氧化苦參堿通過抑制HMGB1緩解坐骨神經慢性壓迫性損傷神經性疼痛

黃翔，李曉宏，湯達承，陳盼

〔摘要〕 目的 建立大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury， CCI）模型，探索氧化苦參堿（oxymatrine， OMT）對CCI大鼠神經疼痛的緩解作用。方法 30只大鼠隨機分為Sham組、CCI組、OMT組，每組10只。OMT組大鼠于術后7 d內每2天鞘內注射OMT（1.2 mg/kg），CCI組和Sham組同一時間注射等體積的生理鹽水。各組大鼠于術后第1、3、7、14、21天檢測后足機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold， MWT）和熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）。采用Western blot法檢測大鼠脊髓組織中高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein， HMGB1）和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）表達情況，使用ELISA法檢測大鼠脊髓組織中腫瘤壞死因子-？琢（tumor necrosis factor-？琢， TNF-？琢）和白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）的表達情況。結果 CCI組大鼠表現出甩腿、舔足等明顯的疼痛表現，提示造模成功。與Sham組比較，CCI組大鼠術后第7、14、21天的MWT顯著降低（P<0.05），PWTL顯著縮短（P<0.05）。與CCI組相比，OMT組大鼠術后第7、14、21天的MWT明顯增加（P<0.05），PWTL顯著升高（P<0.05）。與Sham組比較，CCI組大鼠脊髓組織中HMGB1、TLR4的蛋白表達水平及TNF-α、IL-β的含量顯著上升（P<0.05）；與CCI組比較，OMT組大鼠脊髓組織中HMGB1、TLR4的蛋白表達水平及TNF-α、IL-β的含量明顯下降（P<0.05）。結論 OMT可能通過下調CCI大鼠脊髓組織中的HMGB1、TLR4、TNF-α及IL-β，緩解CCI大鼠的神經性疼痛。

〔關鍵詞〕 神經性疼痛；氧化苦參堿；高遷移率族蛋白1；Toll樣受體4；神經炎癥；坐骨神經壓迫

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.008

Oxymatrine relieves neuropathic pain in rats with chronic

constriction injury of sciatic nerve by inhibiting HMGB1

HUANG Xiang， LI Xiaohong*， TANG Dacheng， CHEN Pan

Department of Pain Management， the First People's Hospital of Foshan， Foshan， Guangdong 528000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To establish a rat model of chronic constriction injury （CCI） of the sciatic nerve， so as to explore the analgesic effects of oxymatrine （OMT） on neuropathic pain in CCI rats. Methods A total of 30 rats were randomly divided into Sham group， CCI group， and OMT group， with 10 rats in each group. The rats in OMT group were intrathecally injected with OMT （1.2 mg/kg） every 2 days within 7 d after surgery， while the rats in CCI group and Sham group were injected with the same volume of normal saline at the same time. The mechanical withdrawal threshold （MWT） and paw withdrawal thermal latency （PWTL） of rats in each group were measured on the 3rd， 7th， 14th， and 21st days after surgery. In addition， the expression levels of high mobility group box-1 protein （HMGB1） and Toll-like receptor 4 （TLR4） in the spinal cord tissue were determined by Western blot， and the expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in the spinal cord tissue were examined by ELISA. Results The rats in CCI group showed obvious pain manifesting as swinging legs and licking feet， suggesting successful modeling. Compared with Sham group， the rats in CCI group showed significantly lower MWT on the 7th， 14th， and 21st days after surgery （P<0.05）， with significantly shorter PWTL （P<0.05）. Compared with CCI group， MWT of the rats in OMT group was significantly higher on the 7th， 14th， and 21st days after surgery （P<0.05）， with significantly longer PWTL （P<0.05）. Compared with Sham group， the protein expression levels of HMGB1 and TLR4 as well as the content of TNF-α and IL-1β in the spinal cord tissue of rats in CCI group significantly increased （P<0.05）. Compared with CCI group， the protein expression levels of HMGB1 and TLR4 as well as the content of TNF-α and IL-1β in the spinal cord tissue of rats in OMT group significantly decreased （P<0.05）. Conclusion OMT may relieve neuropathic pain in CCI rats by down-regulating HMGB1， TLR4， TNF-α， and IL-β in the spinal cord tissue.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 neuropathic pain; oxymatrine; high mobility group box-1 protein; Toll-like receptor 4; neuroinflammation; constriction of the sciatic nerve

疼痛是機體組織受損或存在潛在性損傷造成，但是越來越多的研究表明疼痛是神經功能紊亂的表現[1]。神經炎癥在神經性疼痛的發(fā)生和維持中起著至關重要的作用，趨化因子和趨化因子受體在外周和中樞神經系統(tǒng)中通過增強神經炎癥介導慢性疼痛作用[2]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group

box-1 protein， HMGB1）是一種高度保守的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細胞中，其晚期具有促炎作用，是近年來危重醫(yī)學研究的熱點之一[3]。在多種神經疾病中都出現高表達的HMGB1，其會與晚期糖基化終末產物（receptor of advanced glycation endproducts， RAGE）以及Toll樣受體（Toll-likereceptors， TLR）結合，促進核因子κB（nuclear factor-kappa B， NF-κB）核轉錄，激活CXC趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor-4， CXCR4），從而促進多種炎癥因子的釋放[4]。激活的HMGB1與小膠質細胞的激活有關[5]，抑制HMGB1/RAGE軸可減少小膠質細胞介導的神經炎癥活動，抑制NF-κB信號通路的激活和炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-？琢（tumor necrosis factor-？琢， TNF-？琢）和白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）的表達[6]。氧化苦參堿（oxymatrine， OMT）是一種天然喹喔啉生物堿，具有抗炎作用。OMT可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路緩解大鼠腦神經炎癥[7]。但尚未見將OMT應用于神經性疼痛模型治療的報道。大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury， CCI）模型是研究外周神經不完全損傷的病理性疼痛的動物模型[8]。因此，本研究建立大鼠CCI模型，并將OMT鞘內注射應用于大鼠CCI模型，旨在明確OMT緩解慢性神經病理性疼痛的分子機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

30只SD雄性大鼠（200～250 g）由佛山市第一人民醫(yī)院動物中心提供，獲得佛山市第一人民醫(yī)院動物管理倫理委員會批準（編號：C202212-3）。每籠5只，每天提供12 h/12 h的晝夜光照循環(huán)、充足的食物和水，保持環(huán)境濕度（50%～70%）及溫度（20～23 ℃）恒定，動物適應性飼養(yǎng)1周。30只大鼠隨機分為Sham組、CCI組（CCI+鞘內注射生理鹽水）、OMT組（CCI+鞘內注射OMT），每組10只。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經但不進行結扎。CCI組和OMT組大鼠進行CCI手術，術前禁食12 h，術后分別給予等體積的生理鹽水或OMT。

1.2? 主要試劑與儀器

OMT（上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司，批號：29436122）；兔源性HMGB1抗體、兔源性TLR4抗體和兔源性GAPDH抗體（上海艾博抗貿易有限公司，批號分別為：AB18256、AB22048、AB192043）；抗兔lgG-HRP（上海圣克魯斯生物技術有限公司，批號：sc-2354）；化學增強發(fā)光試劑盒（中國賽默飛世爾科技有限公司，批號：02551010）；組織裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）。

PE-10導管（美國健康醫(yī)療儀器國際公司，型號：188700）；VonFrey纖維絲（美國Stoelting公司，型號：Aesthesio）；熱輻射測試儀器（美國IITC公司，型號：37370）；電泳儀、電泳槽、TRANS-BLOT SD半干電轉移系統(tǒng)（上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司，型號分別為：7007010、1656001、1703940）。

1.3? 神經病理性疼痛模型的建立與給藥方法

大鼠禁食12 h后，進行CCI手術。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，側臥位放置于手術臺上。于左側股骨下方切開皮膚，暴露坐骨神經，在坐骨神經三叉分支以上的位置用4-0含鉻羊腸線結扎坐骨神經，然后依次縫合肌肉及皮膚，再次進行消毒，并將大鼠放置于原飼養(yǎng)位置[8]。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經但不進行結扎。將OMT樣品使用無菌生理鹽水配制成濃度為1 mg/50 μL的溶液，OMT組大鼠于術后7 d內每2天鞘內注射1.2 mg/kg的OMT[9]，CCI組和Sham組大鼠于術后7 d內每2天鞘內注射等體積的生理鹽水。

1.4? 鞘內置管

鞘內置管用于給藥。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，掀開大鼠L6的硬脊膜，沿蛛網膜下腔向頭端置入PE-10導管。注射利多卡因后，雙側后肢麻痹，進行鞘內植入。固定導管，隨后封皮進行CCI手術。3組大鼠均進行鞘內置管。OMT組硬膜外注射OMT，相同給藥時間CCI組與Sham組注射相同體積的生理鹽水。

1.5? 機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold， MWT）測定

分別于建模后的第1、3、7、14、21天檢測大鼠的疼痛行為學指標，VonFrey法測定MWT，將大鼠放置于安靜舒適的環(huán)境中，等待大鼠適應30 min之后，用VonFrey纖維絲刺激大鼠左側后足足底，將VonFrey纖維絲彎曲并持續(xù)3～5 s，記錄大鼠出現縮足、抬足、舔足行為時對應的VonFrey標號，反復測量3次，取平均值[10]。

1.6? 熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）測定

分別于建模后的第1、3、7、14、21天檢測大鼠的疼痛行為學指標，使用熱輻射測試儀測定PWTL。將大鼠放置于有機玻璃箱內，并將3 mm厚的玻璃板置于箱底。待大鼠適應30 min，用熱痛儀照射大鼠術側后足足底，記錄大鼠出現縮足、抬足、舔足行為時照射的持續(xù)時間，重復測定3次，取平均值[10]。

1.7? Western blot法檢測HMGB1、TLR4的蛋白表達水平

建模后的第7天，將大鼠麻醉之后，迅速斷頭處死，取出脊髓，迅速切除CCI損傷側腰段脊髓背角（L4-6），立即放置于-80 ℃保存。將脊髓組織用液氮研磨，然后用組織裂解液冰上裂解15 min，4 ℃低溫離心5 min（12 000 r/min，離心半徑10 cm）。用BCA試劑盒測量提取的蛋白含量。將樣品與5×上樣緩沖液混合煮沸滅活。電泳實驗：每孔50 μg 蛋白上樣，90 min后，使用半干轉儀將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。封閉結束后，對應的PVDF膜分別于4 ℃過夜孵育HMGB1（1∶300）、TLR4（1∶500）、GADPH（1∶300）一抗。接著與HPR偶聯的特異性二抗工作液室溫孵育1 h，二抗孵育結束后，TBST漂洗3次，每次10 min。將漂洗后的PVDF膜用ECL溶液浸潤。將被濾紙吸盡液體的PVDF膜浸潤于曝光液中，通過Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白質。

1.8? ELISA法檢測TNF-α、IL-β的含量

建模后的第7天，麻醉大鼠，迅速斷頭處死，取出脊髓，切除CCI損傷側腰段脊髓背角（L4-6），將各組的脊髓組織加PBS研磨，4 ℃低溫離心20 min，（800 r/min，離心半徑10 cm），取上清液作為樣品，按照試劑盒說明書進行ELISA分析，檢測TNF-α和IL-β的含量。

1.9? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0和Graphpad 8對數據進行統(tǒng)計分析，數據以“ｘ±s”表示，采用？字2檢驗。組間兩兩比較采用方差分析及t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠MWT比較

術后第7、14、21天，與Sham組比較，CCI組MWT降低（P<0.05）；與CCI組比較，OMT組MWT升高（P<0.05）。詳見表1。

2.2? 各組大鼠PWTL比較

術后第7、14、21天，與Sham組比較，CCI組PWTL明顯下降（P<0.05）；與CCI組比較，OMT組PWTL均明顯上升（P<0.05）。詳見表2。

2.3? 各組大鼠脊髓組織HMGB1和TLR4蛋白表達水平比較

與Sham組比較，CCI組HMGB1及TLR4蛋白表達水平顯著上升（P<0.05）；與CCI組比較，OMT組HMGB1及TLR4蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）。詳見圖1。

2.4? 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-β表達水平比較

與Sham組比較，CCI組TNF-α、IL-β表達水平顯著上升（P<0.05）；與CCI組比較，OMT組TNF-α、IL-β表達水平明顯下降（P<0.05）。詳見圖2。

3 討論

神經性疼痛是由于神經系統(tǒng)受損引發(fā)的慢性疼痛，表現為痛覺異常、自發(fā)性疼痛、痛覺過敏。前期研究使用哌替啶為陽性對照藥，OMT劑量為1.2 mg/kg，實驗表明OMT具有鎮(zhèn)痛作用[11]。本文使用大鼠CCI模擬神經性疼痛，造模后大鼠出現包括舔足、抬足的明顯縮足反應，大鼠第7、14、21天的MWT和PWTL均明顯下降，該結果表明成功建立了神經性疼痛模型。術后7 d內每2天鞘內注射OMT給藥，大鼠第7、14、21天的MWT和PWTL均明顯上升。本文還檢測了HMGB1和TLR4的蛋白表達變化以及炎癥因子的水平，結果表明OMT抑制了HMGB1和TLR4的表達以及炎癥因子水平。以上數據顯示，OMT緩解了大鼠CCI引發(fā)的神經性疼痛。

內源性HMGB1來源于神經元、周圍神經細胞或積聚于背根神經節(jié)或感覺神經的免疫細胞，參與神經性炎性成分造成的軀體和內臟疼痛。HMGB1在炎癥疾病模型中被激活，與多種跨膜受體包括TLR2、TLR4和TLR9結合，從而提高NF-κB、p53等轉錄因子的DNA結合能力，最終引發(fā)強烈的炎癥反應[12]。最近研究證明，HMGB1與慢性神經病理性疼痛也密切相關，抗HMGB1單克隆抗體在動物模型中已顯示出可有效治療多種中樞神經系統(tǒng)疾病，包括中風、腦外傷、帕金森病、癲癇和阿爾茨海默病的潛力[13]。拮抗HMGB1靶向受體有助于減少各種形式的頑固性疼痛，許多參與神經性疼痛發(fā)展的微小RNA通過下調CCI大鼠中的HMGB1和促炎因子來減輕神經性疼痛[14]。研究表明，HMGB1天然抑制劑甘草甜素可以抑制糖尿病性神經病大鼠中TLR4、NLRP3和CXCR4表達的增加，改善糖尿病性神經病大鼠機械和熱痛閾值，阻止小膠質細胞中的組蛋白3乙?；痆15]。本研究發(fā)現CCI神經病理性疼痛中，HMGB1和TLR4高表達。鞘內注射OMT下調了HMGB1和TLR4的表達，同時抑制了炎癥因子TNF-α和IL-β的分泌水平。結合HMGB1在神經性疼痛中的重要作用，猜測OMT可能是通過抑制HMGB1減輕大鼠慢性CCI的神經性疼痛。

苦參來源于豆科槐屬植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，《本草綱目》對其的評價為“苦以味名，參以功名，槐以葉形名也”?？鄥⑿院犊?，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效[16]。OMT是中藥苦參根部中提取的天然喹喔啉生物堿，具有一定的藥理特性，包括免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化和抗病毒作用[17]。對其神經保護作用方面的研究表明，OMT以濃度依賴方式降低TLR-4和NF-κB的水平，抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶通路[18]。此外，OMT抑制1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶/1-甲基-4-苯基吡啶誘導的小膠質細胞活化和促炎細胞因子的釋放，OMT下調組織蛋白酶D（cathepsin D， CathD）的表達，并抑制了HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活[19]，提示OMT的神經保護作用具有CathD依賴性[20]。雖然OMT在帕金森病動物模型中的神經保護作用已經被證實，但關于神經性疼痛的研究較少。本文將OMT運用于大鼠CCI的神經性疼痛模型，發(fā)現OMT通過抑制HMGB1發(fā)揮了神經保護作用，從而緩解了大鼠神經性疼痛，為更好開發(fā)OMT在臨床神經鎮(zhèn)痛方面的應用提供了有力證據。

綜上所述，OMT可下調CCI大鼠脊髓組織中HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-β的蛋白表達，減輕神經病理性疼痛。本研究為神經病理性疼痛的治療提供了新的治療方案。

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（本文編輯? 周? 旦）