靶向CD30的CAR-T細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)條件優(yōu)化研究

田高輝，張琴星，史江舟，趙芬芳，王 寧，趙家旋，盧玉琳，徐 瑤

1.武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430081；

2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種可以人為操縱DNA和RNA的工具也得到了長(zhǎng)足發(fā)展，并改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)程［1］?；虔煼軌蛸x予細(xì)胞或有機(jī)體在自然狀態(tài)下不存在的能力［2］。在基因改造方面，慢病毒是最典型的代表，因?yàn)槠渚哂羞M(jìn)入細(xì)胞并將遺傳物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞的天然能力［3］。慢病毒載體經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，目前已經(jīng)進(jìn)入了第三代慢病毒載體階段。第一代慢病毒載體包含人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）基因組的大部分，以及一種病毒的包膜蛋白，最常見(jiàn)的是水泡性口炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G）［4］，VSV-G可以識(shí)別在細(xì)胞上廣譜表達(dá)的低密度脂蛋白受體［5-6］，因此使得該慢病毒載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛的細(xì)胞；第二代慢病毒載體去除了輔助毒性因子VIF、VPR、VPU和NEF［4］，提高了其安全性且不影響慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳物質(zhì)的能力；第三代慢病毒載體將病毒基因組gag和pol分裂成單獨(dú)的質(zhì)粒［7］，進(jìn)一步降低了由基因重組導(dǎo)致的的復(fù)制型慢病毒產(chǎn)生的概 率。

嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞技術(shù)是通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程改造技術(shù)，將靶向特異性抗原的單鏈抗體的輕重鏈可變區(qū)序列在患者的T細(xì)胞膜上表達(dá)，進(jìn)而特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的［8-9］。慢病毒載體的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了CAR-T細(xì)胞治療的發(fā)展。目前，已有多種CAR-T細(xì)胞治療進(jìn)入臨床應(yīng)用階段［10］。研究［11-13］表明，CAR-T細(xì)胞在治療B細(xì)胞惡性腫瘤方面取得了前所未有的療效，最顯著的是應(yīng)用抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的完全緩解率高達(dá)90%。

對(duì)于霍奇金淋巴瘤，CD30是一個(gè)理想的候選靶點(diǎn)，因?yàn)槠湓诨羝娼鹆馨土瞿[瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富且具有特異性，在正常組織中表達(dá)有限［14］?？笴D30 CAR-T細(xì)胞是最近新興的靶向CD30分子的CAR-T細(xì)胞，對(duì)霍奇金淋巴瘤有很好的治療作用［15］。有臨床研究［16-17］表明，抗CD30 CAR-T用于治療復(fù)發(fā)或難治性霍奇金淋巴瘤，淋巴清除后產(chǎn)生高應(yīng)答率并持續(xù)一般時(shí)間，具有極好的安全性和極小的毒性。隨著抗CD30 CAR-T細(xì)胞研究的進(jìn)行，利用慢病毒載體制備CAR-T細(xì)胞的技術(shù)研究取得了很大進(jìn)展，然而原代T細(xì)胞抗CD30 CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)條件還沒(méi)有進(jìn)行全面細(xì)致的研究。

影響慢病毒靜止轉(zhuǎn)導(dǎo)的因素通常有感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）、溫育密度、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化時(shí)間和轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度等［18-20］。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化抗CD30 CAR-T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)參數(shù)，以制備出高質(zhì)量的抗CD30 CAR-T細(xì)胞，以期為臨床試驗(yàn)所需的大量細(xì)胞的制備提供依據(jù)，同時(shí)也為其他靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)化提供參 考。

1 材料和方法

1.1 試劑

抗CD30 CAR慢病毒和CD30檢測(cè)蛋白為武漢波睿達(dá)生物科技有限公司贈(zèng)予，人原代T細(xì)胞從人外周血中提取，人CD3磁珠和人T cell TransAct購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司，T25和T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Corning公司，轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑聚凝胺（Polybrene）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，胎牛血清購(gòu)自上海吉泰依科賽生物科技有限公司，DMEM-Basic、RPMI-1640及TexMACSTMGMP培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

流式抗體：7-AAD、PE抗人CD25抗體和Alexa Fluor 488 Donkey抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，BV421抗人CD69抗體購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人原代T細(xì)胞的分離

采集健康人群外周血，經(jīng)等體積的生理鹽水稀釋后，緩慢加到已預(yù)先加入20 mL淋巴細(xì)胞分離液的50 mL離心管中，700×g離心20 min，離心時(shí)調(diào)節(jié)離心機(jī)升降參數(shù)至最低，離心后將環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層用移液器吸出，得到單個(gè)核細(xì)胞。以10 μL/2×107個(gè)細(xì)胞的比例加入人CD3磁珠，加入4倍體積的分選緩沖液后4 ℃溫育15 min，用5 mL分選緩沖液重懸，將懸液通過(guò)磁力柱，T細(xì)胞會(huì)通過(guò)磁珠被吸附到柱子上，用2 mL分選緩沖液洗兩遍柱子后，在柱子中加入5 mL分選緩沖液，用力快速推動(dòng)柱子上的活塞將T細(xì)胞沖洗下來(lái)，收集沖洗下來(lái)的細(xì)胞。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞

1.2.2.1 不同MOI對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

取需要數(shù)目的生長(zhǎng)狀況良好的原代T細(xì)胞于6孔板中，采用MOI為0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、3.00的梯度對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)補(bǔ)加Polybrene使其終濃度為5 μg/mL。轉(zhuǎn)導(dǎo)后持續(xù)監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞存活率。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)T細(xì)胞溫育密度對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影 響

確定最優(yōu)的MOI后，采用0.2×1 07、0.5×107、1.0×107、2.0×107個(gè)/mL的溫育密度轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞存活 率。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)前T細(xì)胞活化時(shí)間對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影 響

確定最優(yōu)的MOI和溫育密度后，選用人T cell TransAct刺激T細(xì)胞0、8、16、24、48及72 h后，轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞激活情況、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞存活率。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

轉(zhuǎn)導(dǎo)相同數(shù)量的T細(xì)胞，分別用T25和T75培養(yǎng)瓶作為容器，使轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度分別為0.16和0.53 mm，轉(zhuǎn)導(dǎo)后監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，采用鈣黃綠素釋放法檢測(cè)抗CD30 CAR-T細(xì)胞的體外殺傷效率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集大于5×105個(gè)CAR-T細(xì)胞于流式管中，向每管中加入1 ～ 2 mL流式緩沖液，500×g離心5 min，去掉上清液，重復(fù)洗2遍，用流式緩沖液配制好工作濃度的染色抗體重懸細(xì)胞，4 ℃避光染色30 min后，加入1 mL流式緩沖液終止染色，500×g離心5 min，棄去上清液，重復(fù)洗2遍，加2 μL 7-AAD抗體于100 μL流式緩沖液中重懸細(xì)胞，2 ～ 3 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)。

1.2.4 鈣黃綠素釋放法檢測(cè)抗CD30 CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

選取L428細(xì)胞系作為陽(yáng)性靶細(xì)胞，人骨髓瘤細(xì)胞系K562作為陰性靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為抗CD30 CAR-T細(xì)胞。將經(jīng)鈣黃綠素標(biāo)記、濃度為5×104個(gè)/mL的靶細(xì)胞接種于U底96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。按不同效靶比（25∶1、5∶1、1∶ 1）加入各組效應(yīng)細(xì)胞，體積為100 μL/孔。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（加入裂解液）和陰性對(duì)照組（加入磷酸緩沖鹽溶液）。各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育2.5 ～ 3.0 h。后將96孔板以700×g離心10 min，從各孔吸取150 μL上清液對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記好的新的平底96孔板中，置于酶標(biāo)儀（參數(shù)設(shè)置：激發(fā)光波長(zhǎng)為485/20，發(fā)射光波長(zhǎng)為530/25）掃描讀取熒光值。根據(jù)以下公式計(jì)算各組效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性：特異性裂解百分比（%）=（實(shí)驗(yàn)組熒光值－陰性對(duì)照組熒光值）/（陽(yáng)性對(duì)照組熒光值－陰性對(duì)照組熒光值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同MOI對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影 響

MOI對(duì)于T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率具有決定性的影響，因此我們首先從該條件開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)條件的優(yōu)化。根據(jù)本課題組以往研究［17］，分別采用MOI為0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、3.00的梯度對(duì)健康人群外周血來(lái)源的新鮮T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同MOI對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響，結(jié)果顯示，MOI為1.00、1.50和3.00組在第8天的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于0.00、0.25和0.50組［（25.60±3.51）%、（26.33±5.32）%和（32.67±6.47）%vs（1.00±0.00）%、（9.17±2.23）%和（14.50±4.81）%，P＜0.01］，1.00、1.50和3.00組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖1A），各組CAR-T細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)第8天的細(xì)胞存活率均為80%左右，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ［（84.67±5.20）%、（81.17±2.79）%、（79.50±2.74）%、（79.67±1.63）%、（79.00±1.55）%和（77.83±1.72）%，P＞ 0.05，圖1B］。

圖1 不同MOI對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of different MOI on transduction of anti-CD30 CAR-T cell

本實(shí)驗(yàn)還研究了不同MOI對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，不同MOI對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞的增殖能力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1C），但1.00、1.50和3.00組在第16天的抗CD30 CAR-T有效細(xì)胞數(shù)（T細(xì)胞數(shù)×轉(zhuǎn)導(dǎo)效率）顯著高于0.00、0.25和0.50組（P均＜0.01）；1.00、1.50、3.00組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。根據(jù)不同MOI的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、抗CD30 CAR-T細(xì)胞總數(shù)和有效細(xì)胞數(shù)等3個(gè)方面的情況，綜合慢病毒成本，最終選擇MOI=1.00作為慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的關(guān)鍵參 數(shù)。

2.2 不同溫育密度對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

溫育密度會(huì)影響細(xì)胞與慢病毒之間的接觸［19］，可能會(huì)進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，因此本研究選取不同的溫育密度對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同溫育密度對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示，各組抗CD30 CAR-T細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)第8天的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞存活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［轉(zhuǎn)導(dǎo)效率：（24.00±8.51）%、（25.50±7.87）%、（25.33±8.09）%和（24.50±7.58）%，P＞0.05；細(xì)胞存活率：（81.17±1.94）%、（83.50±2.07）%、（83.67±2.66）%和（80.83±3.49）%，P＞0.05，圖2A、2B］。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，不同溫育密度得到的抗CD30 CAR-T細(xì)胞之間的增殖情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖2C）；0.2×107組在第16天的抗CD30 CAR-T有效細(xì)胞數(shù)顯著低于0.5×107、1.0×107和2.0×107組（P＜0.05），但0.5×107、1.0×107、2.0×107組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2D）。

圖2 不同溫育密度對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.2 Effects of different incubation densities on transduction of anti-CD30 CAR-T

本實(shí)驗(yàn)還研究了不同溫育密度對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞毒性作用的影響，結(jié)果顯示，0.5×107、1.0×107組抗CD30 CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著高于2.0×107組［（46.00±1.41）%vs（45.00±1.41）%vs（35.50±2.12）%，P＜0.05，圖2E］。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、細(xì)胞存活率、抗CD30 CAR-T有效細(xì)胞數(shù)及體外殺傷效率等情況得出最佳溫育密度為0.5×107和1.0×107個(gè)/mL，從生產(chǎn)成本方面考慮，最終選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個(gè)/mL作為慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的關(guān)鍵參數(shù)。

2.3 不同活化時(shí)間對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

T細(xì)胞的激活水平與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率密切相關(guān)［21］。T細(xì)胞的激活狀態(tài)可以根據(jù)CD25和CD69的表達(dá)水平來(lái)衡量［22］，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化時(shí)間對(duì)CD25和CD69的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在加入人T cell TransAct刺激后，T細(xì)胞被激活（圖3A）。T細(xì)胞的持續(xù)激活會(huì)影響其存活率，結(jié)果顯示，持續(xù)刺激72 h后T細(xì)胞的活率低于80%，顯著低于其他組［（97.00±0.00）%、（95.67±1.53）%、（93.00±3.46）%、（90.33±3.06）%、（85.67±5.51）%和（77.00±5.57）%，P＜0.01，圖3B］。轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同活化時(shí)間對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響，結(jié)果顯示，24、48和72 h組抗CD30 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于0、8和16 h組［（35.00±5.15）%、（42.60±9.45）%、（41.20±8.64）%、（51.83±9.20）%、（56.50±7.87）%和（55.75±2.22）%，P＜0.05］，但24、48和72 h組間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（51.83±9.20）%、（56.50±7.87）%和（55.75±2.22）%，P＞ 0.05，圖3C］。

圖3 不同活化時(shí)間對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.3 Effects of different activation times on transduction of anti-CD30 CAR-T

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了不同活化時(shí)間對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞增殖情況的影響，結(jié)果顯示，在第11天時(shí)，48 h組的有效細(xì)胞數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）；但在第15天時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，圖3D）。因此，為了更加準(zhǔn)確地驗(yàn)證活化時(shí)間對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響，本研究分別選用活化時(shí)間為24和48 h進(jìn)行放大研究。

2.4 24和48 h活化時(shí)間對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的放大研究

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述研究結(jié)果，我們將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞起始量由0.5×107個(gè)提高到2.0×107個(gè)，培養(yǎng)容器從6孔板改為培養(yǎng)瓶，其他條件與上述一致。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)24和48 h活化后CD25和CD69的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，48 h組CD69陽(yáng)性細(xì)胞比例及其平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）均低于24 h組，48 h組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例略高于24 h，但CD25的MFI明顯升高，T細(xì)胞被激活（圖4A），此結(jié)果與2.3結(jié)果保持一致。有研究［23］顯示，T細(xì)胞大小也與其激活有關(guān)，因此本研究檢測(cè)了不同活化時(shí)間細(xì)胞大小的變化，結(jié)果顯示，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，T細(xì)胞逐漸變大，進(jìn)一步說(shuō)明T細(xì)胞被激活（圖4B）。轉(zhuǎn)導(dǎo)前細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，24和48 h組間的細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（81.33±1.15）%vs（82.67±3.51）%，P＞ 0.05，圖4C］。轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，結(jié)果顯示，24和48 h組間轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4D）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h組的增殖速率顯著高于24 h組（P＜0.01，圖4E）。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、細(xì)胞存活率及細(xì)胞增殖速率等情況，最終選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個(gè)/mL、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化48 h作為慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)工藝的最佳條件。

圖4 活化時(shí)間為24和48 h之間的比較Fig.4 Comparison of activation time between 24 and 48 h

2.5 轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度為轉(zhuǎn)導(dǎo)體積/底面積。T細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)迅速沉積在容器底部，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)體系頂部溶液中的慢病毒很難與沉積下來(lái)的T細(xì)胞接觸，進(jìn)而可能影響T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了驗(yàn)證上述猜想，分別采用0.16和0.53 mm兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度對(duì)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.16 mm組在第8天的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于0.53 mm組［（62.00±1.41）%vs（37.00±2.83）%，P＜0.01，圖5A］。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.16 mm組抗CD30 CAR-T細(xì)胞的增殖倍數(shù)顯著高于0.53 mm組（P＜0.05，圖5B）。

圖5 不同轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度對(duì)于抗CD30 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.5 Effects of different height on transduction of anti-CD30 CAR-T

本研究還分析了不同轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞毒作用的影響，結(jié)果顯示，在相同效靶比時(shí)，0.16和0.53 mm組對(duì)L428腫瘤細(xì)胞的殺傷作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［效靶比為25∶1時(shí)：（14.67±2.08）%vs（17.67±1.53）%，P＞ 0.05，圖5C］。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、增殖倍數(shù)、體外殺傷效率等情況，選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個(gè)/mL、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化48 h、轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度為0.16 mm作為最終轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)化條件。

3 討 論

CAR-T細(xì)胞療法是基于免疫細(xì)胞的療法之一［24］。由于T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性、體外培養(yǎng)增殖良好、病毒載體易轉(zhuǎn)導(dǎo)等特點(diǎn)［25］，CAR-T細(xì)胞現(xiàn)在已經(jīng)成為常見(jiàn)且有效的用于癌癥治療的基因修飾細(xì)胞［26］。慢病毒可以高效地將基因整合到靜止期和增殖期的真核細(xì)胞的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)［27］，臨床安全性也高于其他病毒［28］，由于上述原因，目前最成熟的CAR-T基因修飾方法是慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法［29］?？笴D30 CAR-T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)條件鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)MOI、溫育密度、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化時(shí)間和轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度等轉(zhuǎn)導(dǎo)條件進(jìn)行研究，優(yōu)化慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞時(shí)的參數(shù)，以制備出轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高、功能更強(qiáng)的抗CD30 CAR-T細(xì)胞，為抗CD30 CAR-T細(xì)胞后續(xù)的臨床研究提供參 考。

本研究結(jié)果顯示，MOI等于1、溫育密度為1.0×107個(gè)/mL、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化48 h、轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度為0.16 mm時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)得到的抗CD30 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高，增殖效果更好，但對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞的殺傷功能無(wú)影響。原代T細(xì)胞取材于不同健康人群外周血，因此原代T細(xì)胞間可能存在個(gè)體差異。MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)參數(shù)研究結(jié)果顯示，MOI大于1時(shí)，抗CD30 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率處于平臺(tái)期，可能其他靶點(diǎn)的慢病毒在進(jìn)行CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)該現(xiàn)象；轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化時(shí)間決定了T細(xì)胞的狀態(tài)，可能會(huì)影響T細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果和表觀遺傳修飾；T細(xì)胞的直徑只有8 ～ 10 μm，轉(zhuǎn)導(dǎo)體系過(guò)高導(dǎo)致上層慢病毒顆粒無(wú)法與T細(xì)胞接觸，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本研究將轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度作為慢病毒靜止轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究參數(shù)，同時(shí)也驗(yàn)證了我們的猜想：轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的高度趨近于T細(xì)胞的直徑時(shí)，可能會(huì)使慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不斷提高。本研究對(duì)不同轉(zhuǎn)導(dǎo)條件下的抗CD30 CAR-T細(xì)胞的分析評(píng)價(jià)指標(biāo)較少，可通過(guò)細(xì)胞表型、耗竭程度、表觀遺傳及細(xì)胞因子等［30-33］進(jìn)行進(jìn)一步研究，以提高抗CD30 CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)MOI、溫育密度、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化時(shí)間和轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度等轉(zhuǎn)導(dǎo)參數(shù)的研究，最終獲得了最優(yōu)的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件：MOI等于1、溫育密度為1.0×107個(gè)/mL、轉(zhuǎn)導(dǎo)前活化48 h、轉(zhuǎn)導(dǎo)體系高度為0.16 mm。這樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件可以顯著提高抗CD30 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，增強(qiáng)抗CD30 CAR-T細(xì)胞的增殖能力，且對(duì)抗CD30 CAR-T細(xì)胞的殺傷能力無(wú)顯著影響。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。