GC-IMS結(jié)合多元統(tǒng)計分析不同酵母與營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒特征香氣的影響

饒文俊,李信,歐陽玲花,祝水蘭,周巾英

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江西 南昌,330200)

獼猴桃以其獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)深受消費者的青睞。我國獼猴桃的種植面積和產(chǎn)量均位居世界第一[1]。隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)由傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)種植模式向現(xiàn)代化種植模式轉(zhuǎn)型,其產(chǎn)量目前供大于求[2-3]。因此,加大獼猴桃精深加工產(chǎn)品的開發(fā)[4-5],對獼猴桃產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量快速發(fā)展具有很大的意義和前景。獼猴桃白酒作為獼猴桃精深加工產(chǎn)品之一,是獼猴桃經(jīng)酵母發(fā)酵后再進(jìn)行蒸餾而得到的水果白酒。香氣特性作為評價白酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,也可影響消費者的接受度和整體評價[6]。然而,目前關(guān)于獼猴桃酒的研究主要集中在釀造工藝優(yōu)化[7-8]、酵母篩選[9-10]等方面,但不同酵母對獼猴桃白酒香氣特性影響的報道較少。

氣相色譜-離子遷移光譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)結(jié)合了氣相色譜和遷移色譜的雙重優(yōu)勢,具有樣品制備簡單、分析時間短、靈敏度高等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于食品分析領(lǐng)域[11-13]。HE等[14]采用頂空氣相色譜-離子遷移譜(headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-IMS)對白酒蒸餾過程進(jìn)行了表征,3D指紋圖譜顯示了不同蒸餾階段揮發(fā)性化合物的變化。CHEN等[15]采用HS-GC-IMS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)來檢測白酒的年份。本文以獼猴桃為原料,5種不同商業(yè)酵母為發(fā)酵劑,釀造了獼猴桃白酒,并采用HS-GC-IMS檢測其揮發(fā)性香氣成分,通過主成分分析(principal component analysis,PCA)正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析手段探究了獼猴桃白酒香氣特性的差異,為獼猴桃白酒整體品質(zhì)及其香氣控制和提升提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

獼猴桃(市售),江西新西藍(lán)生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司獼猴桃種植基地。酵母:申聯(lián)發(fā)酵果酒曲(SLG),四川省申聯(lián)生物科技有限公司;諾盟B酵母La Bayanus (La-Ba)、諾盟F酵母La Fruitee (La-Fr),帝伯仕釀酒設(shè)備有限公司;安琪果酒酵母SY款(SY)、安琪果酒酵母RW款(RW),湖北安琪酵母有限公司;FN502發(fā)酵營養(yǎng)劑,湖北安琪酵母有限公司。

1.1.2 試劑

C4～C9直鏈酮(AR),Sigma - Aldrich貿(mào)易有限公司(上海)。

1.2 儀器與設(shè)備

EL3002型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;破碎機、304不銹鋼發(fā)酵罐20 L,東莞市釀哥機械設(shè)備有限公司、蒸餾器600 L,溫州國都輕工機械有限公司;FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀,MXT-WAX毛細(xì)管色譜柱(15 m×0.53 mm×1 μm),德國G.A.S公司;20 mL頂空進(jìn)樣瓶,上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃白酒制備

工藝流程:獼猴桃→篩選→清洗→破碎→加酵母→調(diào)糖(→加營養(yǎng)劑)→裝罐發(fā)酵→蒸餾→獼猴桃白酒

挑選一定質(zhì)量、無破損,成熟度為八九成的獼猴桃鮮果,經(jīng)清洗、破碎后待用。每1 kg獼猴桃加入0.25 g的商業(yè)酵母,使用前將酵母溶解在其質(zhì)量10倍的溫水糖中(35～40 ℃,含糖5%),攪拌均勻后,靜置20～30 min完成活化。隨后將活化好的酵母混入破碎的獼猴桃中,發(fā)酵24 h后加入獼猴桃質(zhì)量1/10的白糖,隨后繼續(xù)發(fā)酵15 d,發(fā)酵溫度不超過25 ℃。本試驗在發(fā)酵第2天按照實際獼猴桃的質(zhì)量加入營養(yǎng)劑,每1 000 kg獼猴桃加入營養(yǎng)劑200 g,攪拌均勻后繼續(xù)發(fā)酵,當(dāng)發(fā)酵液中還原糖含量低于2.5 g/L時終止發(fā)酵,過濾發(fā)酵液后蒸餾即得到本實驗的獼猴桃白酒樣品。

1.3.2 樣品處理

樣品以酵母名稱命名,其中SLG、La-Ba、SY、RW和La-Fr為添加營養(yǎng)劑發(fā)酵的樣品;SLG(-)和La-Ba(-)為未添加營養(yǎng)劑發(fā)酵的樣品。分別稱取1 g SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)、SY、RW、La-Fr樣品于20 mL頂空瓶中,60 ℃,轉(zhuǎn)速500 r/min孵育10 min后進(jìn)樣100 μL,進(jìn)樣溫度85 ℃,每組樣品取3次作為平行實驗。

1.3.3 GC-IMS測試獼猴桃白酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)

GC參數(shù):色譜柱MXT-WAX(15 m×0.53 mm×1 μm),柱溫60 ℃;載氣為高純N2(99.999%);載氣流速0～2 min內(nèi)保持2 mL/min,2～10 min內(nèi)線性增長為10 mL/min,10～20 min內(nèi)增長為100 mL/min,隨后以100 mL/min流速繼續(xù)保持20 min。

IMS參數(shù):β射線,氘源,正離子化模式;溫度45 ℃;漂移氣為高純N2(99.999%),流速為150 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用配套軟件GC × IMS Library Search(內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫、IMS數(shù)據(jù)庫)對化合物進(jìn)行定性分析;系統(tǒng)自帶Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異,Gallery Plot插件用于指紋圖譜對比;SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;Origin 2021繪圖;TBtools繪制熱圖與聚類熱圖;通過SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA、OPLS-DA分析,計算預(yù)測變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃白酒GC-IMS光譜對比分析

采用HS-GC-IMS對7組獼猴桃白酒香氣成分進(jìn)行分析,圖1為Reporter插件制作的二維俯視圖(圖1-a、圖1-b)和差異化譜圖(圖1-c、圖1-d)。在二維俯視圖中,遷移時間和反應(yīng)離子峰(RIP)均歸一化處理,反應(yīng)離子峰右側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物,顏色表示其濃度。由圖1-a和圖1-b可知,7種獼猴桃白酒揮發(fā)性成分相似度較高,大多數(shù)信號出現(xiàn)在保留時間200～750 s,漂移時間1.0～1.7 s的范圍內(nèi),這說明不同發(fā)酵條件下的獼猴桃白酒揮發(fā)性香氣成分組成相似。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr二維俯視譜圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)二維俯視譜圖;c-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr差異化譜圖;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)差異化譜圖

為了更好地比較不同酵母以及營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響,以SLG為參照譜圖,并將其與其他樣品的譜圖進(jìn)行比較,得到差異化譜圖(圖1-c、圖1-d)。圖1-c中不同酵母發(fā)酵條件下,SY和RW與SLG相比,揮發(fā)性物質(zhì)濃度較高,其次是La-Ba;La-Fr揮發(fā)性物質(zhì)濃度與SLG較為相似。圖1-d中,在未添加營養(yǎng)劑的條件下,SLG(-)的紅色面積高于SLG,La-Ba(-)與La-Ba也存在明顯差異。可以看出,不同獼猴桃白酒樣品之間的揮發(fā)性香氣化合物含量仍然存在差異,這反映在位置、數(shù)量和相應(yīng)的峰強度上。

2.2 揮發(fā)性香氣化合物的鑒定

為了更直觀地表現(xiàn)出不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律,借助Gallery Plot插件來繪制揮發(fā)性物質(zhì)的指紋譜圖。如圖2所示,在7組獼猴桃白酒樣品中,共檢測出45種信號峰,已定性出33種揮發(fā)性物質(zhì)(表1),其中包含酯類12種、醇類5種、酮類6種、醛類5種、呋喃類3種、其他類2種,未定性化合物12種。

表1 獼猴桃白酒揮發(fā)性物質(zhì)定性分析

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品指紋譜圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品指紋譜圖

從圖2中可以看出不同發(fā)酵條件下的獼猴桃白酒揮發(fā)性物質(zhì)含量存在明顯差異,在紅色區(qū)域A中,SLG樣品乙酸丙酯、2-丁醇、甲酸異戊酯、丁醛、甲乙酮、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品;而區(qū)域B中,SY和RW在糠醛、3-羥基-2-丁酮、乳酸乙酯、3-辛酮、丙醛、2-乙基呋喃、正丁醇、辛酸乙酯、2-正丁基呋喃的含量較高;La-Fr樣品則在區(qū)域C處的物質(zhì)含量高于其他樣品,如己酸乙酯。因此,酵母的種類對獼猴桃白酒特征香氣物質(zhì)有較大的影響。

此外,營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響如圖2-b所示,對于SLG酵母而言,營養(yǎng)劑的添加與否對樣品香氣影響程度較大,從圖2中明顯可以看出,SLG和SLG(-)兩組樣品在區(qū)域D、區(qū)域E中物質(zhì)含量具有較大差異,如區(qū)域D中的物質(zhì)主要為甲酸異戊酯、2-丁醇、2-甲基丙酸乙酯、丁醛、乙酸丙酯、己酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、甲乙酮、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯,以酯類物質(zhì)為主,這些物質(zhì)在SLG樣品中含量較多,說明SLG樣品相比于SLG(-)具有更濃郁的果香和花香。而在區(qū)域E中,未添加營養(yǎng)劑的樣品SLG(-)則含有更多的糠醛、乳酸乙酯、3-辛酮、正丁醇、環(huán)戊酮、異戊醛。對于La-Ba酵母而言,營養(yǎng)劑的影響并不明顯,但也存在一定的差異性,如F區(qū)域所示,未添加營養(yǎng)劑的樣品La-Ba(-)中3-羥基-2-丁酮、2-正丁基呋喃、2-乙基呋喃的含量大于La-Ba樣品。當(dāng)然,無論何種發(fā)酵條件,7組獼猴桃白酒中都含有大量的異戊醇和異丁醇(圖2黃色區(qū)域),這賦予了獼猴桃白酒水果香、甜香和醇香。

2.3 香氣化合物分析

圖3為獼猴桃白酒香氣化合物的相對含量柱狀圖(圖3-a)與熱圖(圖3-b)。從柱狀圖中可以發(fā)現(xiàn),7種獼猴桃白酒中醇類與酯類物質(zhì)為主要貢獻(xiàn)成分,能夠為獼猴桃白酒提供果香、花香與甜味[20-21]。SLG、La-Fr獼猴桃白酒中酯類物質(zhì)相對含量大于醇類物質(zhì),而La-Ba、SY、RW獼猴桃白酒其結(jié)果正好相反。此外,營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣物質(zhì)的影響也有差別。例如,在添加營養(yǎng)劑的情況下,SLG白酒樣品中酯類物質(zhì)相對含量大于醇類,而未添加營養(yǎng)劑時,SLG(-)樣品中醇類物質(zhì)相對含量卻遠(yuǎn)大于酯類物質(zhì)。但是,營養(yǎng)劑對酵母La-Ba似乎影響不大,無論添加與否,2種白酒樣品的醇類物質(zhì)含量均大于酯類物質(zhì),這與指紋譜圖中描述的結(jié)果相符。從熱圖(圖3-b)中可發(fā)現(xiàn),7種獼猴桃白酒中含量較多的酯類物質(zhì)為乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸乙酯,這些酯類物質(zhì)賦予獼猴桃白酒濃郁的果香與花香,醇類物質(zhì)主要為異戊醇和異丁醇,且與其他香氣物質(zhì)相比含量更高,另外丙酮、2-丁烯醛的含量也較高,共同構(gòu)建了獼猴桃白酒的風(fēng)味。

a-柱狀圖;b-熱圖

2.4 多元統(tǒng)計分析

2.4.1 獼猴桃白酒揮發(fā)性香氣PCA

基于獼猴桃白酒香氣物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,以揭示樣品間的規(guī)律性和差異性。首先,對變量為不同酵母的5組獼猴桃白酒樣品進(jìn)行分析,如圖4-a、圖4-b所示,在得分圖(圖4-a)中可以看出,PC1和PC2分別占總方差的44.8%和28.0%,前2個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)72.8%,這表明它們足以解釋數(shù)據(jù)中的總方差。其中SY、RW樣品位于第一象限,SLG、La-Fr、La-Ba樣品分別位于第二、三、四象限,說明5組樣品間香氣具有較大的差異,能夠很好地區(qū)分。此外,從載荷圖(圖4-b)中能夠發(fā)現(xiàn),位于第一象限的3-辛酮、3-羥基-2-丁酮、乳酸乙酯、2-乙基呋喃、2-丁基呋喃、正丁醇在SY和RW樣品中含量較高;而第二象限的2-丁醇、丁醛、甲酸異戊酯、乙酸丙酯則在SLG樣品中含量較高;同理,La-Fr樣品中富含異戊醇M、乙酸乙酯;而異戊醛、2-丁烯醛、異丁醇位于右下角,意味著La-Ba樣品中這3種香氣物質(zhì)含量較高。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品得分圖;b-載荷圖;c-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品得分圖;d-載荷圖

其次,研究營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響,在得分圖(圖4-c)中可以看出,營養(yǎng)劑的添加情況對樣品的香氣具有很大的影響,樣品之間有效區(qū)分,PC1和PC2累計貢獻(xiàn)率高達(dá)86.7%,結(jié)合載荷圖(圖4-d)可以發(fā)現(xiàn),未添加營養(yǎng)劑的樣品La-Ba(-)含有較多的2-正丁基呋喃、辛酸乙酯,SLG(-)樣品則富含異戊醛、異丁醇、丙酮、糠醛。綜上結(jié)果表明,不同的發(fā)酵條件導(dǎo)致了獼猴桃白酒香氣成分的顯著差異。

2.4.2 獼猴桃白酒揮發(fā)性香氣OPLS-DA

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法,能夠建立物質(zhì)表達(dá)量與樣本間關(guān)系模型,來實現(xiàn)對樣本類別的預(yù)測[22]。如圖5所示,根據(jù)7組獼猴桃白酒樣品揮發(fā)性香氣物質(zhì)建立OPLS-DA模型,其中圖5-a～圖5-c用于分析不同酵母對獼猴桃白酒香氣的影響,圖5-d～圖5-f用于分析營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響。如圖5-a所示,5組獼猴桃白酒樣品間均能有效區(qū)分,顯示了與PCA相同的結(jié)果,其中該模型累計貢獻(xiàn)率占85.7%,R2X=0.988,R2Y=0.997,Q2=0.992,當(dāng)R2和Q2處于0.5～1時,說明該模型有較好的預(yù)測能力[23],可以用于區(qū)分不同酵母發(fā)酵的獼猴桃白酒樣品。此外,還對模型進(jìn)行了置換檢驗(n=200),以評估判別模型是否對數(shù)據(jù)過度擬合,如圖5-b所示,左側(cè)的所有綠色R2值和藍(lán)色Q2值都低于右側(cè)的原始點,且Q2點的回歸線與垂直軸(左側(cè))截距為負(fù)數(shù),說明該模型沒有過度擬合,預(yù)測能力較好,能夠用于不同酵母對獼猴桃白酒香氣影響的判別分析。同樣,對SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)這4組樣品數(shù)據(jù)建立OPLS-DA模型,如圖5-d所示,4組樣品組內(nèi)重復(fù)性良好,組間具有明顯差異,前2個主成分累計貢獻(xiàn)率占95.1%,R2X=0.996,R2Y=0.998,Q2=0.997,模型穩(wěn)定性良好。從圖5-e可以發(fā)現(xiàn),Q2回歸線與縱坐標(biāo)軸的截距小于零,表示模型不存在過擬合,模型驗證有效,因此認(rèn)為該結(jié)果可用于研究發(fā)酵營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品得分圖;b-模型驗證;c-VIP值;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品得分圖;e-模型驗證;f-VIP值

此外,將33種揮發(fā)性物質(zhì)對獼猴桃白酒香氣的貢獻(xiàn)進(jìn)行VIP量化分析,在圖5-c紅色框中可以看出,以不同酵母發(fā)酵的獼猴桃白酒,VIP>1的特征化合物分別為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、二乙基酮、2-甲基丙酸乙酯;而在營養(yǎng)劑的影響下(圖5-f),有10種VIP>1的特征化合物,分別為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、正丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯、環(huán)戊酮、2-正丁基呋喃。為了使結(jié)果更具說服力,并使選定的關(guān)鍵香氣物質(zhì)更具代表性,將2個VIP值結(jié)果共同的化合物作為最終特征化合物,即乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯被鑒定為在不同發(fā)酵條件下有助于區(qū)分獼猴桃白酒樣品的香氣。

2.5 聚類熱圖分析

如圖6所示,為了更好地了解獼猴桃白酒樣品間的差異性和相似性,通過初步鑒定的7種特征香氣化合物對變量為不同酵母以及營養(yǎng)劑的獼猴桃白酒進(jìn)行聚類分析。在不同酵母發(fā)酵條件下(圖6-a),依據(jù)7種特征香氣化合物可將SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr白酒樣品大致分為兩大類,即樣品RW、La-Ba、SY和樣品SLG、La-Fr,該結(jié)果與PCA和OPLS-DA相同。同樣,對SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)4組白酒樣品進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖6-b所示,4組樣品可分成3類,與上述多元統(tǒng)計分析結(jié)果相符。因此,可初步認(rèn)為乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯為獼猴桃白酒特征香氣物質(zhì)。

a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr樣品聚類熱圖;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)樣品聚類熱圖

3 結(jié)論

為了探究不同酵母以及營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒香氣的影響,本實驗采用HS-GC-IMS并結(jié)合多元統(tǒng)計策略對其進(jìn)行分析。結(jié)果表明,不同發(fā)酵條件下獼猴桃白酒的香氣成分組成相似,但在含量上存在差異。GC-IMS共定性出33種揮發(fā)性香氣物質(zhì),其中酯類12種、醇類5種,7組獼猴桃白酒樣品均以酯類和醇類物質(zhì)為主。以不同酵母為變量條件下,SLG與La-Fr樣品中酯類物質(zhì)含量大于醇類物質(zhì),而La-Ba、SY、RW樣品則結(jié)果正好相反,說明發(fā)酵酵母能夠顯著影響獼猴桃白酒風(fēng)味。對比SLG與SLG(-)樣品的指紋譜圖,其在酯類與醇類物質(zhì)含量上存在明顯不同,而La-Ba與La-Ba(-)結(jié)果較為相似,這說明營養(yǎng)劑對不同酵母的作用程度不同,進(jìn)而改變獼猴桃白酒品質(zhì)。PCA與OPLS-DA結(jié)果表明,獼猴桃白酒樣品間存在顯著差異,根據(jù)VIP值>1,初步鑒定出了7種特征香氣物質(zhì):乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異丁醇、2-丁醇、乙酸異丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯,并用這7種特征香氣物質(zhì)對不同發(fā)酵條件下的獼猴桃白酒分別進(jìn)行聚類分析,結(jié)果與PCA和OPLS-DA一致,說明這7種香氣物質(zhì)能夠被初步鑒定為獼猴桃白酒的特征香氣物質(zhì),為探究酵母以及營養(yǎng)劑對獼猴桃白酒的香氣影響提供了理論參考。