一例羊皮下膿腫病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

彭艷伶，劉鳳尾，周可磊，唐國(guó)強(qiáng)，李 昊

（1.四川省涼山州西昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615050；2.四川省涼山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615050；3.西昌學(xué)院，四川 西昌 615050）

羊干酪性淋巴結(jié)炎（CLA）又被稱為山羊體表皮膚膿包病，主要是由葡萄球菌、偽結(jié)核棒狀桿菌和壞死桿菌等多種病原微生物感染導(dǎo)致［1-4］。該病通常發(fā)生于乳房、面頰和頸部等部位，病程一般持續(xù)幾周或數(shù)月，病原菌在感染處大量繁殖，產(chǎn)生的毒素會(huì)引起病羊發(fā)生毒血癥或敗血癥，甚至死亡［5-6］，同時(shí)影響哺乳期羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害較大［7-8］。本研究對(duì)一起山羊的皮膚膿包病進(jìn)行病原確診，以便針對(duì)性防治。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況和臨床癥狀 2022年6月，四川某羊場(chǎng)一周內(nèi)連續(xù)有多只羊發(fā)生皮下腫脹，患病羊的頜下、乳房、面頰和頸部等部位發(fā)生膿腫、潰瘍，觸動(dòng)有波動(dòng)感，局部體溫升高，用無菌注射器穿刺可見乳白色膿汁（圖1）。

圖1 發(fā)病羊群臨床癥狀

1.2 主要試劑 全基因組DNA 提取試劑盒，rTaq DNA聚合酶，DNA Marker DL 2000，革蘭氏染色液，血瓊脂平板，TSA瓊脂培養(yǎng)基和TSB肉湯培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 將無菌采集的2 份樣本分別接種于含有10%小牛血清的TSB 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)16～24 h，增菌后接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16～24 h。觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，挑取疑似單個(gè)菌落在血瓊脂平板上純化3次，革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，并對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA通用引物PCR鑒定。

1.4 基因組DNA 提取 吸取培養(yǎng)24 h 的菌液1 mL，經(jīng)12 000 r/min 離心2 min，棄上清液，后續(xù)步驟參照細(xì)菌全基因組DNA 提取試劑盒說明書操作，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)菌16S rDNA 擴(kuò)增及測(cè)序 使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.6 生化試驗(yàn) 將平板上純化的分離菌株接種于TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h 后，接種于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、非甘露醇試管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察主要生化特性。

1.7 藥敏試驗(yàn) 測(cè)定分離菌株對(duì)10類28種抗生素的敏感性，抗生素包括：β-內(nèi)酰胺類（青霉素、阿莫西林），頭孢菌素類（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮），氨基糖苷類（鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素），大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、麥迪霉素、克林霉素），多肽類（桿菌肽、多粘菌素B），四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素），喹諾酮類（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星），磺胺類（磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明），氯霉素類（氟苯尼考），林可酰胺類（克林霉素）。

1.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將測(cè)序獲得的序列登錄NCBI 網(wǎng)站，利用Blast 模塊進(jìn)行序列比對(duì)，利用Mega7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 將采集的2 份樣本接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂及10%綿羊血平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，僅發(fā)現(xiàn)兩種形態(tài)不一致的菌落，其中平板1 菌落為肉眼可見的白色，不透明，表面光滑，染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性菌（見圖2A和圖3A）；平板2菌落為肉眼可見的灰白色，光滑露珠樣，染色鏡檢為革蘭氏陰性菌，進(jìn)一步挑取單菌落進(jìn)行瑞氏染色，在顯微鏡下可以觀察到短桿菌（見圖2 B和圖3B）。

圖2 菌株在TSA固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

圖3 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 菌株的PCR和分子生物學(xué)鑒定 以菌株基因組DNA 為模板，利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小在1 500 bp左右，與預(yù)期相符（圖4）。將所得序列提交至NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1號(hào)分離菌株與金黃色葡萄球菌16S rDNA序列的相似度最高，2號(hào)分離菌株與溶血性曼氏桿菌16S rDNA 序列的相似度最高。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：1 號(hào)分離菌株與GenBank中公布的金黃色葡萄球菌的親緣關(guān)系最近；2 號(hào)分離菌株與GenBank 中公布的溶血性曼氏桿菌株的親緣關(guān)系最近（圖5）。

圖4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖5 分離菌株與參考菌株16S rDNA序列的進(jìn)化樹分析

2.3 生化試驗(yàn) 表1結(jié)果顯示：1號(hào)分離菌株對(duì)葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、甘露糖的生化反應(yīng)呈陽(yáng)性，而非甘露醇為陰性反應(yīng)；2號(hào)分離菌株對(duì)葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇的生化反應(yīng)呈陽(yáng)性，而非甘露醇、乳糖、甘露糖為陰性反應(yīng)。該試驗(yàn)每個(gè)反應(yīng)管做了3 次重復(fù)，結(jié)果一致。1 號(hào)分離菌株符合金黃色葡萄球菌的生化特性，2 號(hào)分離菌株符合溶血性曼氏桿菌的生化特性。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn) 表2結(jié)果顯示：兩株分離菌株均對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢塞吩、頭孢呋辛、慶大霉素、丁胺卡那、鏈霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、頭孢哌酮、麥迪霉素、氧氟沙星、卡那霉素等藥物敏感，而對(duì)青霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、桿菌肽、磺胺異惡唑等耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3 討論與結(jié)論

多種病原都可以導(dǎo)致羊皮下膿腫，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效的疫苗防治手段。加強(qiáng)生物安全措施，減少環(huán)境病原菌，對(duì)患病動(dòng)物早期精準(zhǔn)的診斷并及時(shí)針對(duì)性治療，是控制該病的主要措施。先前研究認(rèn)為只有偽結(jié)核棒狀桿菌可導(dǎo)致羊皮下膿腫，但近年來的研究表明，金黃色葡萄球菌等也是該病重要的病原菌，目前還沒有溶血性曼氏桿菌導(dǎo)致膿包病的報(bào)道。2018年，Roccaro等［8］從意大利某羊場(chǎng)暴發(fā)的綿羊膿包病病料中檢測(cè)到大量葡萄球菌。楊金柯等［9］研究表明山羊皮膚膿包病原中葡萄球菌屬占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（98.04%），說明葡萄球菌是引起羊膿包病的主要病原菌。溶血性曼氏桿菌屬于機(jī)會(huì)致病菌，可長(zhǎng)期寄生于反芻動(dòng)物以及其他動(dòng)物的上呼吸道［10］，主要引起肺炎、新生羔羊敗血癥、羊乳腺炎等，很少有研究報(bào)道溶血性曼氏桿菌可導(dǎo)致羊皮下膿腫［11-12］。

本研究從發(fā)病羊皮下膿腫組織樣本中分離出2 株細(xì)菌，經(jīng)綜合鑒定為金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌。兩株分離菌株對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類等多種抗菌藥物都較敏感，而對(duì)青霉素、多粘菌素B、桿菌肽等表現(xiàn)出耐藥性，這可能與菌株來源、畜種差異以及不同養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥習(xí)慣有關(guān)。感染養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果以及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，采取科學(xué)、有效的用藥方案，避免抗生素濫用。