山桃雜交群體抗蚜優(yōu)系的背景選擇與標(biāo)記優(yōu)劣比較

劉蘇寧，別航靈，王君秀，陳雪嘉，王新衛(wèi),2，王力榮,2，曹珂

山桃雜交群體抗蚜優(yōu)系的背景選擇與標(biāo)記優(yōu)劣比較

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心，新疆昌吉 831100

【目的】篩選‘橡皮油桃’（果實(shí)大、感蚜）ב帚形山桃’（果實(shí)小、抗蚜）F2代雜交群體中，‘橡皮油桃’遺傳背景回復(fù)率高且表現(xiàn)抗蚜的優(yōu)系，探討桃背景選擇技術(shù)體系的建立方法?！痉椒ā渴紫?，利用3種方法選擇背景標(biāo)記，分別為前期研究得到的高多態(tài)性SNP（Pre-work SNP）、全基因組范圍內(nèi)隨機(jī)挑選的SNP（Random SNP）、以及對(duì)SNP進(jìn)行功能注釋后，選擇突變位點(diǎn)影響起始密碼子與終止密碼子的功能性SNP（Functional SNP），3種方法最終篩選的SNP個(gè)數(shù)統(tǒng)一設(shè)定為775個(gè)。然后，利用這775個(gè)SNP分別計(jì)算3種不同背景標(biāo)記在F2代雜交群體中121個(gè)單株的雙親回復(fù)率。通過比較3種背景標(biāo)記中‘橡皮油桃’背景回復(fù)率較高的前10個(gè)單株在兩兩之間的重復(fù)情況，比較不同背景標(biāo)記的重復(fù)性。在完成F2群體單株的抗蚜性、單果重與可溶性固形物含量評(píng)價(jià)后，分別選擇單果重與可溶性固形物含量2種性狀的極端表型單株各10株，通過比較兩類表型單株‘橡皮油桃’回復(fù)率的差異顯著性，衡量不同選擇方法的優(yōu)劣。最后，以抗蚜定位區(qū)間內(nèi)的SNP為抗蚜前景標(biāo)記，篩選F2群體內(nèi)‘橡皮油桃’遺傳背景回復(fù)率高且表現(xiàn)抗蚜的優(yōu)系?！窘Y(jié)果】Pre-work SNP、Random SNP、Functional SNP 3種背景標(biāo)記的F2代單株‘橡皮油桃’背景回復(fù)率分別在36.34%—71.99%、31.75%—74.92%、4.51%—66.53%。3種背景標(biāo)記篩選的‘橡皮油桃’回復(fù)率較高的前10株中，Pre-work SNP與Random SNP和Functional SNP的重復(fù)單株分別均有2個(gè)，Random SNP與Functional SNP的重復(fù)單株有6個(gè)，即Random SNP和Functional SNP兩種選擇方法的重復(fù)率更高。Pre-work SNP、Random SNP、Functional SNP 3種背景標(biāo)記在以單果重為選擇目標(biāo)時(shí)，極端表型單株間‘橡皮油桃’背景回復(fù)率顯著性分別為0.069、0.26和0.092，即Pre-work SNP篩選的后代‘橡皮油桃’背景回復(fù)率與單果重表型相關(guān)性最高，F(xiàn)unctional SNP次之，Random SNP差異不顯著。在以可溶性固形物含量為選擇目標(biāo)時(shí)，極端表型單株間‘橡皮油桃’背景回復(fù)率顯著性分別為0.77、0.65和0.31，3種背景標(biāo)記差異均不顯著?；赑re-work SNP和Functional SNP的計(jì)算結(jié)果，本研究篩選出2個(gè)‘橡皮油桃’回復(fù)率高的單株，分別為N20和N36，其中N20攜帶抗蚜標(biāo)記，單株表現(xiàn)抗蚜，平均單果重為34.42 g，可溶性固形物含量為16.1%，為山桃F2群體的優(yōu)異單株。【結(jié)論】在本研究群體內(nèi)，Pre-work SNP相較于Functional SNP與Random SNP，在單果重這一表型上與‘橡皮油桃’回復(fù)率的相關(guān)性較強(qiáng)，印證該背景標(biāo)記選擇方式的優(yōu)異性，以這種背景標(biāo)記挑選出的單株N20在目標(biāo)性狀的優(yōu)異表現(xiàn)也支持這一結(jié)果。本研究提供一種背景選擇的思路以及判斷不同背景標(biāo)記在研究群體內(nèi)優(yōu)劣性的方法，可為有效提高抗性育種效率提供參考。

桃；抗蚜性；SNP；前景選擇；背景選擇

0 引言

【研究意義】桃蚜（Sulzer）繁殖能力極強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)即可形成龐大的種群數(shù)量，是桃樹生產(chǎn)上的主要害蟲[1]。近年來，殺蟲劑的大量使用使桃蚜產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治難度增加[2-4]，抗性資源的發(fā)掘利用是控制蟲害更為經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)保的方法[5]。但由于果樹生育周期較長(zhǎng)，通過常規(guī)育種獲得優(yōu)良品種至少需要10—15年，且常規(guī)育種存在目標(biāo)性狀選擇效率低、背景回復(fù)速度慢等問題[6]，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為果樹抗性育種提供了更為高效的方法[7]。分子標(biāo)記輔助選擇主要包括對(duì)目標(biāo)性狀的前景選擇和對(duì)遺傳材料的背景選擇兩部分[8]，前景選擇確保目的基因在后續(xù)雜交或者回交過程中能夠逐代傳遞下去，而背景選擇則保證子代在具備目標(biāo)性狀的前提下，更快地回復(fù)到優(yōu)良親本的遺傳背景[9]。本研究利用3種不同的方法選擇背景標(biāo)記，通過比較不同背景標(biāo)記與育種目標(biāo)性狀表型結(jié)果的一致性來衡量不同選擇方式的優(yōu)劣，為抗桃蚜新品種培育奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，常規(guī)育種輔助分子標(biāo)記以加速育種進(jìn)程，在農(nóng)作物與園藝作物的抗性育種或品種改良工作中廣泛應(yīng)用，Rai等[10]利用173個(gè)SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記，對(duì)前景選擇得到的BC1F1單株進(jìn)行背景選擇以轉(zhuǎn)移，培養(yǎng)軟粒小麥品種。趙雅楠[11]在無核抗寒葡萄胚挽救育種工作中，選用無核標(biāo)記GSLP-569對(duì)雜種株系進(jìn)行早期的無核性狀輔助選擇，同時(shí)利用抗寒標(biāo)記S241-717進(jìn)行早期抗寒性狀的輔助選擇。而在桃背景選擇標(biāo)記以及抗蚜前景標(biāo)記的開發(fā)上，GUAN等[12]借助二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)工具，在360個(gè)普通桃品種中共鑒定了16 658 391個(gè)SNP（single nucleotide polymorphism），通過生物信息學(xué)分析得到775個(gè)分布于桃全基因組的、高質(zhì)量的、多態(tài)性高的SNP，可以用于背景選擇。王力榮等[13]以‘橡皮油桃’ב帚形山桃’雜交后代F2群體為材料，對(duì)抗蚜性狀進(jìn)行集群分離分析（BSA），進(jìn)而采用35個(gè)InDel（insertion- deletion）進(jìn)行加密，將抗性位點(diǎn)定位到950 kb的區(qū)間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以抗蚜定位區(qū)間內(nèi)的SNP位點(diǎn)作為前景標(biāo)記，而在背景標(biāo)記的篩選上，除前期研究的775個(gè)SNP位點(diǎn)外[12]，另外在染色體上隨機(jī)選擇775個(gè)SNP位點(diǎn)，以及選擇影響起始密碼子和終止密碼子功能的775個(gè)SNP位點(diǎn)，利用這3種方式選擇背景標(biāo)記，計(jì)算F2代單株背景回復(fù)率并比較不同背景標(biāo)記與表型結(jié)果的一致性。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以一個(gè)將桃野生近緣種的抗蚜性位點(diǎn)漸滲入普通桃的雜交群體為試材，比較桃背景標(biāo)記的篩選方法，在篩選母本‘橡皮油桃’背景回復(fù)率高、攜帶抗蚜位點(diǎn)優(yōu)系的同時(shí)，探索桃分子育種技術(shù)體系建立的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于本研究的F2群體單株數(shù)為121株，其母本為‘橡皮油桃’（果實(shí)大、感桃蚜），父本為‘帚形山桃’（果實(shí)小、抗桃蚜）。群體定植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所新鄉(xiāng)實(shí)驗(yàn)基地，栽培管理?xiàng)l件一致。

1.2 表型分析

本試驗(yàn)共評(píng)價(jià)3種表型，分別為抗蚜性、單果重與可溶性固形物含量。

4月下旬，在果園中出現(xiàn)蚜蟲時(shí)，收集果園中的無翅蚜蟲，接種到溫室大棚育苗缽中的山桃雜交后代實(shí)生苗上，每株實(shí)生苗的新梢上接種蚜蟲100頭左右，1周后調(diào)查單株抗性，依據(jù)卷葉程度對(duì)每個(gè)單株單獨(dú)進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考王力榮等[14]并略作改動(dòng)。1級(jí)：未發(fā)現(xiàn)蚜蟲；2級(jí)：為害較輕或少量卷葉；3級(jí)：為害較重，卷葉數(shù)量超過新梢葉量的50%。

在果實(shí)成熟期摘取10—20個(gè)桃果實(shí)，電子秤稱總質(zhì)量后計(jì)算平均單果重。依據(jù)桃種質(zhì)資源描述規(guī)范[15]將單果重分成5級(jí)的方法，在本群體中，極?。海?0.0 g；?。?0.0 g—20.0 g；中：20.0 g—30.0 g；大：30.0 g—40.0 g；極大：≥40.0 g。平均單果重精確到0.1 g。

稱量平均單果重后，取桃子果肉擠出桃汁，糖度計(jì)測(cè)定可溶性固形物（SSC）含量。同樣地，依據(jù)桃種質(zhì)資源描述規(guī)范[15]，將可溶性固形物含量分為5級(jí)，極低：＜8.0%；低：8.0%—10.0%；中：10.0%—12.0%；高：12.0%—14.0%；極高：≥14.0%?？扇苄怨绦挝锖烤_到0.1%。

對(duì)群體單株完成表型評(píng)價(jià)后，依據(jù)群體內(nèi)表型分布情況，分別選取各性狀的極端差異表型單株做后續(xù)分析。

1.3 山桃雜交群體基因組重測(cè)序和SNP鑒定

取F2代單株幼嫩葉片置于液氮中研磨，提取葉片基因組總DNA，植物基因組DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，基因組重測(cè)序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京，中國(guó)）有限公司完成，對(duì)121個(gè)單株及親本DNA樣品構(gòu)建測(cè)序文庫，文庫質(zhì)檢合格后，使用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為150 bp。獲得的原始數(shù)據(jù)（raw data）去除接頭序列并進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控后得到過濾后數(shù)據(jù)（clean data），有效測(cè)序數(shù)據(jù)利用BWA軟件[16-17]，比對(duì)到桃Lovell基因組[18]（Lovell_Prunus_persica_ v2.0.a1）以產(chǎn)生SAM文件，SAM文件經(jīng)SAMTOOLS[19]轉(zhuǎn)換格式為BAM文件后繼續(xù)進(jìn)行質(zhì)控，使用GATK[20]軟件進(jìn)行SNP的檢測(cè)，從變異文件中提取SNP變異后，對(duì)SNP進(jìn)行缺失率和等位基因頻率（MAF）的過濾，得到最終的SNP變異信息。其中，SNP過濾條件為：QUAL＜40，QD＜2.0，MQ＜40.0，F(xiàn)S＞60.0，SOR＞3.0，MQRankSum ＜-12.5，ReadPosRankSum ＜-8.0。

1.4 抗蚜前景標(biāo)記的選擇

筆者實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)群體單株進(jìn)行抗蚜性鑒定，依據(jù)抗性分級(jí)結(jié)果進(jìn)行基因定位，鑒定的抗蚜區(qū)間為3號(hào)染色體上物理距離為950 kb的區(qū)間內(nèi)，物理位置為Chr3：24570169—Chr3：25524683，在抗蚜區(qū)間內(nèi)選擇與連鎖信號(hào)最強(qiáng)的標(biāo)記距離最近的SNP，作為本研究的前景標(biāo)記。

1.5 抗蚜背景標(biāo)記的選擇

采用3種不同的方法挑選抗蚜背景標(biāo)記，首先，在前期研究中，借助二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)工具，在360個(gè)普通桃品種中共鑒定了16 658 391個(gè)SNP，過濾MAF＜0.05，測(cè)序深度小于10×，質(zhì)量評(píng)分小于1 000，π＜0.48，等位基因數(shù)大于2的SNP后，得到775個(gè)高質(zhì)量、分布于桃全基因組的SNP位點(diǎn)[12]。本研究選擇這些SNP位點(diǎn)的位置信息，提取雜交群體的相應(yīng)位點(diǎn)基因型，作為第一種抗蚜背景標(biāo)記，以下簡(jiǎn)稱“Pre-work SNP”。此外，通過隨機(jī)選擇的方式，結(jié)合SNP鑒定的結(jié)果文件，依據(jù)各染色體的總變異位點(diǎn)數(shù)目，等比例從各染色體中隨機(jī)選擇位點(diǎn)，利用Linux系統(tǒng)下的shuf命令在各染色體隨機(jī)選擇相應(yīng)數(shù)目的位點(diǎn)，如從1號(hào)染色體隨機(jī)選擇165個(gè)位點(diǎn)：shuf -n 165 Chr.01.txt ＞＞ shuf1.txt，從各染色體中隨機(jī)選擇的位點(diǎn)數(shù)目相加共計(jì)775個(gè)，以下簡(jiǎn)稱“Random SNP”。最后，利用ANNOVAR[21]軟件對(duì)SNP鑒定結(jié)果文件中所有的SNP進(jìn)行功能注釋，共有1 160 518個(gè)變異位點(diǎn)被注釋，外顯子區(qū)域的變異位點(diǎn)有132 624個(gè)，其中影響起始密碼子與終止密碼子功能的突變位點(diǎn)有1 129個(gè)，依據(jù)這些突變位點(diǎn)在各染色體上的位點(diǎn)數(shù)目，從中等比例隨機(jī)挑選，從各染色體中隨機(jī)選擇的位點(diǎn)數(shù)目相加共計(jì)775個(gè)，以下簡(jiǎn)稱“Functional SNP”。最后，利用VCFTOOLS[22]軟件分別提取雜交群體中各單株在上述3種不同挑選方式所得到的775個(gè)位點(diǎn)的SNP信息，并篩選有效差異位點(diǎn)。

1.6 雙親背景回復(fù)率的計(jì)算

親本1背景回復(fù)率(%)=[1-(有效差異位點(diǎn)數(shù)/有效位點(diǎn)總數(shù))]×100。式中，有效位點(diǎn)總數(shù)是指在不同背景標(biāo)記下雙親中存在多態(tài)性的位點(diǎn)總數(shù)；有效差異位點(diǎn)包含于有效位點(diǎn)，是指F2代單株與親本1表現(xiàn)不一致的SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)。親本2背景回復(fù)率計(jì)算方法同上。

2 結(jié)果

2.1 山桃F2群體表型結(jié)果

經(jīng)對(duì)山桃F2群體表型評(píng)價(jià)，該群體內(nèi)對(duì)桃蚜抗性1級(jí)單株36株，抗性2級(jí)單株49株，抗性3級(jí)單株28株；群體平均單果重變化范圍為11.02—79.62 g，平均值為27.23 g，變異系數(shù)CV值為53.58%?？扇苄怨绦挝锖孔兓秶鸀?%—16.1%，平均值為11.45%，變異系數(shù)CV值為18.21%。

2.2 山桃F2群體重測(cè)序及SNP鑒定

平均每個(gè)個(gè)體的raw data為1.7 G，總測(cè)序數(shù)據(jù)量達(dá)到206 G，測(cè)序質(zhì)量Q30＞91%，各樣本的序列GC含量分布正常，建庫測(cè)序成功。對(duì)raw data中包含的接頭信息和低質(zhì)量堿基進(jìn)行過濾，最終得到高質(zhì)量的clean data，其總數(shù)據(jù)量為202 G，利用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

參考基因組（Lovell_Prunus_persica 2.0）[18]大小為230.26 Mb，將山桃雜交群體的測(cè)序序列與參考基因組序列比對(duì)，在全基因組范圍內(nèi)共檢測(cè)到5 916 824個(gè)SNP，經(jīng)過濾后，共得到2 023 619個(gè)高質(zhì)量的SNP。

2.3 不同選擇方式的抗蚜背景標(biāo)記分布情況

由于在前期篩選高多態(tài)性SNP時(shí)最終得到775個(gè)SNP的變異信息[12]，因此，為了保證3種方法的一致性，其余2種方法均將775作為篩選SNP數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)。3種方法篩選到的775個(gè)背景SNP在染色體上的相對(duì)位置如圖1所示。

結(jié)果顯示，以Pre-work SNP為依據(jù)篩選的775個(gè)SNP位點(diǎn)中，9個(gè)SNP位點(diǎn)未檢測(cè)到變異信息，334個(gè)SNP位點(diǎn)在雙親中沒有差異，剩余432個(gè)SNP在雙親中有差異，被認(rèn)為是有效的差異位點(diǎn)。這432個(gè)SNP在第1—8染色體上的數(shù)目分別為71、59、58、48、38、73、34和33個(gè)。

以Random SNP為選擇依據(jù)篩選的775個(gè)SNP位點(diǎn)中，146個(gè)SNP位點(diǎn)在雙親中沒有差異，剩余630個(gè)SNP在雙親中有差異，有效差異位點(diǎn)在1—8號(hào)染色體上的數(shù)目分別為147、85、88、73、55、95、51和36個(gè)。

以Functional SNP為選擇依據(jù)所篩選的775個(gè)SNP中，52個(gè)SNP位點(diǎn)在雙親中沒有差異，剩余723個(gè)SNP在雙親中有差異，有效差異位點(diǎn)在1—8號(hào)染色體上的數(shù)目分別為153、112、100、96、78、9、87和88個(gè)。

2.4 山桃F2單株在不同背景標(biāo)記下的雙親背景回復(fù)率

利用2.3篩選得到的SNP，計(jì)算F2單株在8條染色體上對(duì)雙親的回復(fù)率，如表1所示。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Pre-work SNP計(jì)算的‘橡皮油桃’和‘帚形山桃’平均回復(fù)率分別為55.62%和36.04%；而Random SNP在雙親的平均回復(fù)率分別為42.85%和25.79%；Functional SNP則分別為37.61%和29.61%。即3種方法均表明雜交后代中來自母本‘橡皮油桃’的遺傳信息高于父本‘帚形山桃’。

分析不同染色體的親本回復(fù)率，Pre-work SNP F2單株在6號(hào)染色體的‘橡皮油桃’平均回復(fù)率達(dá)到72.41%，變異系數(shù)為13.46%，在7號(hào)染色體的‘帚形山桃’回復(fù)率達(dá)到53.72%，變異系數(shù)為34.37%，6號(hào)與7號(hào)染色體分別為雙親回復(fù)率最高的染色體。Random SNP雙親平均回復(fù)率與Pre-work SNP結(jié)果一致，且6號(hào)染色體的橡皮油桃平均回復(fù)率達(dá)60%，7號(hào)染色體的帚形山桃背景回復(fù)率達(dá)40%。Functional SNP在F2代單株中雙親平均背景回復(fù)率與前兩種有差異，‘橡皮油桃’背景回復(fù)率最高的是1號(hào)染色體，其次是6號(hào)染色體；而‘帚形山桃’背景回復(fù)率從高到低依次是4號(hào)、3號(hào)、7號(hào)染色體。該結(jié)果表明，不同染色體來自親本的遺傳背景不同，有的染色體更傾向母本，有的則更傾向父本。

本研究同時(shí)統(tǒng)計(jì)了F2各單株的‘橡皮油桃’背景標(biāo)記回復(fù)率的頻次分布，結(jié)果如圖2所示，即3種方法都呈正態(tài)分布，但峰值所在的回復(fù)率有所不同。Functional SNP計(jì)算的回復(fù)率峰值較低，為30%— 40%；而Pre-work SNP和Random SNP計(jì)算的回復(fù)率峰值均為50%—60%。

表1 F2單株在8條染色體上對(duì)雙親的回復(fù)率

圖1 775個(gè)SNP標(biāo)記在染色體上的分布情況

圖2 F2代單株‘橡皮油桃’背景回復(fù)率頻次分布

2.5 三種背景標(biāo)記選擇方法的重復(fù)性分析

此外，為探討3種背景標(biāo)記選擇方法的重復(fù)性，本研究選擇不同背景標(biāo)記雙親回復(fù)率較高的前10株，分析這些單株在不同方法出現(xiàn)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用Pre-work SNP篩選的‘橡皮油桃’回復(fù)率較高的前10株中，有2株在Random SNP中被鑒定到，在Functional SNP中同樣僅鑒定出2株。而在Random SNP篩選的‘橡皮油桃’回復(fù)率較高的10株中，Pre-work SNP鑒定的僅2株，而Functional SNP鑒定的達(dá)到6株，即‘橡皮油桃’高回復(fù)率的單株在Random SNP與Functional SNP兩種標(biāo)記間的篩除率重復(fù)性較強(qiáng)，Pre-work SNP與Random SNP，以及Pre-work SNP與Functional SNP的重復(fù)性相當(dāng)（圖3-a）。同樣地，在用Pre-work SNP篩選的‘帚形山桃’回復(fù)率較高的前10株中，有1株在Random SNP中被鑒定到，而在Functional SNP中未被鑒定到。在用Functional SNP篩選的‘帚形山桃’回復(fù)率較高的前10株中，有5株在Random SNP中被鑒定到，即‘帚形山桃’高回復(fù)率的單株在Random SNP與Functional SNP兩種標(biāo)記間的重復(fù)性強(qiáng)于Pre-work SNP與Random SNP、Pre-work SNP與Functional SNP（圖3-b）。

a：‘橡皮油桃’；b：‘帚形山桃’

2.6 三種背景標(biāo)記選擇方法的優(yōu)劣分析

為比較3種背景標(biāo)記選擇方法的優(yōu)劣，將回復(fù)率與表型進(jìn)行相關(guān)性分析。由于背景標(biāo)記回復(fù)率是用全基因組的SNP進(jìn)行計(jì)算，而表型性狀很難將所有的表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并得出一個(gè)整體的評(píng)價(jià)結(jié)果，因此，本研究?jī)H選擇育種家最關(guān)注的性狀進(jìn)行分析，以盡可能服務(wù)育種目標(biāo)。為此，本研究評(píng)價(jià)雜交群體的單果重和可溶性固形物含量2個(gè)性狀，同時(shí)將其與‘橡皮油桃’回復(fù)率進(jìn)行聯(lián)合分析，以此來衡量不同背景標(biāo)記篩選方法的優(yōu)劣。

首先，依據(jù)群體單株單果重的評(píng)價(jià)結(jié)果，從中分別選擇大果（單果重大于30 g）與小果（單果重小于20 g）單株各10株，比較兩類表型單株的‘橡皮油桃’背景回復(fù)率之間的差異（圖4-a、b、c）。同樣地，依據(jù)群體單株果實(shí)可溶性固形物含量的評(píng)價(jià)結(jié)果，從中分別選擇可溶性固形物含量較低單株（SSC＜10%）與較高單株（SSC＞12%）各10株，比較兩類表型單株的‘橡皮油桃’背景回復(fù)率之間的差異（圖4-d、e、f）。

由圖4可知，在以單果重作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，“Pre-work SNP”篩選單株的‘橡皮油桃’回復(fù)率在兩類群體中差異最大，其次為“Functional SNP”方法，而“Random SNP”篩選的單株回復(fù)率則在兩類群體中無差異。而以可溶性固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，3種背景標(biāo)記篩選的單株雖然均表現(xiàn)為SSC高的單株，其‘橡皮油桃’的回復(fù)率也高，但回復(fù)率在兩類群體間沒有明顯差異。

2.7 山桃F2群體優(yōu)系篩選抗蚜單株示例

在依據(jù)“Pre-work SNP”與“Functional SNP”2種背景標(biāo)記所篩選的‘橡皮油桃’回復(fù)率最高的10株后代中，有2株同時(shí)被篩選到（圖3-a），分別為N20和N36。其中，N20在“Pre-work SNP”和“Functional SNP”中回復(fù)率分別為68.29%和52%，N36在兩種背景標(biāo)記中的回復(fù)率分別為71.99%和55.6%。

依據(jù)筆者課題組前期抗蚜分子標(biāo)記研究成果[13]，用InDel 2引物對(duì)擴(kuò)增N20單株所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在對(duì)應(yīng)于Lovell基因組組裝的Scaffold 3第24 761 660堿基處有9 bp的缺失，為TTTCCGGCC/---------，N36的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物沒有缺失，認(rèn)為N20攜帶抗蚜標(biāo)記，N36不攜帶抗蚜標(biāo)記。因此，N20是F2群體中最終篩選出的‘橡皮油桃’回復(fù)率最高且攜帶野生資源抗性標(biāo)記的優(yōu)異單株。

已知‘帚形山桃’單果重約11 g[23]，而雜交單株N20單株的平均單果重為34.42 g，相比前者提高212.9%；N20的果實(shí)類型為毛桃，可溶性固形物含量為16.1%，單株表現(xiàn)抗蚜，抗性分級(jí)為1級(jí)，其標(biāo)記分布如圖5所示。

圖4 極端差異表型單株‘橡皮油桃’背景回復(fù)率差異

圖5 Pre-work SNP背景標(biāo)記在N20染色體上的分布

3 討論

桃蚜對(duì)桃樹生長(zhǎng)具有極其嚴(yán)重的危害，發(fā)掘與利用優(yōu)異抗蚜種質(zhì)資源，培育抗蚜品種、砧木，發(fā)掘抗蚜基因，是解決該問題的重要方法。在前期的研究中，鑒定出的抗蚜種質(zhì)有壽星桃、碧桃、山桃[14,24]等，也分別開發(fā)了上述種質(zhì)的抗蚜分子標(biāo)記，發(fā)掘了相關(guān)候選基因[13,25-26]，為桃抗蚜育種奠定了理論和方法基礎(chǔ)。在作物的育種工作中，以分子標(biāo)記為輔助手段，在苗期進(jìn)行早期篩選，可以大大提高雜交后代輪回親本的回復(fù)速度。本研究篩選出1份‘橡皮油桃’回復(fù)率高且攜帶抗蚜標(biāo)記的種質(zhì)，可以與‘橡皮油桃’繼續(xù)回交，進(jìn)一步提高其背景回復(fù)率，為提高‘橡皮油桃’的抗蚜性提供一種高效的方法。

3.1 前人研究所用標(biāo)記類型

回交育種通常用于將有利農(nóng)藝性狀的基因從供體親本轉(zhuǎn)移到輪回親本[27]，WING等[28]提出的全基因組育種流程來源于FRISCH[29]“三步走”策略，即先通過優(yōu)良品系與基因供體雜交得到F1代，繼而以優(yōu)良品系為輪回親本對(duì)后續(xù)世代逐代回交，通過在目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)各設(shè)計(jì)1個(gè)分子標(biāo)記用于負(fù)向選擇以打破連鎖累贅，最后挑選出回復(fù)率最高的單株。KARUNARATHNA[30]也認(rèn)為，基因組背景選擇結(jié)合標(biāo)記前景輔助選擇是一種有效的育種方法。然而，不同報(bào)道中，用于背景選擇的分子標(biāo)記篩選方法不盡相同。CHANDRAN等[31]為改良富含-胡蘿卜素的自交系UMI1200+和UMI1230+，提高其賴氨酸和色氨酸含量，導(dǎo)入目標(biāo)基因后，利用236個(gè)均勻分布在玉米基因組中的SSR標(biāo)記進(jìn)行背景選擇。YU等[32]在完成500多個(gè)水稻全基因組測(cè)序后，共得到4 236 029個(gè)SNP，刪除雜合基因型SNP后，繼續(xù)在每100 kb隨機(jī)選擇2個(gè)SNP，最終篩選出5 102個(gè)SNP用于構(gòu)建基因芯片RICE 6K，用于背景標(biāo)記的篩選。YANG等[33]利用RICE 6K基因芯片作為背景標(biāo)記，將廣譜抗性基因?qū)胴S39S以提高其稻瘟病抗性。本研究采用3種方法進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明隨機(jī)挑選SNP和篩選功能性SNP雖然二者重復(fù)率較高，但利用前期鑒定的高多態(tài)性SNP計(jì)算的背景回復(fù)率卻與育種目標(biāo)性狀顯示了較高的相關(guān)性，更適宜在桃上以單果重為目標(biāo)進(jìn)行后代的篩選。

3.2 背景標(biāo)記優(yōu)劣性分析的內(nèi)在邏輯

本研究選擇單果重和SSC與‘橡皮油桃’回復(fù)率的相關(guān)性作為衡量3種背景標(biāo)記優(yōu)劣性的評(píng)價(jià)方法。認(rèn)為大果與高含量SSC性狀來源于母本‘橡皮油桃’，然而，研究發(fā)現(xiàn)高單果重群體的‘橡皮油桃’回復(fù)率與低單果重群體有差異，但高SSC單株的‘橡皮油桃’回復(fù)率卻與低SSC類群間沒有明顯差異。推測(cè)可能與單果重有主效基因，而SSC沒有主效基因?qū)е耂SC的貢獻(xiàn)既來自父本又來自母本有關(guān)。因此，當(dāng)以微效多基因控制的性狀作為育種目標(biāo)時(shí)，采用背景選擇的育種效率提升程度可能要低一些，需要相對(duì)更長(zhǎng)的育種周期。

相比于準(zhǔn)確性更好的Pre-work SNP，利用Random SNP選擇的位點(diǎn)在染色體上的分布最為均勻，然而其準(zhǔn)確性卻較低。研究推測(cè)，利用Random SNP計(jì)算的回復(fù)率越高的單株，其在遺傳背景上就更像親本，但其標(biāo)記的隨機(jī)性導(dǎo)致其可能更多的與育種中“無用”的性狀連鎖，也決定了選擇的“盲目性”。而Functional SNP的準(zhǔn)確性不是最高，可能與導(dǎo)致表型多態(tài)性的功能性位點(diǎn)不僅包括本研究中的起始密碼子缺失、翻譯提前終止和終止缺失，也包含大量的非同義突變等有關(guān)。因此，在今后的研究中，可以嘗試綜合利用更多類型的功能性位點(diǎn)，甚至調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列突變位點(diǎn)來進(jìn)行綜合分析，可能會(huì)得到理想的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究以前期抗蚜定位區(qū)間內(nèi)的連鎖標(biāo)記為前景選擇標(biāo)記，以775個(gè)廣泛分布于基因組的SNP為背景選擇標(biāo)記，分別計(jì)算不同背景標(biāo)記選擇方法的F2代單株的親本背景回復(fù)率，發(fā)現(xiàn)該雜交后代的遺傳背景更多來自母本。相對(duì)于其他兩種方法（Random SNP、Functional SNP），利用多態(tài)性高的SNP（Pre-work SNP）進(jìn)行背景選擇顯示了較高的選擇效率。本研究篩選出一株母本背景回復(fù)率最高、攜帶抗蚜標(biāo)記的單株N20，為后續(xù)桃的抗蚜性育種奠定了研究基礎(chǔ)。

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Background Selection and Comparison of Marker Superiority and Inferiority of Aphid-Resistant Seedlings in an Interspecific Cross Peach Population

1Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009;2Western Agricultural Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changji 831100, Xinjiang

【Objective】To establish a background selection system in peach, the seedlings contained aphid-resistance locus and high female parent recovery rate were screened from an F2population crossed by Xiang Pi You Tao peach (big fruit and susceptible to aphid) and Zhou Xing Shan Tao peach (small fruit and resistant to aphid). 【Method】Firstly, three methods were used to select background markers, including the high polymorphic single nucleotide polymorphism (SNP) obtained from the previous study (Pre-work SNP), SNP randomly selected in the whole genome (Random SNP), and functional SNP affecting the start and stop codon (Functional SNP). The number of final SNP selected by the above methods were 775. Then, using these SNPs, the parents recovery rate for all 121 individuals of the F2population were calculated, respectively. The repeatability of the selection methods was evaluated by comparing whether the top 10 seedlings with different selection markers were coincident or not. After completing the evaluation of aphid resistance, single fruit weight, and soluble solids content of F2population, 10 seedlings with extreme phenotypes for the single fruit weight and soluble solids content were selected, respectively. And the superiority and inferiority of different selection methods were estimated by comparing the significance of the differences in Xiang Pi You Tao recovery rates between the two types of phenotypes. Finally, the SNPs in the aphid-resistant location area were used as the foreground markers to screen the elite seedlings with high maternal genetic background and aphid resistance. 【Result】The background recovery rates of the F2seedlings which calculated by the three methods were 36.34%-71.99%, 31.75%-74.92%, and 4.51%-66.53%, respectively. Among the top 10 seedlings with high Xiang Pi You Tao recovery rates screened by the three background markers, Pre-work SNP and Random SNP had two duplicate single plants, and so do Pre-work SNP and Functional SNP, and there were 6 repetitive single plants in Random SNP and Functional SNP. This result indicated that the repeatability between the Random SNP and Functional SNP was the highest among all comparisons. When single fruit weight was selected as the breeding target, among the extreme phenotypic monocots, the three background markers, such as Pre-work SNP, Random SNP, and Functional SNP, had a significant Xiang Pi You Tao background recovery rate of 0.069, 0.26, and 0.092, respectively, which meant high relativity was found between the background recovery rate calculated by Pre-work SNP and their fruit weight, followed by Functional SNP, and Random SNP difference was not significant. When soluble solids content was selected as the target, the Xiang Pi You Tao background recovery rates among extreme phenotypic monocots were significant at 0.77, 0.65 and 0.31, respectively, and the differences among the three background markers were not significant. Finally, two individuals with high recovery rate of Xiang Pi You Tao peach were screened, including N20 and N36. Among them, N20 comprised the aphid-resistant markers, and this individual showed aphid resistance with an average fruit weight of 34.42 g and soluble solids content of 16.1%, which was considered to be the superior single strain of this population. 【Conclusion】In this study population, Pre-work SNP showed a stronger correlation between single fruit weight and Xiang Pi You Tao background recovery rates than Functional SNP and Random SNP, confirming the superiority of this background marker selection method, and the superior performance of N20 plants, which selected with this background marker in the target traits also supported this result. This study provided an idea of background selection and a method to judge the superiority and inferiority of different background markers in the study population, which could effectively improve the efficiency of resistance breeding in fruit crops.

peach; aphid-resistant; SNP; foreground selection; background selection

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.013

2022-11-03；

2023-02-28

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)（CAAS-ASTIP-2020-ZFRI）

劉蘇寧，E-mail：lsn310@outlook.com。通信作者曹珂，E-mail：wyandck@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）