多囊卵巢綜合征患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)及其與胰島素抵抗指數(shù)的相關(guān)性

王亞妹，謝寶國

1 海南醫(yī)學(xué)院，?？?570102；2 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科；3 海南省臨床醫(yī)學(xué)中心；4 海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

多囊卵巢綜合征（PCOS）是導(dǎo)致育齡女性生殖內(nèi)分泌激素紊亂的最常見疾?。?］。研究［2］表明，PCOS患者外周循環(huán)中促炎細(xì)胞因子升高以及慢性炎癥反應(yīng)貫穿多個(gè)病理環(huán)節(jié)。胰島素抵抗（IR）是PCOS患者的主要特征之一，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）可通過改變脂肪細(xì)胞中的胰島素信號分子導(dǎo)致IR［3］。因此，炎癥細(xì)胞因子與IR的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。Toll樣受體4（TLR4）是TLRs家族中研究最多的受體，參與脂肪細(xì)胞IR和慢性炎癥反應(yīng)的過程，可誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致組織特異性效應(yīng)受損［5］。單核細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞，在PCOS慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。有資料顯示，PCOS患者體內(nèi)單核細(xì)胞數(shù)量增多，且單核細(xì)胞通過分泌TNF-α和IL-6等炎癥因子，不僅參與慢性炎癥，還可能導(dǎo)致IR和雄激素釋放增多。目前鑒于TLR4在PCOS患者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)研究極少。本研究觀察了PCOS患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)，并分析TLR4 mRNA與胰島素抵抗的關(guān)系，旨在探討TLR4在IR發(fā)病機(jī)制中的作用，嘗試以該因子為切入發(fā)現(xiàn)新的PCOS治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年11月—2021年11月收治的PCOS患者30例（觀察組），年齡25～35（27.2 ± 4.8）歲，BMI（25.4 ± 4.2）kg/m2。健康女性20例（對照組），年齡25～35（27.5 ± 4.3）歲，BMI（24.8 ± 4.5）kg/m2。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［6］診斷PCOS，其中至少滿足以下兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：稀發(fā)排卵或無排卵［＜8次/年的排卵且月經(jīng)周期超過35天，無月經(jīng)來潮6個(gè)月）、高雄激素血癥和（或）其臨床表現(xiàn)、超聲檢查提示卵巢多囊形態(tài)（單側(cè)或雙側(cè)卵巢中直徑為2～9 mm的卵泡≥12個(gè)，和（或）卵巢體積≥10 mL］；②無內(nèi)科合并癥。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①健康女性月經(jīng)周期規(guī)律（21～35 d）；②無多毛癥證據(jù)；③超聲檢查無多囊卵巢形態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有全身性疾?。ㄐ难芗膊『吞悄虿〉龋?；②高泌乳素血癥；③研究前用藥≤6個(gè)月（口服避孕藥、糖皮質(zhì)激素、排卵誘導(dǎo)藥物、雌激素或抗雄激素藥物等）；④造成高雄激素血癥的疾病，如腎上腺腫瘤等；⑤甲狀腺功能異常的疾病。本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得所有女性的書面知情同意書。

1.2 外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白檢測 ①單核細(xì)胞分離及鑒定：收集觀察組和對照組的血液樣品，將每個(gè)受試者5 mL靜脈血至EDTA抗凝管內(nèi)靜置，使用Ficoll-Paque plus密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞。以2000 g離心20 min后，收集細(xì)胞并加入適量含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色法檢測單核細(xì)胞存活率達(dá)90%以上。取一定體積的細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞CD14檢測鑒定單核細(xì)胞。②TLR4 mRNA檢測：采用熒光定量PCR法。使用TRIzol試劑盒提取單核細(xì)胞總RNA。提取完成后即采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法測定所提總RNA樣品完整性，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，測得OD 260/280吸收比＞1.8，可儲存于-80℃下備用。以細(xì)胞總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書構(gòu)建qRT-PCR反應(yīng)體系，置于ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)上完成反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下15 s，60 ℃下30 s，72 ℃下15 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。作為內(nèi)部對照，在相同的反應(yīng)條件下檢測β-actin mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。擴(kuò)增后，對形成的產(chǎn)物進(jìn)行解鏈曲線分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。③TLR4蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)印跡法。使用細(xì)胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物從外周血單核細(xì)胞中提取總蛋白。在4 ℃下以10000 g離心15 min后，按Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒說明書測定各組樣品蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。在室溫下，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗（10 min×3次），加入相應(yīng)蛋白一抗（稀釋比例1∶1000）4 ℃過夜孵育。次日取出后加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1∶2000）室溫孵育2 h，TBST清洗（10 min×3次）。免疫印跡化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。在Bio-Rad Quantity One上使用掃描密度測定條帶強(qiáng)度。

1.3 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）計(jì)算 計(jì)算HOMA-IR，HOMA-IR=空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，HOMA-IR≥2.5定義為IR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用Student t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較 外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較見表1。

表1 兩組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 兩組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對照組n 3020 TLR4 mRNA 1.36 ± 0.28*0.98 ± 0.14 TLR4蛋白1.40 ± 0.270.74 ± 0.15

2.2 兩組HOMA-IR比較 觀察組及對照組HOMA-IR分別為4.36 ± 2.12、1.69 ± 0.56，兩組比較，P＜0.05。

2.3 觀察組TLR4 mRNA表達(dá)與HOMA-IR的相關(guān)性 觀察組單核細(xì)胞中TLR4 mRNA表達(dá)與HOMAIR呈正相關(guān)（r=0.8454，P＜0.05）。

3 討論

PCOS是一種由多種遺傳和環(huán)境因素共同作用下嚴(yán)重危及女性健康的復(fù)雜疾病，是不孕癥的常見原因之一，影響著全球4%～20%的育齡女性［7］。PCOS患者卵巢較正常女性明顯增大2～5倍，以生殖內(nèi)分泌和血糖血脂代謝紊亂等為主要特征，如雄激素水平過高、LH升高、持續(xù)無排卵、糖耐量受損、高胰島素血癥、胰島素抵抗等［8］。IR是PCOS的顯著特征之一，也是備受關(guān)注的主要問題。臨床常用于評估胰島素敏感性/抵抗的測量工具是利用空腹血糖和空腹胰島素計(jì)算的HOMA-IR指數(shù)［9］。IR不僅直接影響PCOS女性生殖功能障礙，還導(dǎo)致代謝相關(guān)的并發(fā)癥如糖尿病、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加［10］。研究［11-12］顯示，超過60%的PCOS患者存在IR，其中糖耐量受損的發(fā)生率約為35%，2型糖尿病發(fā)生率約為10%。

人體內(nèi)炎癥反應(yīng)受許多轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控，反應(yīng)失控會造成大量炎癥細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子過度釋放損傷機(jī)體組織和器官，進(jìn)而產(chǎn)生一系列相關(guān)的慢性疾病［13］。PCOS被稱作是一種慢性低度炎癥狀態(tài)，又稱為代謝性炎癥，雖缺乏典型炎癥反應(yīng)的特征，但可通過相似的炎癥信號通路發(fā)揮作用［14］。有學(xué)者將這種慢性炎癥歸因于內(nèi)臟脂肪堆積或IR，當(dāng)機(jī)體存在大量游離脂肪酸，脂肪細(xì)胞會出現(xiàn)代償性增多，隨之增大的脂肪組織因缺氧或灌注不足導(dǎo)致細(xì)胞缺氧壞死，募集許多炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎因子引起炎癥反應(yīng)［15］。多項(xiàng)研究［4，16］表明，IL-6、IL-1β、C反應(yīng)蛋白（CRP）和TNF-α等炎癥反應(yīng)介質(zhì)與PCOS密切相關(guān)，PCOS患者血清TNF-α、IL-6和CRP表達(dá)量增高，顆粒細(xì)胞和卵泡液中IL-1β表達(dá)量增高。最新研究還發(fā)現(xiàn)，促炎因子IL-34在PCOS患者中表達(dá)水平升高，表達(dá)量與IR呈正相關(guān)。此外，HA等［17］發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清TNF-α與IR呈顯著正相關(guān)，通過治療IR可改善慢性低度炎癥狀態(tài)。

TLR4是天然免疫應(yīng)答中的主要受體，受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，可通過激活介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平升高。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是一種公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)促炎因子（如TNF-α和IL-1）的產(chǎn)生。QI等［18］發(fā)現(xiàn)，TLR4可通過激活NF-κB啟動細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致促炎因子轉(zhuǎn)錄水平升高，這與PCOS慢性炎癥狀態(tài)相關(guān)。TLR4表達(dá)與IR的發(fā)生密切相關(guān)，脂肪細(xì)胞中存在慢性炎癥反應(yīng)。PRASAD等［19］認(rèn)為，促炎因子TNF-α通過抑制胰島素信號通路、干擾葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)和改變脂肪因子水平等途徑導(dǎo)致IR發(fā)生。IR也會因高血糖而引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)，產(chǎn)生活性氧（ROS），ROS增加激活NF-kB信號通路，促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)釋放。此外飽和脂肪酸激活TLR4信號傳導(dǎo)進(jìn)而導(dǎo)致IR，IR也可能通過TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所造成。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)均明顯高于正常健康女性，這表明PCOS患者外周血單核細(xì)胞中TLR4呈高表達(dá)，提示TLR4介導(dǎo)的炎癥信號途徑在PCOS慢性炎癥的產(chǎn)生中發(fā)揮一定程度作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者TLR4 mRNA表達(dá)與HOMA-IR呈正相關(guān)，這表明PCOS患者出現(xiàn)IR與TLR4 mRNA相關(guān)，且TLR4 mRNA表達(dá)越高，胰島素抵抗越嚴(yán)重，進(jìn)而可能導(dǎo)致PCOS患者發(fā)生不良并發(fā)癥，如糖尿病、不孕癥、代謝綜合征、甚至癌癥等風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，通過干擾TLR4的表達(dá)可能為PCOS合并IR患者提供新的治療依據(jù)。

總之，發(fā)現(xiàn)TLR4在PCOS患者外周血單核細(xì)胞中高表達(dá)，且TLR4 mRNA表達(dá)與HOMA-IR呈正相關(guān)，證實(shí)TLR4的高表達(dá)與PCOS的慢性炎癥狀態(tài)及IR密切相關(guān)。由于過去PCOS的病因在很大程度上仍不明確，因此既沒有治愈方法，也缺乏基于機(jī)制的治療措施，導(dǎo)致管理患者不理想，只注重對癥治療。但是隨著現(xiàn)階段學(xué)者們對PCOS的發(fā)病機(jī)制越來越深入的了解，對于PCOS的治療理念也不再局限于單純的對癥處理，而是爭取從發(fā)病機(jī)制為切入點(diǎn)尋找更具特異性且有效性的治療靶點(diǎn)，為預(yù)防遠(yuǎn)期并發(fā)癥和減緩疾病的病情發(fā)展創(chuàng)造一定的可能性。本研究的這些發(fā)現(xiàn)提示TLR4可能是PCOS發(fā)病的潛在機(jī)制，干預(yù)TLR4的表達(dá)可能為PCOS的治療提供一個(gè)嶄新的視角。