生物技術降解海帶巖藻聚糖硫酸酯分子研究現(xiàn)狀

聶小偉，何粉霞，畢可海，張玉清

（威海海洋職業(yè)學院，山東 威海 264300）

0 引言

對多糖進行改性修飾，可改變其結構構象和基團種類，從而改善其生物活性[3]。常用改性修飾方法包括物理或化學降解改變多糖分子量大小，或用化學修飾引入新的官能團，從而改變其基團種類[5]。目前，對海帶多糖改性常采用改變其分子量，來提升多糖生物活性，將2 種改性方式聯(lián)合改性的研究目前鮮見報道。

1 海帶巖藻聚糖硫酸酯分子結構與生物活性的構效關系

海帶巖藻聚糖硫酸酯是含多支鏈的2,4 - 硫酸酯基，由1,3-α-L- 巖藻糖聚合成的天然、復雜多糖，并且受生長地域和環(huán)境的影響[5]，主要糖成分包括半乳糖、α-L- 半乳聚糖和巖藻糖等[6]。其抗凝血活性與4-α-L- 巖藻糖-1 單元上C3 位置有關，其凝血活性與硫酸酯含量呈正相關，且?guī)r藻聚糖的低分子量較中分子量降血栓活性效果更好。可見，巖藻多糖的硫酸酯的位置、含量及分子量會影響其抗凝血活性[7]。 有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)降解處理的硫酸化多糖片段，其硫酸酯含量越多，抗氧化能力越強；低分子量的片段對樣品氧化作用、抑制作用越好，而大分子量的抑制效果較差。

同時證實，經(jīng)自由基氧化降解得到的低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯具有抗氧化和改善血脂黏度作用，如降低血脂沉積和溶血栓等作用[8]。

海帶巖藻多糖的結構見圖1。

圖1 海帶巖藻多糖的結構

1.1 海帶巖藻聚糖硫酸酯分子量大小對其生物活性的影響

海帶巖藻聚糖硫酸酯的相關生物活性與其分子量大小呈反相關，主要是由于小分子量多糖成分更容易滲透細胞膜結構，達到受體部位與配體發(fā)生反應，調節(jié)機體生理功能。

研究表明，具有抗凝血活性的巖藻聚糖硫酸酯分子量一般為21~24 kDa，在C-4 位置有硫酸基，并且多糖組分中硫酸基、巖藻單糖與半乳糖含量呈一定比例。海帶和藻多糖硫酸酯的抗凝血活性隨分子量的增大而增強，但分子量超出一定范圍后其抗凝血活性會降低，在分子量為8 000 Da 的樣品抗凝血活性最強。通過體外試驗證實，低分子量海帶多糖硫酸酯的抗氧化活性，其清除超氧陰離子和自由基的能力隨分子量的減小而增強；低分子量組分對膽固醇酯氫過氧化物有很好的抑制作用，較大分子組分顯著提高，而且硫酸根含量越高，抗氧化效果越好。同時，海帶中的低分子量巖藻聚糖硫酸酯可以有效減輕糖尿病、腎病引起的炎癥反應，其分子量更小的組分，阻止草酸鈣形成的能力越強[8]。

海帶巖藻聚糖硫酸酯分子量大小對其生物活性的影響見表1。

表1 海帶巖藻聚糖硫酸酯分子量大小對其生物活性的影響

1.2 海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸基團對其生物活性的影響

硫酸基是一種重要的生理活性陰離子基團，在海帶多糖中的含量會影響其抗氧化活性和其他生理活性，并具有正相關性。研究表明，分子量大小和硫酸基含量對日本海帶巖藻多糖的抗凝血活性有顯著影響，隨分子量和硫酸化糖殘基的增加，其抗凝血活性越強，并且高硫酸化程度對纖維蛋白凝血酶發(fā)生反應具有顯著影響。通過對比發(fā)現(xiàn)，具有相同結構的低分子量巖藻多糖，當硫酸基團含量達到20%以上時，其抗凝血活性顯著增強。同時，經(jīng)雙硫酸基取代的泡葉藻褐藻多糖硫酸酯，其抗凝血活性也能顯著增強[9]。

高熱、眼結膜充血卻不伴分泌物增多、口腔及粘膜充血、手足硬腫、軀干有多形紅斑、頸部淋巴結腫大、白細胞和C反應蛋白陽性，出現(xiàn)這些癥狀是的川崎病表現(xiàn)，不是一般的細菌和病毒感染，治療不及時會有心臟方面的后遺癥，要警惕。

Saha S 等人[10]在研究海帶多糖的抗病毒活性時，用濃硫酸改性制備硫酸基含量更高的海帶多糖樣品，經(jīng)對照試驗發(fā)現(xiàn)其抗病毒活性與硫酸基含量相關，更高的硫酸基含量的海帶多糖樣品具有更好的抗病毒活性。但也有報道指出，在某些情況下硫酸基含量對海帶多糖的活性影響不大。Peng Z 等人[11]在研究分子量與海帶多糖的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，分子量較大時，硫酸基及糖醛酸含量對海帶多糖的抗氧化能力影響并不顯著，其原因可能是硫酸基團阻礙了海帶多糖與自由基的反應，而在分子量較小時硫酸基含量對海帶多糖的抗氧化能力影響較大。

有研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖清除超氧陰離子自由基能力與其硫酸基含量呈正相關。在巖藻多糖C-3 和C-4 位上與三氧化硫三甲胺進行硫化反應，得到一種過硫酸化巖藻多糖，由于硫酸基帶較大負電而使巖藻多糖形成負電荷空間，與蛋白質結合抑制癌細胞的生長。并且硫酸化程度越高，抑制效果越顯著。

海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸基團對其生物活性的影響見表2。

表2 海帶巖藻聚糖硫酸酯硫酸基團對其生物活性的影響

1.3 海帶巖藻聚糖硫酸酯單糖組成對其生物活性的影響

褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性與褐藻糖、硫酸根的含量及單糖的種類有關。 Peng Z 等人[11]從海帶中提取、分離出WPS1、WPS2 和WPS3 共3 種多糖組分，對其單糖組成種類和含量分析發(fā)現(xiàn)，3 種多糖中均含有鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖和木糖，并且WPS1 中木糖和WPS2 中鼠李糖含量最高，兩者中甘露糖和巖藻糖含量也較高，但WPS1 具有最強的超氧陰離子自由基清除能力，WPS2 具有最強的羥基自由基清除能力。張加幸[9]研究發(fā)現(xiàn)，將提取的海帶多糖經(jīng)純化、分級得到3 個多糖組分F1、F2 和F3，其中組分F3 的超氧陰離子自由基清除能力和羥基自由基清除能力均最強，F(xiàn)3 只由巖藻糖和半乳糖2 種單糖成分組成，且?guī)r藻糖和半乳糖成分較其他3 種多糖中單糖組分均為最低，可見海帶巖藻聚糖硫酸酯中半乳糖含量與其抗氧化活性相關。

1.4 不同品種和加工方式的海帶巖藻聚糖硫酸酯對其生物活性的影響

張加幸[9]選取新奔牛、早熟、三海和?？? 號4 種品種新鮮海帶提取的巖藻聚糖硫酸酯進行體外抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內，上述新鮮原料制備的巖藻多糖均表現(xiàn)出清除DPPH 自由基和羥自由基的能力，并且?guī)r藻多糖濃度與自由基清除能力呈正相關。而在同等濃度條件下，早熟品種巖藻多糖的DPPH 自由基和羥自由基清除能力最低。經(jīng)過晾曬、壓榨和漂燙加工處理的?？? 號海帶制備的巖藻多糖，在相同濃度下，新鮮海帶組對自由基清除能力最強，壓榨組次之，晾曬組最低。

1.5 海帶巖藻聚糖硫酸酯化學修飾對其生物活性的影響

化學修飾可以提高褐藻多糖活性，降低毒副作用的有效化學改性手段。研究發(fā)現(xiàn)，海帶巖藻聚糖的硫酸基取代度越大，海帶多糖的抗凝血和抑制細胞增殖活性越強。通過對褐藻多糖硫酸酯的過硫酸化修飾，可抑制腫瘤新生血管內皮細胞生長因子作用，從而提高其抗腫瘤能力[12]。汪東風等人[13]用四價鈰離子與褐藻多糖發(fā)生螯合反應，生成水溶性褐藻多糖鈰配合物。在中性緩沖溶液體系下，能降解牛血清白蛋白，但對質粒無明顯活性作用。傅德賢等人[14]用Fe3+和Zn2+與半葉馬尾藻多糖進行反應，生成的海藻多糖鐵鋅配合物。在小鼠體內試驗中發(fā)現(xiàn)，可以顯著提高小鼠血液中血紅蛋白和紅細胞數(shù)量。

2 海帶巖藻聚糖硫酸酯降解技術研究現(xiàn)狀

海帶多糖的化學結構組成決定了其具有的功能活性，對其結構的準確解析，顯得尤為重要。通常解析多糖結構，需將其降解為低分子量片段，依據(jù)片斷信息推測其結構組成。同時，已證實低分子量海帶多糖更易被人體消化道吸收，且生物活性有顯著改善[15]。由此可見，將海帶多糖進行降解低分子化顯得尤為重要。

目前，強酸、生物酶、超聲波/微波輔助和自由基氧化降解技術在褐藻多糖降解研究中較常用，其各具優(yōu)缺點。傳統(tǒng)的酸堿降解技術工藝簡單、投入低，但反應劇烈、不易控制、易發(fā)生副反應，如脫硫酸基等。自由基氧化降解技術條件溫和、易于操作、副反應破壞少、無脫硫酸基作用、成本低廉、效率高，因此對該法降解海帶硫酸化多糖的研究報道較多[16]。超聲波降解方法效果較好，采用超聲波降解海帶多糖分子，可有效控制降解分子量的分布范圍[17]。而海帶多糖生物酶降解技術選擇性好，反應溫和，目標分子量片段集中，但從自然界中獲取困難，目前沒有商品化的生物酶，成本較高[18]。可見，采用生物降解技術獲得不同分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯，具有很高的應用價值。

巖藻聚糖硫酸酯不同降解技術對比見表3。

表3 巖藻聚糖硫酸酯不同降解技術對比

3 生物降解海帶巖藻聚糖硫酸酯初步研究

3.1 生物降解海帶巖藻聚糖硫酸酯概述

能夠降解海帶巖藻聚糖硫酸酯的生物酶是巖藻聚糖裂解酶，包括巖藻聚糖酶，α-L- 巖藻糖苷酶和硫酸酯酶，主要來源于食用褐藻的軟體動物內臟，如鮑魚內臟等，以及部分海洋微生物，如Pseudomonas carrageenovora 和Pseudomonas atlantica 等細菌類，Aspergillus wentii（PZ322） 和Dendryphiella arenaria TM94 等真菌[19]。Sakai T 等人[20]分離出巖藻聚糖酶從海洋細菌Fucophilus fucoidanolyticus 中，該酶只能獲得葡萄糖醛酸殘基所連接的糖苷鍵，從裂解奧氏海藻巖藻聚糖分子中巖藻糖C2 位上支鏈。Tanaka K 等人[21]利用α-L- 巖藻糖苷酶裂解巖藻糖苷鏈獲得L- 巖藻糖單硫酸鹽，該酶由鮑魚肝臟中提取純化所得。

不同生物降解形式對海帶巖藻聚糖硫酸酯的影響見表4。

表4 不同生物降解形式對海帶巖藻聚糖硫酸酯的影響

3.2 生物酶降解海帶巖藻聚糖硫酸酯的研究現(xiàn)狀

有學者從海洋軟體動物消化腺中提取有降解褐藻多糖活性的蛋白質，并發(fā)現(xiàn)黃桿菌可被巖藻多糖誘導產(chǎn)生將自身組分降解為小于10 000 Da 低分子物質的生物酶，降解過程中幾乎不會脫硫酸酯基。另外，一些研究人員從刺參、墨角藻和繩藻中分離出的3 種假單胞菌，均可內切降解巖藻多糖組分為α-L 型低分子量硫酸酯多糖。同時，有學者將一株可產(chǎn)降解海藻多糖內切酶的海洋細菌，用于降解一種裙帶菜的巖藻聚糖，獲得7 種分子質量從305~3 749 Da 的巖藻多糖的片段[22]。

利用生物酶對多糖進行降解，可獲得分子質量較均一、集中的降解產(chǎn)物，并且不破壞多糖結構。此法的主要優(yōu)點是高效專一、反應溫和、控制簡單，將成為未來海洋多糖降解方法的研究熱點。該法唯一不足是成本較高，還沒有商品化的產(chǎn)品應用于實際生產(chǎn)。

3.3 微生物降解海帶巖藻聚糖硫酸酯的研究現(xiàn)狀

海帶多糖降解菌株或生物酶的高效獲取，將影響海帶多糖深加工利用的前景。有學者從海洋微生物中篩選出一株產(chǎn)巖藻聚糖降解酶的桿菌，以及從酪酸梭菌、糞鏈球菌和弧菌等細菌中提取出一種糖基轉移酶，可將羊棲菜、裙帶菜和海帶等褐藻中巖藻多糖組分降解成30 000~50 000Da 的巖藻聚糖硫酸酯[22]。

同時，國內學者從腐爛海帶中篩選出一株芽孢桿菌和嗜鹽白蟻菌，分別具有褐藻膠裂解酶活性、淀粉酶及褐藻膠裂解酶活性；還有學者從海帶和海帶生產(chǎn)海域的海泥中，篩選出一株與芽孢桿菌有同源性、能降解海帶多糖的類芽孢桿菌菌株；以及通過篩選目標菌群，組建具有海帶降解功能的人工菌群。但目前能有實際應用價值，產(chǎn)復合降解酶的復合菌群還未見報道，絕大部分還停留在實驗室研究階段[23-24]。

從中國人的糞便微生物中分離出能夠降解瓊膠和卡拉膠的菌株，證明人腸道微生物可以降解這些海洋硫酸多糖，并對腸道有益菌有促進作用[25]。謝潔玲等人[26]研究表明，人體腸道微生物只能對少量分子量大于20 kDa 的高分子量巖藻聚糖硫酸酯降解成為寡糖，而低分子量巖藻聚糖硫酸酯中的寡糖幾乎全部被利用，證明腸道微生物對巖藻聚糖硫酸酯降解利用的難易程度與其分子量的大小有關。

4 生物降解海帶巖藻聚糖硫酸酯的初步試驗及應用展望

研究現(xiàn)狀表明，由于物理降解巖藻多糖的效率低，分子量大，多用于輔助自由基氧化降解的研究，實際生產(chǎn)中不常見。而酸水解巖藻聚糖硫酸酯得到的低聚糖產(chǎn)率也較低，而且得到的多糖均一性差，脫硫現(xiàn)象比較嚴重，脫鹽步驟繁瑣；自由基降解法既能有效降解高分子量巖藻聚糖又能較好地保留硫酸基團，在工業(yè)生產(chǎn)中易于控制，是一種較理想的化學降解法。

生物酶降解高效專一、反應溫和，降解產(chǎn)物分子量較均一、集中，并且不破壞多糖結構，酶解過程中無需加入其他反應試劑，也沒有副產(chǎn)物的生成。而目前可用的降解商品化酶很少，價格貴，成本高，若能找到合適的酶或產(chǎn)酶微生物將會大大促進酶降解法的應用?？梢?，未來尋找合適于糖苷鍵水解酶，用于特異性制備寡糖成為研究的熱點。