 條帶隨著ZP37 濃度的增加而消失。

圖7 凝膠阻滯分析抗菌肽PV13 與DNA 的相互作用Fig.7 Gel retardation analysis of the interaction between antimicrobial peptide PV13 and DNA

抗菌肽與細(xì)菌基因組DNA 的結(jié)合可以抑制或阻礙細(xì)胞基因表達(dá)，阻斷酶和受體正常合成，進(jìn)而使細(xì)胞生命周期所需物質(zhì)供應(yīng)不足，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[48]。本課題組前期從大黃魚乳清酸性蛋白中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽LCWAP 就具有DNA 結(jié)合活性，LCWAP 首先通過聚集在細(xì)胞表面，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏形成空泡化，進(jìn)入細(xì)胞后再與基因組DNA 結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[49]。蘇冠芳等[50]也發(fā)現(xiàn)buforin II 采用類似于“孔”型機(jī)制穿過磷脂雙分子層進(jìn)入金黃色葡萄球菌胞內(nèi)，并以嵌入的方式與DNA 合成相關(guān)基因特異性結(jié)合，從而阻止細(xì)胞分裂達(dá)到抑菌目的。由此可以推斷，抗菌肽除了利用膜損傷機(jī)制殺滅細(xì)菌之外，DNA 結(jié)合活性也是抗菌肽殺滅細(xì)菌的有效途徑。

2.3.4 抗菌肽PV13 的結(jié)構(gòu)分析 基于左旋和右旋圓偏振光吸收的差異，圓二色譜已被廣泛應(yīng)用于研究生物分子的構(gòu)象，特別是用于研究生物分子在各種環(huán)境中的構(gòu)象變化[51]。遠(yuǎn)紫外（175～260 nm）范圍內(nèi)的圓二色性（CD）光譜是研究溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的既定方法，因?yàn)闃?gòu)成所有蛋白質(zhì)和寡肽骨架的肽鍵的構(gòu)象在遠(yuǎn)紫外區(qū)有特定的CD 信號(hào)[52]。本課題組前期研究表明，在不同溶液環(huán)境中，抗菌肽呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，其抑菌活性也各不相同[53]。如圖8 所示，溶于PBS 的抗菌肽PV13在波長199 nm 處有1 個(gè)正峰；在SDS 溶液中，多肽在波長188 nm 處有1 個(gè)較小的正峰，在波長202 nm 和223 nm 處分別有2 個(gè)明顯的負(fù)峰，其峰形發(fā)生明顯變化，而以上2 種峰形都屬于無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)榭咕腜V13 序列上存在多個(gè)脯氨酸，由于脯氨酸的亞氨基缺少1 個(gè)氫原子，分子無法形成氫鍵，C-N 鍵無法旋轉(zhuǎn)，因此脯氨酸的存在會(huì)導(dǎo)致抗菌肽無法形成α-螺旋和β-折疊等特殊結(jié)構(gòu)[54]。

圖8 不同溶液中抗菌肽PV13 的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Secondary structure analysis of antimicrobial peptide PV13 in different solutions

抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)與抑菌活性密切相關(guān)，一般來說具有特殊結(jié)構(gòu)的抗菌肽（α-螺旋、β-折疊）的抑菌活性更強(qiáng)[55]，而并非所有抗菌肽都具有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)于富含脯氨酸的多肽，結(jié)構(gòu)呈楔形狀，當(dāng)多肽插入磷脂雙分子層后，可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抑菌活性[56]。例如，富含脯氨酸的磁蓖麻毒素通過與RNA 結(jié)合，特異性地抑制蛋白質(zhì)翻譯，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受到阻礙并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[57]。以上結(jié)果表明，DNA 結(jié)合活性可能是富含脯氨酸的無規(guī)則卷曲抗菌肽的重要抑菌途徑之一。

此外，抗菌肽PV13 的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由重復(fù)的氨基酸序列串聯(lián)而成，即每隔2 個(gè)氨基酸就會(huì)出現(xiàn)亮氨酸和脯氨酸，形成X（LP）X 的規(guī)律（圖9）。有研究表明，含有2 個(gè)或2 個(gè)以上重復(fù)序列的多肽是產(chǎn)生抑菌活性所必需的條件。Sadler 等[58]把抗菌肽Bac 7 中大量的脯氨酸-精氨酸（PR）重復(fù)區(qū)域切除，無論其電荷或疏水含量如何改變，都無法產(chǎn)生抑菌活性。由此推測，重復(fù)的亮氨酸-脯氨酸（LP）區(qū)域可能是產(chǎn)生抑菌活性的功能區(qū)域，這為抗菌肽的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

圖9 抗菌肽PV13 的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及序列分析Fig.9 Three dimensional structure prediction and sequence analysis of antimicrobial peptide PV13

2.3.5 圓二色譜分析PV13 與菌體基因組DNA 的相互作用 圓二色譜是評(píng)價(jià)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要工具[59]。Satish 等[60]利用圓二色譜法來監(jiān)測抗菌肽GDNF 與糖胺聚糖分子形成復(fù)合物過程中的多肽構(gòu)象變化，Contini 等[61]也采用相同的方法揭示了寡聚體與DNA 具有形成復(fù)合物的能力。由圖10可以看出，加入副溶血性弧菌基因組DNA 后，圓二色譜吸收峰強(qiáng)度發(fā)生變化，而位移并沒有明顯改變，主要還是停留在波長200 nm 附近的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，說明PV13 和副溶血性弧菌基因組DNA 相互作用后，改變了PV13 的構(gòu)象，從而使圓二色譜發(fā)生變化，并且此結(jié)果也與DNA 凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證實(shí)了抗菌肽PV13 可以結(jié)合副溶血性弧菌基因組DNA 來發(fā)揮抑菌活性。

圖10 抗菌肽PV13 與副溶血性弧菌基因組DNA結(jié)合的圓二色譜Fig.10 Circular dichroism of antimicrobial peptide PV13 binding with genomic DNA of V.parahaemolyticus

含有α-螺旋和β-折疊等特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)的抗菌肽更容易與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用[62]。如抗菌肽PaDBS1R6 的螺旋度與其對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的親和力成正比[63]。而無規(guī)則卷曲的抗菌肽由于沒有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此DNA 結(jié)合活性往往是其主要的抑菌作用形式[64]。這與抗菌肽buforin II 酰胺具有某些相似之處，二者都呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)并通過結(jié)合基因組DNA 來展現(xiàn)抑菌活性[65]。因此，PV13 作為一種富含脯氨酸的陽離子抗菌肽，其抑菌機(jī)制可能是通過增加細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)膜通透性，引起細(xì)胞膜部分區(qū)域變薄，再利用亮氨酸-脯氨酸的活性功能域穿透副溶血性弧菌細(xì)胞膜進(jìn)入到胞內(nèi)，結(jié)合基因組DNA 來殺滅細(xì)菌。

3 結(jié)論

本研究從凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)鑒定出13 種分子質(zhì)量介于1 500～3 000 u 的多肽序列，經(jīng)分析篩選得到一種新型抗菌肽PV13?？咕腜V13 對(duì)副溶血性弧菌的最低抑菌濃度為62.5 μg/mL，可在2 h內(nèi)將細(xì)菌全部殺死，具有良好的殺菌效果。抗菌肽PV13 通過增加細(xì)胞膜內(nèi)膜通透性，使得細(xì)胞膜部分區(qū)域變薄，進(jìn)而利用亮氨酸-脯氨酸（LP）活性功能域快速進(jìn)入胞內(nèi)，采用與細(xì)菌基因組DNA 相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)其對(duì)副溶血性弧菌的抑菌活性。本研究為抗菌肽的篩選與設(shè)計(jì)提供了參考，同時(shí)也為抗菌肽PV13 作為食品新型防腐劑的應(yīng)用提供了理論支持。