卷煙主流煙氣有害成分遺傳分析

童治軍　唐石云　徐永明　方敦煌　陳學(xué)軍　馮穎杰　楊宗燦　劉文召　張婷婷　楊金初　肖炳光

摘要：為深入解析卷煙主流煙氣中有害成分的遺傳機(jī)制，以烤煙 Y3和 K326為親本構(gòu)建的重組自交系群體（RIL ）為材料，采用植物數(shù)量性狀的主基因+多基因混合遺傳模型對(duì)該群體連續(xù)3個(gè)世代（F6：7、F7：8和 F8：9）的一氧化碳（CO ）、氫氰酸（HCN）、4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮（NNK ）、氨（NH3）、苯并芘{B[a]P}、苯酚（PHE）、巴豆醛（CRO）和焦油（TAR ）等8個(gè)主流煙氣有害成分性狀進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明：（1）8個(gè)主流煙氣有害成分性狀在連續(xù)3個(gè)世代中均呈單峰或多峰的正態(tài)或偏正態(tài)分布，屬典型的數(shù)量性狀。（2）在連續(xù)3個(gè)世代中，8個(gè)性狀的最優(yōu)遺傳模型均為4對(duì)部分等加性主基因模型，其中， CO 、HCN、NNK、NH3、B[a]P 和 CRO 的最優(yōu)遺傳模型為4MG-EEA ；PHE 和 TAR 的最優(yōu)遺傳模型為4MG-EEEA。（3）上述性狀在連續(xù)3個(gè)世代中均受主基因遺傳模型控制，主基因遺傳率極高（均值為89.01%）且遠(yuǎn)大于環(huán)境（非遺傳）因素影響。綜上，這些性狀主要由遺傳基礎(chǔ)決定的，可為選育煙草低危害良種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：重組自交系群體；主流煙氣有害成分；主基因+多基因；遺傳分析

中圖分類號(hào)： S572.03???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A???????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）03-0016-07

Genetic Analysis of Harmful Components in Main Stream Cigarette Smoke

TONG Zhijun1， TANG Shiyun2， XU Yongming3， FANG Dunhuang1， CHEN Xuejun1， FENG Yingjie3， YANG Zongcan3， LIU Wenzhao3， ZHANG Tingting3， YANG Jinchu3*， XIAO Bingguang1*

（1. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding， National TobaccoGenetic Engineering Research Center， Kunming 650021， China;2. Technology Centre， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.，Kunming 650231， China;3. Technology Center， China Tobacco Henan Industrial Co.， Ltd.， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： In order to analyze the genetic mechanisms of harmful components in mainstream cigarette smoke， the recombinant inbred lines （RIL） crossed by flue-cured tobaccos Y3 and K326 were used in the major gene plus polygene mixed genetic model method analyses for Carbon Monoxide （CO）， Hydrocyanic acid （HCN）， 4-（Methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone （NNK：）， Ammonia （NH3）， Benzo[a]pyrene （B[a]P）， Phenol （PHE）， Crotonaldehyde （CRO） and Tar （TAR） in three consecutive generations （2018F6：7， 2019F7：8 and 2020F8：9）. The main results were as follows：（1） The 8 traits value of RIL populations in three generations all showed normal or partial normal distribution of single or multi peaks， belonging to typical quantitative inheritance.（2） The optimal genetic models for the 8 traits were all controlled by four major genes with partially equally additive （PEA） effects inheritance in three consecutive years. The optimal genetic model of CO， HCN， NNK， NH3， B[a]P and CRO was 4MG-EEA， controlled by four major genes with partially equally additive 1（PEA1） effect mixed inheritance; The optimal genetic model of PHE and TAR was 4MG-EEEA， controlled by four major-genes with partially equally additive 2（PEA2） effect mixed inheritance.（3） These typical harmful components in mainstream cigarette smoke were only controlled by the major gene genetic model in 3 generations， and the heritability of the main genes was higher than 85%（mean 89.01%） and much greater than that of the environmental effect. In conclusion， these traits are mainly determined by genetic basis， which can provide theoretical basis for cultivating low-harm tobacco varieties.

Keywords： recombinant inbred lines （RIL）; harmful components in main stream cigarette smoke; major gene plus polygene; genetic analysis

煙草（Nicotiana tabacum L.）是茄科煙草屬一年生經(jīng)濟(jì)作物，因其能產(chǎn)生一種特有植物堿——煙堿，且該物質(zhì)能使煙民吸食時(shí)獲得極大的滿足感和愉悅感而被廣泛種植。然而，煙草又是一種備受爭(zhēng)議的經(jīng)濟(jì)作物。故此培育低危害優(yōu)質(zhì)煙草品種成為煙草新品種選育的重要方向[1-2]。卷煙主流煙氣中的有害成分是判斷低危害煙草品種選育成敗的核心依據(jù)[3]。研究表明，卷煙煙氣是一種極其復(fù)雜的混合物，是在卷煙抽吸過程中由煙草燃燒、裂解和蒸餾而產(chǎn)生的[3-8]。謝劍平等[3]的研究確定了對(duì)卷煙主流煙氣危害性影響最大的7項(xiàng)有害成分指標(biāo)為一氧化碳（CO）、氫氰酸（HCN）、4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮（NNK）、氨（NH3）、苯并芘（B[a]P）、苯酚（PHE）、巴豆醛（CRO）。此外，鑒于卷煙主流煙氣中焦油（TAR）對(duì)人體健康的極大危害性，行業(yè)內(nèi)將焦油與上述7種有害成分統(tǒng)籌考慮，科學(xué)評(píng)價(jià)卷煙主流煙氣的危害性[6-8]。

近年來，數(shù)量性狀主基因+多基因遺傳分離分析體系[9-14]在許多植物育種研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并初步獲得各類植物育種性狀的遺傳組成，為作物和園藝蔬菜等植物提供了有意義的遺傳信息。但迄今，尚未見到針對(duì)煙草主流煙氣有害成分性狀的遺傳特性研究。本研究以2個(gè)烤煙品種 Y3和 K326為親本構(gòu)建含有271個(gè)重組自交系（RIL）的連續(xù)3個(gè)世代群體（2018F6：7、2019F7：8和2020F8：9）為研究材料，首次采用主基因+多基因混合遺傳模型研究煙草主流煙氣中7種代表性有害成分和焦油釋放量性狀，以期揭示煙草主流煙氣有害成分性狀的遺傳機(jī)制，評(píng)估主基因的遺傳效應(yīng)及其遺傳率，為煙草主流煙氣有害成分釋放量性狀的遺傳分析， QTL 定位及低危害優(yōu)質(zhì)新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以Y3為母本、K326為父本配制雜交組合，2012年在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地的溫室種植親本，雜交獲得 F1代。同年，種植 F1并采用單粒傳法，連續(xù)套袋自交，分別于2018年、2019年和2020年構(gòu)建獲得 F6：7、F7：8和 F8：9重組自交系（RIL），且每代 RIL 群體均含271個(gè)株系。

1.2 田間試驗(yàn)

連續(xù)3個(gè)世代（2018年、2019年和2020年），將雙親和RIL 群體同期播種在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)株系（包括雙親材料）種植一個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植45個(gè)單株，行距1.2 m，株距0.60 m。田間管理按照優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行。

1.3 卷煙主流煙氣有害成分調(diào)查

對(duì)株系內(nèi)各單株掛牌、采烤，烘烤后每個(gè)株系和雙親分別隨機(jī)選30個(gè)和60個(gè)單株的中部葉片（C3F）混合切絲，并進(jìn)行煙支卷制及主流煙氣有害成分釋放量數(shù)據(jù)的測(cè)量。具體方法如下：

（1）卷煙制作：將烤后煙葉樣品用切絲機(jī)切成寬度1.0 mm，長(zhǎng)度15～20 mm 的煙絲，然后用卷煙機(jī)卷制成84 mm 長(zhǎng)的正常卷煙。每個(gè)株系卷制20支煙支，且煙支質(zhì)量控制在（0.90±0.015）g。

（2）吸煙試驗(yàn)：按照 GB/T 19609—2004規(guī)定，將卷煙置于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡48 h，進(jìn)行質(zhì)量和吸阻選擇；在 SM450型直線型吸煙機(jī)上抽吸，抽吸時(shí)間2 s ，抽吸間隔58 s，抽吸容量35 mL，用劍橋?yàn)V片捕集煙氣總粒相物。每份煙樣（株系）每次抽吸6支煙支，重復(fù)3次。

（3）卷煙主流煙氣有害成分釋放量測(cè)定：將主流煙氣的總粒相物溶解于萃取劑中，對(duì)各項(xiàng)煙氣指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定：NH3，離子色譜法（YC/T 377—2010《卷煙主流煙氣中氨的測(cè)定》）；HCN ，連續(xù)流動(dòng)法（YC/T 253—2008《卷煙主流煙氣中氰化氫的測(cè)定》）；苯酚，高效液相色譜法（YC/T 255—2008《卷煙主流煙氣中主要酚類化合物的測(cè)定》）；巴豆醛，高效液相色譜法（YC/T 254—2008《卷煙主流煙氣中主要羰基化合物的測(cè)定》）；B[a]P，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GB/T 21130—2007《卷煙煙氣總粒相物中苯并[“]芘的測(cè)定》）；NNK，氣相色譜-熱能分析聯(lián)用法（GB/T 23228—2008《卷煙主流煙氣總粒相物中煙草特有 N-亞硝胺的測(cè)定》）；CO ，非散射紅外法（GB/T 23356—2009《卷煙煙氣氣相中一氧化碳的測(cè)定》）；焦油，差重法（GB/T 19609—2004《卷煙用常規(guī)分析用吸煙機(jī)測(cè)定總粒相物和焦油》）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳分析 R 軟件包 SEA v2.0 SEA（https：//cran.r-project.org/web/ packages/SEA/）分析 RIL 群體各株系連續(xù)3個(gè)世代的主流煙氣代表性有害成分和焦油釋放量表型值，按照王靖天等[11]的報(bào)道進(jìn)行相關(guān)參數(shù)設(shè)置。

2 結(jié)果

2.1 主流煙氣有害成分表型數(shù)據(jù)分析

由表1可知，在3個(gè)世代和 BLUP（Best Linear Unbiased Prediction ，最佳線性無偏預(yù)測(cè)）中，除 NNK 外，剩余7個(gè)性狀在雙親間呈現(xiàn)顯著或極顯著差異。由斜度和峰度值可知，8個(gè)性狀分布均具有明顯的多峰分布特點(diǎn)，表明其存在效應(yīng)值較大的主基因。其中，2020年的 HCN 呈現(xiàn)出明顯的左偏離正態(tài)分布；2018年 CO 和 TAR 則呈現(xiàn)出顯著的右偏離正態(tài)分布趨勢(shì)；2018年的 CO 、HCN 、TAR ，2019年的 NH3、CRO，2020年的 HCN、NH3、TAR 性狀分布具有明顯連續(xù)多峰分布特點(diǎn)。上述結(jié)果表明，該 RIL 群體的8個(gè)主流煙氣有害成分性狀在3個(gè)世代中呈連續(xù)性分布，具有顯著的數(shù)量性狀遺傳特性。

2.2 遺傳模型的選擇

根據(jù) AIC 值最小原則進(jìn)行模型初選，選取各性狀每年中 AIC 值最小的遺傳模型作為該性狀的候選模型（表2）。結(jié)果表明，主流煙氣中 CO 的4MG-EEA ，4MG-CEA 和4MG-EEEA 模型具有最低 AIC 值，2018、2019和2020年的 AIC 值分別為834.53、958.74和879.72，可作為候選模型。同理， HCN 的3個(gè)候選模型為4MG-CEA 、4MG-EEA 和4MG-EEA ；NNK 的候選模型為4MG-EEEA 、4MG-CEA 和4MG-EEA ；NH3 的候選模型為4MG-EEEA，4MG-EEEA 和4MG-EEA；B[a]P 的3個(gè)候選模型均為4MG-EEA ；PHE 的4MG-EEEA、4MG-EEA 和4MG-EEEA 模型為候選模型； CRO的4MG-EEA、4MG-CEA 和4MG-EEA 模型為候選模型； TAR 的3個(gè)候選模型也均為4MG-EEEA。

2.3 候選模型的適合性檢測(cè)與最優(yōu)遺傳模型估算

表3顯示了各性狀在每個(gè)世代的最適遺傳模型，同時(shí)對(duì)每個(gè)性狀在3個(gè)世代中的候選模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)（包括均勻性檢驗(yàn) U12、U22、U32；Smirnov檢驗(yàn) nW2和 Kolmogorov 檢驗(yàn)Dn），按照王靖天等[11]方法選擇各性狀在連續(xù)3個(gè)世代中的最優(yōu)模型。結(jié)果表明，CO 三個(gè)候選模型在連續(xù)3個(gè)世代共15個(gè)統(tǒng)計(jì)量中達(dá)到顯著水平（p＜0.05）的個(gè)數(shù)均是0，因此， CO 的最優(yōu)遺傳模型為4MG-EEA，受4對(duì)具有部分等加性1的主基因混合遺傳模型控制。與之類似， HCN 、NNK、NH3、B[a]P 和 CRO 的最優(yōu)遺傳模型也為4MG-EEA；PHE 和 TAR 的最優(yōu)遺傳模型則為4MG-EEEA，即，受4對(duì)具有部分等加性2的主基因混合遺傳模型控制。

2.4 遺傳參數(shù)估計(jì)

由8個(gè)主流煙氣有害成分最優(yōu)遺傳模型的一、二階遺傳參數(shù)（表4）可知：控制 CO 的第1對(duì)和第2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da 和db）分別是0.76 和0.47，表現(xiàn)出較高的正向遺傳效應(yīng)。其主基因的遺傳率高達(dá)97.16%，表明控制 CO 的4個(gè)主基因具有明顯的累加正效應(yīng)，結(jié)果表現(xiàn)出主效多基因遺傳，且前2個(gè)主基因起主導(dǎo)作用。此外，因主基因決定了該表型變異的97.16%，環(huán)境因素僅占表型變異的2.84%，表明 CO 性狀主要受遺傳因素控制，非遺傳（環(huán)境）因素對(duì)該性狀的影響可忽略不計(jì)。

控制 HCN 、NNK、NH3、B[a]P 、CRO 與 CO 的最佳遺傳模型相同（4MG-EEA），其各自的第1、2對(duì)主基因加性效應(yīng)值均為正，表現(xiàn)出較高的正向遺傳效應(yīng)；除 HCN 外，其余4個(gè)性狀的第1對(duì)主基因加性效應(yīng)遠(yuǎn)大于第2對(duì)主基因加性效應(yīng)（約為2倍），表明上述性狀的主基因加性效應(yīng)中以第1對(duì)主基因?yàn)橹?。同樣，因僅存主基因，且各性狀的主基因遺傳率分別為98.04%、74.00%、99.01%、80.46%和79.52%，非遺傳（環(huán)境）因素約占1.96%、26.00%、0.99%、19.54%和20.48%，表明控制 HCN、NNK、 NH3、B[a]P 和 CRO 性狀的主基因遺傳因素占主導(dǎo)地位。

控制主流煙氣中 PHE 和 TAR 性狀的最佳遺傳模型相同（4MG-EEEA），均符合4對(duì)具有部分等加性2的主基因混合遺傳模型。其中，控制該2個(gè)性狀的第1、2對(duì)主基因加性效應(yīng)值也均為正值，且起增效遺傳作用；此外，控制上述2個(gè)性狀的第2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（db）遠(yuǎn)大于第1對(duì)主基因加性效應(yīng)值（da），說明主基因的加性效應(yīng)中以第2對(duì)主基因?yàn)橹?。PHE 與 TAR 的主基因遺傳率分別為87.13%和96.77%，表明控制 PHE 和 TAR 性狀的4對(duì)主基因在其遺傳變異種起絕對(duì)支配作用，而非遺傳因素（環(huán)境條件）對(duì)其遺傳變異的影響相對(duì)較小。

3 討論

作物品質(zhì)性狀大部分屬于受微效多基因控制和環(huán)境因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀。前人對(duì)作物復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳研究，主要采用傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法獲得加性方差、顯性方差、表型方差及環(huán)境方差等參數(shù)，進(jìn)而估算和分析其性狀的整體基因效應(yīng)[9]。因上述傳統(tǒng)分析方法獲得的信息量有限，且分析結(jié)果在育種實(shí)踐中存在較大的局限性，蓋鈞鎰等[9-10]提出并建立了主基因+多基因混合遺傳模型是植物數(shù)量性狀遺傳研究的重要方法，已廣泛用于植物數(shù)量性狀遺傳分析中并獲得了較理想的結(jié)果。該方法在煙草中也有報(bào)道，但主要集中在煙草農(nóng)藝性狀[13，15-19]、烘烤特性[20-21]、抗病性[13，22-24]、部分煙葉化學(xué)成分[12，14，25]及雜種優(yōu)勢(shì)[17，26]中，迄今尚未有針對(duì)煙草主流煙氣有害成分性狀的遺傳分析研究。本研究的8個(gè)主流煙氣有害成分釋放量性狀在連續(xù)3個(gè)世代的 RIL 群體中呈現(xiàn)出連續(xù)性且符合正態(tài)或偏正態(tài)分布，屬典型的數(shù)量性狀特征，表明了利用主基因+多基因混合遺傳模型對(duì)煙草主流煙氣代表性有害成分性狀遺傳分析的可行性和有效性。對(duì)其遺傳規(guī)律的分析表明，8個(gè)主流煙氣有害成分釋放量性狀在連續(xù)3年中的遺傳變異均受4對(duì)具有部分等加性的主基因遺傳模型控制，其中， CO 、HCN 、NNK 、NH3、 B[a]P 和 CRO 均受4對(duì)具有部分等加性1的主基因遺傳模型（4MG-EEA）控制； PHE 和 TAR 則均符合4 對(duì)具有部分等加性2 的主基因遺傳模型（4MG-EEEA）。

對(duì)煙草主流煙氣中有害成分釋放量性狀遺傳率的分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)性狀的主基因遺傳率范圍為74.00%～99.01%，其中， CO 、HCN 、NH3和 TAR 等4個(gè)性狀的主基因遺傳率均高達(dá)96.00%以上，由此可知該4個(gè)性狀的遺傳完全受主基因控制，為后期進(jìn)一步針對(duì)上述性狀開展 QTL 定位、分子標(biāo)記輔助選擇改良低危害煙草品種（系）提供了科學(xué)依據(jù)。此外，8個(gè)性狀的最佳遺傳模型在連續(xù)3個(gè)世代中均無微效多基因存在，進(jìn)一步表明該8個(gè)性狀的主基因起主導(dǎo)作用，非遺傳（環(huán)境）因素的影響較小，因而可在育種早期世代實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的分離和選擇，科學(xué)、高效地加快具有較低有害成分釋放量的單株/系的培育進(jìn)程。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，煙草重組自交系（RIL）群體8個(gè)主流煙氣有害成分性狀在連續(xù)3個(gè)世代均存在較廣泛變異，且呈正態(tài)或近似正態(tài)分布，屬典型的數(shù)量性狀。采用主基因＋多基因 SEA-DH（DH or RIL ）聯(lián)合分析方法，可知8個(gè)性狀均受4對(duì)主基因遺傳模型控制，其中， CO 、HCN 、NNK、NH3、B[a]P和 CRO 等6個(gè)性狀受4對(duì)具有部分等加性1的主基因遺傳模型控制（4MG-EEA）；PHE 和 TAR 則受4對(duì)具有部分等加性2的主基因遺傳模型控制（4MG-EEEA）。8個(gè)煙草主流煙氣有害成分性狀的遺傳變異主要由遺傳因素決定（主基因遺傳率平均為89.01%），其中， CO 、HCN 、NH3和 TAR 的主基因遺傳率高達(dá)97.16%、98.04%、99.01%和96.77%，這些具有極高遺傳率的主基因/QTL 存在將有助于進(jìn)一步開展煙草低有害成分性狀的分子標(biāo)記輔助選擇和 QTL 定位研究。

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