海洋來源產(chǎn)蛋白酶Bacillus zhangzhouensis sp.在速釀魚露中的應(yīng)用

白妞妞 付志英 陳嬋

摘要：文章從海洋來源的8株芽孢桿菌中篩選到了1株堿性蛋白酶活力最好的漳州芽孢桿菌，將其應(yīng)用到魚露發(fā)酵過程中，利用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳發(fā)酵條件為接種量4.15%、pH 9.13、溫度36.3 ℃。在此最佳發(fā)酵條件下，分別將魚露發(fā)酵15 h、3 d、7 d、15 d和30 d，結(jié)果表明，在發(fā)酵第7天時(shí)，魚露的氨基酸態(tài)氮和總氮含量較高，對(duì)魚露調(diào)味品市場(chǎng)的開發(fā)具有重大意義。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；蛋白酶；魚露；調(diào)味品；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS264.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）08-0090-08

Application of Protease-Producing Bacillus zhangzhouensis sp.

from the Sea in Fast-Brewed Fish Sauce

BAI Niu-niu， FU Zhi-ying*， CHEN Chan

（Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou 350119， China）

Abstract： In this paper， a strain of Bacillus zhangzhouensis sp. with the best alkaline protease activity is screened among 8 strains of Bacillus from the sea， and it is applied to the fermentation process of fish sauce. The best fermentation conditions optimized by response surface methodology are inoculation amount of 4.15%， pH of 9.13 and temperature of 36.3 ℃. Under the best fermentation conditions， fish sauce is fermented for 15 h， 3 d， 7 d， 15 d and 30 d respectively. The results show that on the 7th day of fermentation， the content of amino acid nitrogen and total nitrogen of fish sauce is higher， which is of great significance for the development of fish sauce seasoning market.

Key words： Bacillus; protease; fish sauce; seasoning; response surface methodology

收稿日期：2023-02-04

基金項(xiàng)目：雙高計(jì)劃（師資隊(duì)伍）2022年校級(jí)職業(yè)教育教學(xué)研究項(xiàng)目（2022G2006）

作者簡(jiǎn)介：白妞妞（1994－），女，碩士，研究方向：海洋生物資源開發(fā)。

通信作者：付志英（1979-），女，副教授，碩士，研究方向：食品微生物及食品發(fā)酵技術(shù)。

海洋覆蓋近70%的地球表面，并擁有巨大的生態(tài)、化學(xué)和生物多樣性。大海惡劣的化學(xué)和物理?xiàng)l件，如溫度和pH的變化、高壓和深層海水、基底有限等孕育了大量具有獨(dú)特酶學(xué)性質(zhì)的海洋微生物[1]。微生物在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外酶的技術(shù)中扮演著重要的角色，海洋來源的微生物具有產(chǎn)酶豐富、生長(zhǎng)周期短、不受季節(jié)和地理位置影響等特點(diǎn)，且所產(chǎn)蛋白酶大多為胞外蛋白酶[2]。然而，海洋生物的棲息地仍未得到充分開發(fā)。據(jù)估計(jì)，盡管經(jīng)過了250年的分類，已經(jīng)有超過120萬種物種被編入中央數(shù)據(jù)庫，但仍有91%的海洋物種有待描述[3]?？梢姡罅﹂_發(fā)海洋微生物資源對(duì)進(jìn)一步掌握蛋白酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值具有重大意義。

蛋白酶根據(jù)其來源可分為動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶[4]。其中微生物蛋白酶約占世界酶總銷售額的60%，是工業(yè)酶中最重要的一類，根據(jù)其種類，蛋白酶可分為酸性、中性和堿性蛋白酶，芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶具有較高的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，甲基營養(yǎng)芽孢桿菌（KE2）被證明通過蛋白酶的作用能有效地提高食品的營養(yǎng)價(jià)值和感官特性，異源鹵代芽孢桿菌可作為風(fēng)味增強(qiáng)劑提高魚露中的天冬氨酸、谷氨酸等鮮味來源物質(zhì)的含量，而多黏芽孢桿菌D05-1的胺降解活性可作為魚露發(fā)酵劑有效地減少魚露中生物胺的積累，增強(qiáng)魚露的風(fēng)味[5-7]。近年來，研究人員將芽孢桿菌作為一種有益菌用于提高食品的營養(yǎng)和食用價(jià)值[8-9]。

據(jù)古書記載，魚露是一種調(diào)味品，營養(yǎng)價(jià)值高，味道鮮美[10]。傳統(tǒng)魚露發(fā)酵是以低值魚或魚的下腳料為原料，加入30%～40%的海鹽，在太陽下暴曬發(fā)酵1～2年后得到的魚醬油產(chǎn)品，該發(fā)酵過程中微生物扮演著重要的角色，從而形成了魚露產(chǎn)品的獨(dú)特特性[11-12]。據(jù)報(bào)道，嗜鹽古菌在魚露發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用，對(duì)魚露的風(fēng)味有顯著的貢獻(xiàn)作用[13]。魚體本身含有的內(nèi)源性微生物將魚肉蛋白水解為游離氨基酸、小分子肽等風(fēng)味物質(zhì)，賦予魚露獨(dú)特的鮮香味。其中，鹽菌屬、鹽單胞菌屬、四聯(lián)球菌屬和念珠菌屬是魚露風(fēng)味形成的主要菌屬[14-17]。然而，這些游離氨基酸在相應(yīng)的氨基酸脫羧酶作用下被分解為各種生物胺，不同程度地影響了魚露的風(fēng)味，組胺、酪胺、尸胺和腐胺是魚露最常見的4種生物胺[18]。近年來，科研人員將分離得到的EC-1118酵母菌、植物乳桿菌和清酒曲等應(yīng)用于魚露發(fā)酵過程中，有效縮短了魚露的發(fā)酵周期，改善了魚露的風(fēng)味[19-21]。但高含量生物胺的存在始終沒有得到有效的解決，嚴(yán)重限制了消費(fèi)者對(duì)它的接受性[22-25]。

本研究從海洋來源的8株芽孢桿菌中篩選到了1株產(chǎn)堿性蛋白酶活力最好的漳州芽孢桿菌1A08372作為發(fā)酵魚露的發(fā)酵劑，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了探討，最后開發(fā)了一種快速發(fā)酵魚露的新方法，研究成果對(duì)推動(dòng)海洋資源深加工和魚露產(chǎn)品高值化具有重要意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種

8株芽孢桿菌其編號(hào)分別為1A08371、1A08372、1A08158、1A00016、1A08094、1A05132、1A14813和1A08647，均來源于自然資源部第三海洋研究所海洋微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及相關(guān)溶液的配制

氫氧化鈉、醋酸、濃鹽酸（36%～37%）、無水碳酸鈉、三氯乙酸、醋酸鈉、十二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、硼酸鈉、干酪素、福林酚、L-酪氨酸、生理鹽水：均購自Aladdin試劑公司；溶菌酶：購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

0.1 mol/L氫氧化鈉、6 mol/L醋酸溶液、0.1 mol/L 鹽酸溶液、0.2 mol/L磷酸氫二鈉、0.2 mol/L磷酸二氫鈉、0.4 mol/L碳酸鈉溶液、0.4 mol/L三氯乙酸、醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 3，適用于酸性蛋白酶）、磷酸緩沖液（pH 7.5，適用于中性蛋白酶）、硼酸緩沖液（pH 10.5，適用于堿性蛋白酶）、0.2 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8）：配制方法參照2015年版《中華人民共和國藥典》。

2%酪蛋白溶液的配制：準(zhǔn)確稱取干酪素粉末2 g于燒杯中，并加入0.1 mol/L氫氧化鈉10 mL，攪拌使其溶解，并加入相應(yīng)的緩沖液75 mL，在沸水中加熱攪拌使溶解，再轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容至刻度，當(dāng)日配用或置于冰箱中保存，有效期為3 d。

福林酚稀釋液：使用時(shí)將福林酚試劑與超純水按1∶2混勻。

1.3 培養(yǎng)基

主要培養(yǎng)基見表1。

1.4 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表2。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 8株芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將8株芽孢桿菌置于溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h（1A08371、1A08372、1A08158、1A00016用FS1培養(yǎng)，1A08094、1A05132、1A14813用FS2培養(yǎng)，1A08647用FS3培養(yǎng)），然后于溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下進(jìn)行種子液培養(yǎng)24 h。再接入1%的種子液到100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行不間斷發(fā)酵培養(yǎng)。將培養(yǎng)液每隔3 h上從發(fā)酵培養(yǎng)液中吸取1 mL（在超凈工作臺(tái)上操作），在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)OD600 nm值，最后將每株芽孢桿菌在不同時(shí)間段測(cè)得的吸光度值繪制成生長(zhǎng)曲線。

2.2 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的初篩

分別配制400 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（1A08371、1A08372、1A08158、1A00016用FS1培養(yǎng)，1A08094、1A05132、1A14813用FS2培養(yǎng)，1A08647用FS3培養(yǎng)）和100 mL FS4培養(yǎng)基，在溫度為121 ℃的條件下滅菌20 min，滅菌后立即將FS4和基礎(chǔ)培養(yǎng)基取出，待降至常溫將兩者混合倒平板，制成產(chǎn)蛋白酶平板培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)將8株芽孢桿菌點(diǎn)種于所制得的產(chǎn)蛋白酶平板培養(yǎng)基上，倒置于溫度37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。觀察產(chǎn)蛋白酶平板培養(yǎng)基上是否有透明水解圈出現(xiàn)，測(cè)量透明水解圈直徑和菌落直徑的大小，并計(jì)算兩者的比值（透明水解圈直徑/菌落直徑=H/C），初步判定8株芽孢桿菌是否產(chǎn)蛋白酶以及產(chǎn)蛋白酶活力的大小。

2.3 胞內(nèi)酶和胞外酶的鑒定

將初篩后的芽孢桿菌發(fā)酵液于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速9 000 r/min的條件下離心5 min，得到細(xì)胞外上清液和沉淀，向沉淀中加入0.2 mol/L 的PBS緩沖液（pH 6.8）和溶菌酶各2 mL，混勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，60 W，總時(shí)長(zhǎng)10 min，間隔10 s，持續(xù)5 s，然后離心，得到細(xì)胞內(nèi)上清液。用直徑為6 mm的打孔器在每個(gè)產(chǎn)蛋白酶的平板培養(yǎng)基上打3個(gè)孔，其中上2孔注入30 μL細(xì)胞外上清液，下1孔注入30 μL細(xì)胞內(nèi)上清液，置于溫度為28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察孔邊緣是否有透明圈出現(xiàn)。

2.4 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的復(fù)篩

2.4.1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥的L-酪氨酸粉末100 mg于燒杯中，加入0.1 mol/L的鹽酸60 mL，完全溶解后轉(zhuǎn)移至1 000 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸定容至刻度，即得濃度約為100 μg/mL的酪氨酸儲(chǔ)備液。

精密吸取上述儲(chǔ)備液，分別配制10，20，30，40，50，60，70 μg/mL的酪氨酸溶液，并分別從上述溶液中吸取2 mL加入一系列試管中，各加入0.4 mol的碳酸鈉5 mL和福林酚稀釋液1 mL，振蕩混勻，置于40 ℃的恒溫水浴鍋中顯色20 min，用紫外分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)其吸光度（OD值），并計(jì)算K值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、L-酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 蛋白酶活力大小的測(cè)定

將初篩后得到的產(chǎn)胞外蛋白酶芽孢桿菌發(fā)酵液于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速14 000 r/min的條件下離心5 min，得到發(fā)酵上清液，并用滅菌后的生理鹽水稀釋一定倍數(shù)，作為待測(cè)粗酶液。將用不同pH值緩沖液（醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 3，適用于酸性蛋白酶、磷酸緩沖液pH 7.5，適用于中性蛋白酶和硼酸緩沖液pH 10.5，適用于堿性蛋白酶）定容得到的2% 酪蛋白溶液置于溫度為40 ℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，待測(cè)粗酶液預(yù)熱1 min，分別向樣品管和空白管中加入待測(cè)粗酶液1 mL，然后在樣品管中先加入酪蛋白1 mL使其反應(yīng)，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，立即加入0.4 mol的三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)。而在空白管中先加入0.4 mol的三氯乙酸2 mL反應(yīng)10 min促使酶失活，再加入酪蛋白1 mL作為對(duì)照，劇烈振蕩使其充分混合，于40 ℃水浴鍋中保溫20 min，然后于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速14 000 r/min的條件下離心5 min，得到上清液。分別從樣品管和空白管中吸取上清液1 mL，加入0.4 mol 的碳酸鈉5 mL、福林酚稀釋液1 mL，于溫度40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫顯色20 min，用紫外分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品和空白對(duì)照做3個(gè)平行，取平均值。由上述條件規(guī)定，1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生l μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白酶活力（U/mL）=（A樣－A空）×（4/10）×K×N。

式中：A樣為樣品組的吸光值；A空為空白組的吸光值；K為吸光常數(shù)；N為酶液稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)液總體積，mL；10為反應(yīng)總時(shí)間，min。

2.5 單因素優(yōu)化1A08372在速釀魚露調(diào)味品中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取巴浪魚加入10%的海鹽，1∶1的超純水，調(diào)節(jié)pH，作為制備魚露的原料，添加從海洋中篩選到的1A08372，于搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)15 h，制成速釀魚露，利用單因素實(shí)驗(yàn)分別探討初始pH、發(fā)酵溫度和1A08372接種量對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響。

2.5.1 初始pH對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

分別向初始pH為6，7，8，9，10的魚露原料中接入6%的1A08372種子液，于發(fā)酵溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下發(fā)酵15 h，制成速釀魚露，每個(gè)條件做3組平行，測(cè)定發(fā)酵后速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量。

2.5.2 溫度對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

向初始pH為9的魚露原料中接入6%的1A08372種子液，分別在發(fā)酵溫度20，25，30，35，40 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下發(fā)酵15 h，制成速釀魚露，每個(gè)條件做3組平行，測(cè)定發(fā)酵后速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量。

2.5.3 1A08372接種量對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

向初始pH為9的魚露培養(yǎng)基中分別接入2%、4%、6%、8%、10%的1A08372種子液，在發(fā)酵溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下發(fā)酵15 h，每個(gè)條件做3組平行，測(cè)定發(fā)酵后速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化1A08372在速釀魚露調(diào)味品中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)溫度為35 ℃、1A08372接種量為4%、初始pH為9時(shí)，速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量較高。根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，將發(fā)酵溫度、1A08372接種量和初始pH 3個(gè)因素分別用A、B、C表示，且每個(gè)因素的低、中、高水平分別用－1，0，1編碼表示，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值（Y），通過響應(yīng)面分析對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，取平均值。數(shù)據(jù)采用Design Expert和Microsoft Office Excel 2003 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。具體設(shè)計(jì)方案見表3。

為了驗(yàn)證該模型數(shù)據(jù)的精確性和可靠性，將響應(yīng)面分析后得到的最優(yōu)條件以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，與Design Expert軟件數(shù)據(jù)分析后得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比。

2.7 速釀魚露調(diào)味品發(fā)酵時(shí)間的確定

取巴浪魚加入10%的海鹽，1∶1的超純水，調(diào)節(jié)pH為9.13，分別制備空白對(duì)照組（不加1A08372）和外加1A08372種子液4.15%的速釀魚露樣品組，于溫度36.3 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下分別培養(yǎng)15 h、3 d、7 d、15 d和30 d，每組樣品做3組平行，分別測(cè)定樣品中氨基酸態(tài)氮和總氮含量。其中，氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參照GB 5009.235－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》，總氮含量的測(cè)定參照GB 5009.5－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

3 結(jié)果和討論

3.1 8株芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線從本質(zhì)上反映了細(xì)菌的生長(zhǎng)性能，測(cè)定了8株海洋來源的芽孢桿菌發(fā)酵液在600 nm處的吸光度，繪制出對(duì)應(yīng)的芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，菌株1A08371、1A08158、1A08372、1A00016的生長(zhǎng)性能較好。

3.2 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的初篩結(jié)果

具有產(chǎn)蛋白酶活力的芽孢桿菌在產(chǎn)蛋白酶平板培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生透明圈，且透明圈的大小初步反映了產(chǎn)蛋白酶能力的強(qiáng)弱。由圖2可知，8株芽孢桿菌在產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上都能夠產(chǎn)生透明圈，其中菌株1A08372、1A08371、1A00016、1A08158、1A14813的H/C值大于2（見表4），表明這5株菌有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，對(duì)其進(jìn)行胞內(nèi)酶和胞外酶的鑒定，并進(jìn)行復(fù)篩。

3.3 胞內(nèi)酶和胞外酶鑒定結(jié)果

由圖3可知，這5株芽孢桿菌的細(xì)胞外上清液能產(chǎn)生透明圈，而細(xì)胞內(nèi)上清液不能產(chǎn)生透明圈，表明這5株芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶均為胞外蛋白酶。

3.4 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的復(fù)篩結(jié)果

3.4.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖4可知，L-酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010 2x+0.008 7，其中R2=0.999 6，計(jì)算出K值=97.186 3，用于蛋白酶活力的測(cè)定。

3.4.2 蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，芽孢桿菌1A08372產(chǎn)堿性蛋白酶的活力最好，為（179.14±3.55） U/mL，選取該菌株，并以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)做下一步速釀魚露調(diào)味品條件的優(yōu)化。

3.5 1A08372在速釀魚露調(diào)味品中單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 初始pH對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖6可知，隨著初始pH的升高，速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH為9時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，為（0.35±0.003） g/dL，這可能是因?yàn)閜H為9時(shí)接近1A08372的最佳產(chǎn)酶條件，此時(shí)速釀魚露原料中的蛋白酶含量最多，迅速將魚露中的魚肉蛋白酶分解，從而使氨基酸態(tài)氮含量上升，當(dāng)初始pH超過9時(shí)，超出了1A08372的堿性耐受范圍，此時(shí)速釀魚露中的蛋白酶含量較少，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量下降。因此，適宜初始pH能促進(jìn)微生物發(fā)酵，增加速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量。

3.5.2 溫度對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖7可知，當(dāng)初始pH為9時(shí)，溫度的變化能引起速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的變化，速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量在溫度為20～25 ℃范圍中變化不大，而在30 ℃后迅速上升，這可能是由于1A08372在30 ℃時(shí)產(chǎn)酶活力最好，速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量迅速上升，在35 ℃時(shí)酶的積累量最多，氨基酸態(tài)氮含量也達(dá)到最大，為（0.4±0.003） g/dL，當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，1A08372所產(chǎn)的部分蛋白酶失活，從而導(dǎo)致速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量有所下降。因此，適宜的溫度能控制1A08372所產(chǎn)的堿性蛋白酶活力，使得速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大。

3.5.3 1A08372接種量對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖8可知，當(dāng)溫度為35 ℃、pH為9時(shí)，1A08372的接種量對(duì)速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量有一定的影響，且不同接種量的1A08372能不同程度地影響速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量，隨著1A08372接種量的增加，氨基酸態(tài)氮含量先升高后下降，當(dāng)1A08372接種量為4%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，為（0.53±0.006） g/dL，1A08372接種量過高，消耗了速釀魚露中的營養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸態(tài)氮含量下降，表明適宜接種量的1A08372能增加速釀魚露中的氨基酸態(tài)氮含量。

3.6 1A08372在速釀魚露調(diào)味品中的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于在第10組中發(fā)現(xiàn)最高含量的氨基酸態(tài)氮（見表5），因此將其水平確定為中心點(diǎn)，通過RSM確定了這3個(gè)影響因素的最優(yōu)條件。下面的回歸方程顯示了魚露培養(yǎng)基條件與氨基酸態(tài)氮含量的關(guān)系：Y=0.674 8+0.056 5A+0.005 1B+0.013 8C+0.003 9AB+0.010 0AC+0.005 1BC－0.112 6A2－0.045 8B2－0.064 8C2。

其中響應(yīng)值（Y）表示氨基酸態(tài)氮含量（g/dL），A、B和C分別表示溫度、接種量和pH。

由表6可知，模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)（P=0.052 3>0.05）不顯著，說明回歸方程擬合較好，模型穩(wěn)定。由F（A）=116.37、F（B）=0.963 0、F（C）=6.94可知A、B、C對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的大小順序?yàn)锳>C>B，即溫度>pH>接種量。其中A的P<0.01，表明發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量有極顯著的影響，而C的P（0.033 7）<0.05，說明pH對(duì)氨基酸態(tài)氮含量有顯著影響。模型的確定系數(shù)R2=0.986 9，表示該模型能較好地預(yù)測(cè)氨基酸態(tài)氮含量，調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.970 0，說明該模型誤差小、準(zhǔn)確度高，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化情況。

由圖9可知，最優(yōu)條件為A=36.3 ℃、B=4.15%、C=9.13，對(duì)應(yīng)最佳發(fā)酵條件為溫度36.3 ℃、1A08372接種量4.15%、pH 9.13，在此條件下，預(yù)測(cè)出的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大，為（0.68±0.002 7） g/dL。經(jīng)過3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.67±0.033），（0.68±0.004 2），（0.68±0.018） g/dL，與預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，說明該模型具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性，可用作氨基酸態(tài)氮含量的預(yù)測(cè)。

3.7 速釀魚露調(diào)味品發(fā)酵時(shí)間的確定

3.7.1 速釀魚露中氨基酸態(tài)氮含量

由圖10可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，外加1A08372速釀魚露和空白對(duì)照組魚露中的氨基酸態(tài)氮含量總體變化趨勢(shì)一致，均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且與空白對(duì)照組相比，1A08372組能夠顯著增加速釀魚露發(fā)酵過程中的氨基酸態(tài)氮含量。其中，1A08372發(fā)酵3 d時(shí)（0.96±0.02） g/dL和7 d時(shí)（0.91±0.03） g/dL速釀魚露調(diào)味品中的氨基酸態(tài)氮含量較高。

3.7.2 速釀魚露調(diào)味品中總氮含量

由圖11可知，1A08372速釀魚露在發(fā)酵15 h、3 d、7 d、15 d和30 d時(shí)的總氮含量分別為（1.24±0.01），（1.37±0.02），（1.38±0.02），（0.94±0.05），（0.68±0.01） g/dL。與空白對(duì)照組相比，1A08372組能夠顯著增加速釀魚露發(fā)酵過程中的總氮含量。其中，1A08372發(fā)酵7 d時(shí)速釀魚露中的總氮含量較高，且達(dá)到了一級(jí)魚露的標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本文用透明圈法對(duì)8株海洋來源芽孢桿菌進(jìn)行了篩選，其中1A08371、1A08372、1A08158、1A00016和1A14813這5株芽孢桿菌的H/C值大于2，表明這5株芽孢桿菌具有較好的產(chǎn)蛋白酶活力，對(duì)其進(jìn)行胞內(nèi)酶和胞外酶的鑒定并利用福林酚法進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果顯示，5株芽孢桿菌的細(xì)胞內(nèi)上清液不能產(chǎn)透明圈而細(xì)胞外上清液能夠產(chǎn)透明圈，表明這5株芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶均為胞外蛋白酶，且胞外蛋白酶活力最大的為芽孢桿菌1A08372。為了將1A08372較好地應(yīng)用到速釀魚露調(diào)味品的制備中，利用響應(yīng)面法研究了1A08372在速釀魚露調(diào)味品制備原料中的最佳發(fā)酵條件：種子液接種量4.15%、pH 9.13、溫度36.3 ℃。在此發(fā)酵條件下，魚露調(diào)味品原料中的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大。最后，分別制備了1A08372快速發(fā)酵15 h、3 d、7 d、15 d和30 d的速釀魚露調(diào)味品，對(duì)其氨基酸態(tài)氮、總氮含量進(jìn)行了測(cè)定和分析，初步得出發(fā)酵7 d時(shí)速釀魚露調(diào)味品的氨基酸態(tài)氮和總氮含量較高，且風(fēng)味較好，該研究結(jié)果為海洋微生物資源在中國調(diào)味品市場(chǎng)的利用提供了重要參考。

5 展望

通過采用1A08372作為發(fā)酵劑，僅發(fā)酵7 d即得到了低鹽快速發(fā)酵魚露調(diào)味品，縮短了發(fā)酵周期，但經(jīng)此方法快速發(fā)酵的魚露風(fēng)味遠(yuǎn)不如利用傳統(tǒng)工藝發(fā)酵2年以及其他地方傳統(tǒng)魚露調(diào)味品的風(fēng)味[26]。近年來，許多研究者通過在魚露調(diào)味品中添加曲霉、酵母或植物提取物改善魚露的風(fēng)味，有了很大突破[27-31]。因此，推測(cè)采用1A08372作為低鹽魚露發(fā)酵劑的同時(shí)添加曲霉、酵母或植物提取物，并對(duì)其添加比例進(jìn)行研究能夠獲得風(fēng)味更佳的魚露調(diào)味品。此外，有研究表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG酶）能夠通過控制氨基酸的轉(zhuǎn)化途徑從而抑制生物胺的形成[32]，且許多研究者采用多種發(fā)酵劑混合發(fā)酵魚露得到了較好的效果[33-35]，因此，篩選能夠產(chǎn)TG酶的海洋微生物與1A08372作為混合發(fā)酵劑，可有效提高生物胺的控制效果，進(jìn)一步改善魚露調(diào)味品的風(fēng)味和品質(zhì)。

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