普通擬桿菌調(diào)控高血壓小鼠小腸上皮細(xì)胞腺苷合成的機(jī)制探究

王一梁,張安坤,何冬旭

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

高血壓影響機(jī)體器官功能,是心血管疾病的主要可改變因素。據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)普通人群中高血壓患病率高,且患病率隨年齡增長(zhǎng)而穩(wěn)步上升[1]。高血壓發(fā)病誘因的多樣性決定了高血壓病理生理機(jī)制的復(fù)雜性。因此,深入辨析心血管健康維護(hù)和心血管疾病危險(xiǎn)因素、揭示相關(guān)通路與機(jī)制對(duì)開發(fā)新型降壓藥物及心血管疾病的預(yù)防和干預(yù)有重要意義?；趯?duì)高血壓機(jī)制及治療的研究基礎(chǔ),科學(xué)家們提出了將腎交感神經(jīng)去神經(jīng)支配術(shù)作為耐受性高血壓的一種新型治療方法[2]或?qū)①|(zhì)膜鈣ATPases作為治療原發(fā)性高血壓的潛在靶標(biāo)[3]。不過,由于近年來(lái)腸道微生物群與疾病相關(guān)性和因果關(guān)系研究的興起[4],已有研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)及其代謝物功能對(duì)于維持人體生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)心血管健康尤為重要[5]。它們可以通過影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、宿主微生物組和腸道細(xì)胞相關(guān)基因通路及各類第一信使代謝等方式,直接或間接地調(diào)控血管細(xì)胞及心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[6]。

有趣的是,長(zhǎng)期的高鹽飲食習(xí)慣,不僅直接與腸道代謝、內(nèi)環(huán)境息息相關(guān),也是我國(guó)民眾日常生活中最多見的高血壓引發(fā)因素之一[7],因此,從高鹽飲食引發(fā)的高血壓入手,研究腸道內(nèi)生菌影響心血管健康的機(jī)制,具有充分的科學(xué)合理性及可行性。在人類眾多腸道內(nèi)生菌種屬中,擬桿菌屬(Bacteroides)是健康人群中最豐富的優(yōu)勢(shì)菌屬。擬桿菌屬中的普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)對(duì)維持宿主腸道生態(tài)系統(tǒng)健康有重要作用,它可以減少血管斑塊,促進(jìn)血管健康[8]。腸道上皮屏障的生態(tài)失調(diào)可引起全身炎癥并破壞腸道機(jī)械傳導(dǎo)[6]。益生菌定殖在腸道后與腸道細(xì)胞相互影響,維護(hù)腸上皮屏障穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)小腸上皮細(xì)胞代謝物分泌并入血,進(jìn)而調(diào)控宿主健康[9-10],這提示我們B.vulgatus也可能促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞表達(dá)分泌某些物質(zhì)而進(jìn)入血液循環(huán)。由于這些代謝物在血液中是直接與血管腔接觸[11],即可直接影響血管功能,從而構(gòu)成腸道內(nèi)生菌影響心血管健康的機(jī)制。

因此,本研究從實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)穩(wěn)定造模的高鹽飲食誘導(dǎo)的小鼠高血壓模型入手[12],探討了小鼠腸道中B.vulgatus的穩(wěn)態(tài)與高血壓進(jìn)程的關(guān)聯(lián)及機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了B.vulgatus菌群定殖緩解了小鼠高血壓進(jìn)程[13],增加了血漿中抗高血壓物質(zhì)——腺苷[14]的含量。為探索腺苷的來(lái)源,我們繼而解析了B.vulgatus定殖后,該內(nèi)生菌與小腸上皮細(xì)胞的互作表達(dá)譜,以期探索B.vulgatus調(diào)控小腸上皮細(xì)胞腺苷合成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡C57BL/6J雄性小鼠,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作指南,實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),審批編號(hào)為JN.No20220615c0201230 [290]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

普通擬桿菌(Bacillusvulgatus),由本課題組從小鼠糞便中獲得,30%甘油重懸保存于-80 ℃冷庫(kù)中。

1.1.3 主要試劑

高鹽小鼠飼料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8% NaCl),南京特洛菲飼料科技有限公司;腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;膠原酶XI(C7657),美國(guó)Sigma公司;表皮生長(zhǎng)因子、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,PeproTech公司;DMEM-F12培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司;重組Anti-CD39抗體,Abcam公司;D-PBS,碧云天公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

BP-2010A智能無(wú)創(chuàng)血壓劑,北京軟隆生物技術(shù)有限公司;Sorvall WX 100+離心機(jī)、Forma Steri-Cycle i250細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Scientific公司;CM1950全自動(dòng)冷凍切片機(jī),德國(guó)Leica公司;LSM880倒置激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)Zeiss公司;Mini-PROTEANTetra垂直電泳儀、GellDoc Go全自動(dòng)凝膠成像儀,美國(guó)Bio-Rad公司;SCIENTZ-48高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;BSC-1004IIA2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 菌株活化和發(fā)酵液、灌胃菌懸液制備

挑取適量菌液,在BHI瓊脂平板上劃線活化2次(37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h)。挑取單菌落接種于含有1 g/L半胱氨酸鹽酸鹽、2 mg/L維生素K1、10 mg/L血晶質(zhì)的BHI液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃的厭氧工作站進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的發(fā)酵液,離心(4 ℃,8 000 r/min,10 min)收集菌泥,生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% NaCl,下同)重懸得到灌胃菌液(109CFU/mL);收集上清液過0.22 μm濾膜得到發(fā)酵液。

將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為安慰劑對(duì)照組(A組,n=8)和B.vulgatus灌胃組(B組,n=8)。A組給予生理鹽水安慰劑灌胃(0.9% NaCl,200 μL/只);B灌胃組給予菌液灌胃(109CFU/mL,200 μL/只), 以1 mL無(wú)菌注射器打入小鼠食道內(nèi)。2組灌胃期間均使用高鹽飼料飼養(yǎng),灌胃時(shí)間持續(xù)4周。

1.3 小鼠血壓檢測(cè)

在無(wú)人、溫暖的環(huán)境中對(duì)小鼠血壓進(jìn)行測(cè)量,避免環(huán)境問題引起小鼠血壓波動(dòng)。測(cè)量前連接好傳感器,設(shè)定溫度為39 ℃,感應(yīng)靈敏度為3,選擇中號(hào)鼠袋和鼠網(wǎng),將小鼠固定穩(wěn)妥并將加壓感應(yīng)器置于鼠尾根處開始測(cè)量,記錄數(shù)據(jù)以得知灌胃進(jìn)程中的血壓變化情況。

1.4 HPLC靶向檢測(cè)小鼠血漿腺苷

取小鼠全血裝入含有肝素鈉的抗凝管,上下顛倒5次,離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),上清液即為血漿。將上清液移至普通離心管中,-80 ℃超低溫保存。取小鼠血漿與甲醇按1∶3的體積比混合沉淀蛋白質(zhì)后,離心(4 ℃,14 000 r/min,10 min),收集上清液。取上清液于真空濃縮儀中蒸發(fā)干燥2 h,以等量20%的甲醇水溶液復(fù)溶后離心(4 ℃,14 000 r/min,5 min)。取上清液于0.22 μm濾膜過濾,濾液待測(cè)。

采用HPLC進(jìn)行血漿腺苷檢測(cè),HypersilTMODS C18反相色譜柱(125 mm×4.6 mm,5 μm)梯度洗脫。流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液(pH 9.0);流動(dòng)相B:V(甲酸)∶V(水)∶V(甲醇)=0.1∶9.9∶90(pH 9.0)。梯度洗脫程序設(shè)置如下:0～5 min:100%(A)0%(B);5～10 min:75%(A)25%(B);10～15 min:50%(A)50%(B);15～20 min:25%(A)75%(B);20～25 min:0%(A)100%(B);25～30 min保持5 min。流速1.0 mL/min。對(duì)色譜峰積分,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血漿腺苷含量變化情況。

1.5 小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法建立

小鼠CO2安樂死,取小腸,去掉周圍脂肪組織,放入含有細(xì)胞清洗液的小皿中。吸取細(xì)胞清洗液沖洗小腸內(nèi)容物,隨后移到新的細(xì)胞清洗液的小皿中,用剪刀縱切腸道,沖洗小腸內(nèi)壁至內(nèi)容物被完全洗凈。將小腸剪碎至約2 mm2,轉(zhuǎn)移至含細(xì)胞清洗液的離心管中,清洗,靜置,棄上清液,重復(fù)多遍至上清液澄清。轉(zhuǎn)移組織至含有消化液的10 mL離心管中,37 ℃振蕩消化5 min,靜置,棄上清液,重復(fù)3次。在剩余組織中加入消化液,37 ℃振蕩消化10 min,靜置,轉(zhuǎn)移上清至新的10 mL離心管,室溫270×g離心5 min,棄上清液,用完全培養(yǎng)基重懸,重復(fù)4次。收集細(xì)胞,70 μm濾膜過濾除菌3次后270×g室溫離心5 min,棄上清液,用完全培養(yǎng)基重懸種于六孔板中,隨后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后換液。

1.6 小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分離B.vulgatus處理前后的小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜測(cè)序(美吉生物公司)?；贗llumina NovaSeqTM6000測(cè)序平臺(tái),對(duì)所有mRNA進(jìn)行測(cè)序,采用Illumina TruSeqTMRNA sample prep Kit方法進(jìn)行基因文庫(kù)構(gòu)建。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,比較2個(gè)條件或多個(gè)條件下的基因表達(dá)差異,從中找出與條件相關(guān)的特異性基因,然后進(jìn)一步分析這些特異性基因的生物學(xué)意義。

1.7 免疫蛋白印跡法(Western Blot)驗(yàn)證小腸上皮細(xì)胞腺苷合成關(guān)鍵基因表達(dá)

1.7.1 細(xì)胞蛋白的提取

待六孔板內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到90%進(jìn)行細(xì)胞蛋白的提取。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基,D-PBS沖洗3次。配制細(xì)胞蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),每孔加入100 μL裂解液,移液槍輕輕吹打收集細(xì)胞,將收集到的細(xì)胞與裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,4 ℃層析柜旋轉(zhuǎn)裂解30 min。裂解完畢后,離心(4 ℃,12 000×g,15 min),上清液即為提取到的細(xì)胞蛋白,蛋白存于-80 ℃冰箱以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7.2 組織蛋白的提取

取實(shí)驗(yàn)小鼠小腸組織,研磨成組織勻漿,加入適量蛋白裂解液(每50～100 mg組織約加入1 mL裂解液),將組織勻漿與裂解液一同轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,4 ℃層析柜旋轉(zhuǎn)裂解30 min,離心(4 ℃,12 000×g,15 min),上清液即為提取到的組織蛋白,蛋白存于-80 ℃冰箱以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)

配制10%分離膠加入制膠板內(nèi),異丙醇封膠,待分離膠凝固后棄去異丙醇。配制5%濃縮膠加入制膠板內(nèi),放入梳子,待膠凝固后進(jìn)行后續(xù)操作。蛋白樣品中加入適量1×loading buffer,金屬浴(98 ℃,10 min)。在電泳槽內(nèi)外加入1×Running,拔出梳子,加入蛋白樣品。上層濃縮膠:恒壓70 V,30 min;下層分離膠:恒壓120 V,60 min。將5.5 cm×8.5 cm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜在甲醇溶液中浸泡2 min后取出。將轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)移至鋁制飯盒中,將海綿、濾紙、PVDF膜依次浸泡其中。切除濃縮膠以及多余部分,組裝好轉(zhuǎn)印夾板。轉(zhuǎn)膜條件為恒流330 mA,80 min,全程水浴。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將PVDF膜取出,置于5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉液中,水平搖床室溫封閉2 h。根據(jù)蛋白marker位置判斷并剪出所需條帶(CD39約75 kDa),將條帶置于一抗溶液中4 ℃孵育過夜。吸棄一抗,三乙醇胺緩沖鹽水溶液+吐溫-20(Tris buffered saline+Tween-20,TBST)清洗3次。TBST 溶液配制相應(yīng)二抗,室溫孵育2 h,孵育結(jié)束后,TBST清洗3次。配制ECL顯色液(A液與B液按1∶1比例避光配制),使用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影,以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件對(duì)其灰度值進(jìn)行定量分析。

1.8 小腸上皮細(xì)胞鑒定和CD39蛋白表達(dá)免疫熒光分析

1.8.1 組織冷凍切片

小鼠CO2安樂死,取3 cm小腸浸泡于4%多聚甲醛(paraformadehyole,PFA)中固定24 h。待組織沉入管底后取出,立刻浸泡于20%蔗糖溶液中,24 h后轉(zhuǎn)移至30 %蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水,24 h后將組織從30%蔗糖溶液中取出,浸泡于OCT膠中24 h。用錫紙做好包埋槽,加入一半OCT膠并置于-80 ℃冰箱凝固,待包埋槽內(nèi)OCT膠完全凝固,立刻將組織展平包埋其中,并用OCT膠覆蓋,放入-80 ℃冰箱凝固。隨后,使用全自動(dòng)冰凍切片機(jī),修平組織橫切面并切片。切片完成后置于60 ℃烘箱中烘片1 h,取出切片進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8.2 組織免疫熒光

取小腸切片,PBS清洗3次,洗凈OCT膠,用組化筆圈出小腸組織,在圈內(nèi)加入0.1% Triton X-100,室溫通透10 min,隨后加入5% BSA封閉液,室溫封閉30 min。加入一抗置于濕盒中4 ℃孵育過夜,實(shí)驗(yàn)所用一抗CD39配制比例為1∶200。吸棄一抗,PBS清洗3次,加入熒光二抗,室溫避光孵育2 h,實(shí)驗(yàn)所用二抗AF-568配置比例為1∶200。二抗孵育結(jié)束后,4′,6-二脒基-2苯基吲哚(4,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)室溫避光染色10 min,吸棄DAPI,PBS清洗多次。使用中性樹脂封片,蓋上蓋玻片,保證組織上沒有氣泡,避光保存,于倒置激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍攝。

1.8.3 細(xì)胞鑒定和免疫熒光

將細(xì)胞爬片置于24孔板中,明膠包被過夜,細(xì)胞種在24孔板中培養(yǎng)至穩(wěn)定,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到約80%密度后,去除培養(yǎng)基,PBS清洗,加入4% PFA溶液室溫固定30 min。吸去PFA,PBS清洗多次,加入0.1% Triton X-100和5% BSA混合液,室溫通透封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜,實(shí)驗(yàn)所用Anti-E-Cadherin和CD39配制比例分別為1∶250和1∶100。棄去一抗,PBS清洗多次,加入二抗,室溫避光孵育2 h,實(shí)驗(yàn)所用二抗AF-488稀釋比例為1∶200。棄去二抗,PBS清洗多次,加入DAPI,室溫避光孵育10 min,DAPI稀釋比例為1∶1 000。棄去DAPI,PBS清洗多次,將細(xì)胞爬片置于共聚焦小皿中,于倒置激光共聚焦下拍攝。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05;其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.vulgatus緩解小鼠高血壓進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)組以B.vulgatus對(duì)小鼠灌胃28 d,菌液濃度為109CFU/mL,生理鹽水重懸,灌胃劑量為200 μL/只;對(duì)照組以生理鹽水為安慰劑對(duì)小鼠灌胃28 d。灌胃組和對(duì)照組同時(shí)飼喂高鹽飼料。在此期間,我們對(duì)小鼠血壓以智能無(wú)創(chuàng)血壓儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由圖1可知,在灌胃第14天,高鹽飲食對(duì)照組小鼠出現(xiàn)了血壓升高,但是接受了B.vulgatus灌胃的小鼠,血壓呈現(xiàn)出降低趨勢(shì),第21天與對(duì)照組呈現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此,結(jié)果提示B.vulgatus可以緩解小鼠高血壓進(jìn)程。

a-收縮壓變化圖(0～28 d);b-舒張壓變化圖(0～28 d)

2.2 B.vulgatus增加小鼠血漿腺苷含量

前期研究中,對(duì)B.vulgatus定殖前后的高血壓小鼠進(jìn)行了血漿代謝譜學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)腺苷為B.vulgatus定殖前后的顯著差異代謝物。然而,該部分研究并沒有對(duì)代謝譜學(xué)、包括腺苷含量的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,也沒有對(duì)腺苷產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行探討。由此出發(fā),利用HPLC法,驗(yàn)證了如上腺苷含量的變化,結(jié)果如圖2所示,由于血漿中含有多種核苷酸、嘌呤類物質(zhì),所以我們通過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),確定了腺苷的出峰位置?？梢钥吹?在小鼠灌胃B.vulgatus后,小鼠血漿中的腺苷含量顯著升高。為了探究血漿中腺苷變化的來(lái)源,利用HPLC法檢測(cè)了普通擬桿菌發(fā)酵上清液中的腺苷含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃后腺苷含量的增高不是由普通擬桿菌分泌引起的。

a-HPLC峰面積圖;b-小鼠血漿腺苷含量

2.3 小腸上皮細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序

小腸上皮細(xì)胞為機(jī)體腺苷產(chǎn)生的主要場(chǎng)所之一[15]。因此,我們推斷血漿中增加的腺苷有一部分可能來(lái)源于B.vulgatus與腸道細(xì)胞互作產(chǎn)生,并經(jīng)腸道微血管入血循環(huán)[9-10]。為了深入解析小腸上皮細(xì)胞在與B.vulgatus互作的過程中,涉及哪些與腺苷合成和核苷酸代謝相關(guān)的通路,將B.vulgatus培養(yǎng)前后的小腸上皮細(xì)胞的mRNA進(jìn)行了測(cè)序(P為對(duì)照組、K為B.vulgatus灌胃組,各n=3)。6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組分析共獲得40.44 Gb的Clean Data,各樣品Clean Data均達(dá)到 5.99 Gb以上,Q30堿基百分比在94.12%以上(圖3-a～圖3-c)。隨后,分別將各樣品的Clean Reads與小鼠參考基因組(Mus_musculus;GRCm39)進(jìn)行序列比對(duì),比對(duì)率為97.13%～97.74%,共檢測(cè)到26 066個(gè)表達(dá)基因,其中已知基因25 494個(gè),新基因572個(gè);表達(dá)轉(zhuǎn)錄本共86 087個(gè),其中已知轉(zhuǎn)錄本75 333個(gè),新轉(zhuǎn)錄本10 754個(gè)。

a-堿基含量分布;b-測(cè)序飽和度曲線;c-差異基因表達(dá)量分布分析;d-差異基因表達(dá)量火山圖分析;e-差異基因表達(dá)聚類熱圖分析;f-差異基因GO注釋分析;g-差異基因KEGG注釋分析;h-差異基因Reactome注釋分析

隨后,將B.vulgatus灌胃鼠及對(duì)照鼠小腸上皮細(xì)胞的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),利用DESeq2軟件進(jìn)行組間差異基因分析,獲得兩組間發(fā)生差異表達(dá)的基因(|log2Fold Change|>=1;P<0.05),共發(fā)現(xiàn)287個(gè)顯著上調(diào)基因,215個(gè)顯著下調(diào)基因(圖3-d),差異基因熱圖如圖3-e所示。

對(duì)這些基因進(jìn)行GO分析。在生物過程方面,差異基因在細(xì)胞代謝、生物合成、分子應(yīng)答(biological regulation,metabolic process,response to stimulus,cellular component organization or biogenesis)等方面顯著富集。在細(xì)胞成分方面,差異基因在細(xì)胞表面和細(xì)胞器中等部位(organelle, membrane)顯著富集。在分子功能方面,差異基因顯著富集于細(xì)胞結(jié)合和催化等過程(catalytic activity,binding)。更詳細(xì)的GO富集分析結(jié)果如圖3-f所示。同時(shí),對(duì)差異基因進(jìn)行了KEGG通路分析(圖3-g),發(fā)現(xiàn)在KEGG代謝過程中,脂肪代謝(fat metabolism)、能量代謝(energy metabolism)、輔酶(coenzyme metabolism)及維生素代謝(vitamin metabolism)等過程都顯著富集。與之對(duì)應(yīng)的,在Reactome通路分析中,細(xì)胞內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)(protein)、核苷酸(ribotide)等物質(zhì)的代謝通路發(fā)生了顯著改變(圖3-h)?？傊?通過對(duì)上述差異基因功能富集結(jié)果提示,B.vulgatus灌胃后,小鼠小腸上皮細(xì)胞的代謝相關(guān)通路的改變?yōu)橹匾腥朦c(diǎn)。

2.4 小腸上皮細(xì)胞腺苷合成關(guān)鍵基因表達(dá)驗(yàn)證

由于本研究主要關(guān)注腺苷的合成過程,對(duì)上述差異基因富集的核苷酸代謝、能量代謝通路中涉及的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腺苷合成中幾個(gè)關(guān)鍵基因,包括Adcy9,Prps1l3,Adarb2,Entpd1表達(dá)都發(fā)生了上調(diào)。其中,與腺苷合成直接相關(guān)的Adcy9(腺苷酸環(huán)化酶9,adenylyl cyclase 9)能夠促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生cAMP,cAMP調(diào)節(jié)Entpd1產(chǎn)物CD39生成,繼而促進(jìn)腺苷合成[16]。為了驗(yàn)證該通路,我們通過Western Blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別從細(xì)胞層面(圖4-a～圖4-c)和組織層面(圖4-d～圖4-g)對(duì)通路中的最后一步——CD39的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)B.vulgatus灌胃鼠的CD39表達(dá)顯著增加,提示小腸上皮細(xì)胞的腺苷合成被激活。

a-Western Blot驗(yàn)證CD39在正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)量的變化;b-正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸上皮細(xì)胞CD39平均灰度統(tǒng)計(jì)圖;c-小腸上皮細(xì)胞CD39的免疫熒光表達(dá);d- Western Blot驗(yàn)證CD39在正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸組織中表達(dá)量的變化;e-正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸組織CD39平均灰度統(tǒng)計(jì)圖;f-正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸組織CD39免疫熒光表達(dá);g-正常、高血壓、高血壓灌菌小鼠小腸組織CD39的平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖

2.5 小腸上皮細(xì)胞腺苷合成與血漿腺苷含量相關(guān)性分析

基于HPLC檢測(cè)血漿腺苷含量及Western Blot驗(yàn)證CD39表達(dá)量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們對(duì)小鼠血漿腺苷含量與小腸上皮細(xì)胞CD39表達(dá)量做了皮爾遜相關(guān)性分析,血漿腺苷含量與小腸上皮細(xì)胞CD39表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)(圖5)。

圖5 小腸上皮細(xì)胞腺苷合成與血漿腺苷含量相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

在過去的十年里,出現(xiàn)了大量證據(jù)支持腸道內(nèi)生菌群在調(diào)節(jié)血壓方面的作用。擬桿菌屬作為健康腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬,對(duì)它的研究較為廣泛。YOSHIDA等[8]在報(bào)道中稱,B.vulgatus及其衍生的代謝物可以調(diào)控腸道脂多糖產(chǎn)生而維護(hù)血管穩(wěn)態(tài)。不過,上述研究中普通擬桿菌與血壓的明確關(guān)聯(lián)和作用機(jī)制都沒有完全闡明。本研究構(gòu)建了高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型,發(fā)現(xiàn)了B.vulgatus可以調(diào)節(jié)小鼠高血壓進(jìn)程,證實(shí)了該過程伴隨著血漿中腺苷含量的增加和小腸上皮細(xì)胞腺苷合成通路的激活,且二者存在顯著的相關(guān)性(圖6)。

圖6 B.vulgatus調(diào)控高血壓小鼠小腸上皮細(xì)胞腺苷合成的機(jī)制

由于我們發(fā)現(xiàn)了B.vulgatus定殖可升高血漿腺苷的含量,且小腸為腺苷的主要合成場(chǎng)所之一,因此推斷血漿中增加的腺苷有一部分可能來(lái)源于B.vulgatus與腸道細(xì)胞互作,產(chǎn)生的腺苷隨后經(jīng)腸道微血管入血循環(huán)。目前,已有研究證實(shí)腺苷合成及作用的通路較為復(fù)雜。在細(xì)胞中,腺苷可以通過ATP和AMP的去磷酸化、甲硫氨酸循環(huán)、腎上腺素刺激等通路合成[17];腺苷隨后與A1R、A2AR、A2BR和 A3R 4種腺苷受體結(jié)合[18],調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、血管生成等多種重要的細(xì)胞生理病理功能[14],其參與的通路也可以引起機(jī)體血管舒張從而緩解高血壓[19]。然而,尚不明晰B.vulgatus是通過怎樣的通路促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生腺苷的。因此,為深入解析小腸上皮細(xì)胞在與B.vulgatus互作的過程中,涉及哪些腺苷合成相關(guān)、核苷酸代謝相關(guān)的通路,將B.vulgatus培養(yǎng)前后的小腸上皮細(xì)胞的mRNA進(jìn)行了測(cè)序,以便從中篩選到本系統(tǒng)中參與腺苷合成的關(guān)鍵通路,并進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。以此,我們發(fā)現(xiàn)B.vulgatus顯著改變了小腸上皮細(xì)胞表達(dá)譜,影響其代謝過程,其中就包括了小腸上皮細(xì)胞上與腺苷合成相關(guān)的關(guān)鍵酶CD39[20]。這里需要指出的是,因?yàn)楸狙芯筷P(guān)注的是腺苷合成通路,所以在諸多顯著變化的代謝通路中我們著重對(duì)腺苷生成相關(guān)通路進(jìn)行了解析及驗(yàn)證。但是,在數(shù)據(jù)分析的過程中我們還發(fā)現(xiàn)了諸如蛋白質(zhì)、核苷酸、能量物質(zhì)等代謝過程也發(fā)生了顯著改變,值得在未來(lái)研究中繼續(xù)深入探索。

需要指出的是,本研究在轉(zhuǎn)錄組學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),采取了高血壓小鼠小腸上皮細(xì)胞合并培養(yǎng)基孵育與高血壓小鼠小腸上皮細(xì)胞合并菌液孵育的組間比較方案,篩選出了一些在2組小腸上皮細(xì)胞中差異表達(dá)的基因,沒有設(shè)置正常小鼠小腸上皮細(xì)胞對(duì)照。但后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證候選蛋白質(zhì)時(shí)均設(shè)置了正常小鼠小腸上皮細(xì)胞對(duì)照數(shù)據(jù),確保了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和合理性。

總之,本研究揭示了B.vulgatus促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞合成腺苷的通路,闡述了B.vulgatus緩解高血壓的機(jī)制?；谛∧c上皮細(xì)胞為機(jī)體腺苷產(chǎn)生的主要場(chǎng)所之一,此處生成的腺苷很有可能經(jīng)腸道微血管入血循環(huán)。因此,在未來(lái)的工作中將繼續(xù)探索腺苷合成后是如何進(jìn)入血液循環(huán)從而發(fā)揮作用的,對(duì)于闡明普通擬桿菌調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)的完整機(jī)制,具有重要意義。