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    基于線粒體凋亡通路探討防己諾林堿對前列腺癌PC3細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響

    2023-08-14 11:01:11李冬,董明國,房志科,黃林石,陳繼英
    關(guān)鍵詞:自噬增殖前列腺癌

    李冬,董明國,房志科,黃林石,陳繼英

    〔摘要〕 目的 基于線粒體凋亡通路探究防己諾林堿(fangchinoline, FAN)對前列腺癌PC3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 將前列腺癌PC3細(xì)胞按照FAN處理濃度分為4組,分別為FAN 0 μmol/L組、FAN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組,各組依次采用FAN 0 μmol/L (DMSO替代)、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L進行處理,孵育48 h后進行實驗。CCK-8法檢測PC3細(xì)胞增殖,平板克隆法檢測PC3細(xì)胞克隆形成能力,流式細(xì)胞儀檢測PC3細(xì)胞凋亡,Transwell實驗檢測PC3細(xì)胞侵襲,劃痕實驗檢測PC3細(xì)胞遷移,Western blot檢測PC3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和線粒體凋亡通路蛋白。結(jié)果 與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.001),凋亡率明顯升高(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比, FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.001);與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞中P62和Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.001),LC3B、Bax和Caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.001)。結(jié)論 FAN可能通過線粒體凋亡通路抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進其自噬和凋亡,并呈現(xiàn)劑量依賴性。

    〔關(guān)鍵詞〕 前列腺癌;防己諾林堿;線粒體凋亡;PC3細(xì)胞;增殖;自噬

    〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.007

    Effects of fangchinoline on biological behavior of prostate cancer PC3

    cells based on mitochondrial apoptosis pathway

    LI Dong, DONG Mingguo, FANG Zhike, HUANG Linshi, CHEN Jiying

    Dongguan Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan, Guangdong 523005, China

    〔Abstract〕 Objective To explore the effects of fangchinoline (FAN) on the biological behavior of prostate cancer PC3 cells based on mitochondrial apoptosis pathway. Methods Prostate cancer PC3 cells were divided into 4 groups according to FAN treatment concentrations, namely FAN 0 μmol/L, 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups, which were treated with FAN 0 μmol/L (DMSO replacement), 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L, respectively, then the experiment was carried out after 48 h incubation. The proliferation of PC3 cells was measured by CCK-8 method, the cloning ability of PC3 cells was determined by plate cloning method, the apoptosis of PC3 cells was detected by flow cytometry, the invasion of PC3 cells was checked by Transwell assay, the migration of PC3 cells was examined by scratch assay, and the autophagy related proteins and mitochondrial apoptosis pathway proteins of PC3 cells were measured by Western blot. Results Compared with FAN 0 μmol/L group, the proliferation, clone formation, invasion and migration of PC3 cells in FAN 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were significantly lower (P<0.001), and the apoptosis rate was significantly higher (P<0.001). Compared with FAN 5 μmol/L and FAN 10 μmol/L groups, the proliferation, clone formation, invasion and migration of PC3 cells in FAN 20 μmol/L group were significantly lower (P<0.001). Compared with FAN 0 μmol/L group, the expressions of P62 and Bcl-2 in PC3 cells in FAN 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were significantly lower (P<0.001), and the expressions of LC3B, Bax and Caspase-3 proteins were significantly higher (P<0.001). Conclusion FAN may inhibit cell proliferation, invasion and migration through mitochondrial apoptosis pathway, and promote autophagy and apoptosis in a dose-dependent manner.

    〔Keywords〕 prostate cancer; fangchinoline; mitochondrial apoptosis; PC3 cells; proliferation; autophagy

    前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)高發(fā)的一種惡性腫瘤,好發(fā)于中老年男性,隨著年齡的增高,前列腺癌的發(fā)病率逐漸升高[1]。我國前列腺癌的發(fā)病率雖然低于西方國家,但由于部分人群的飲食和生活方式西方化,人口老齡化加劇以及篩查手段的普及,我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著上升趨勢[2]。因該病早期無明顯癥狀,導(dǎo)致大部分患者確診時已為前列腺癌的中晚期,所以,前列腺癌早期診斷和治療一直備受臨床關(guān)注。前列腺癌的發(fā)生和進展的過程比較復(fù)雜,涉及多種機制的參與,前列腺癌起源于前列腺上皮內(nèi)瘤變,并受生活方式和飲食等多種因素的驅(qū)動[3]。目前,臨床上針對前列腺癌的治療主要以藥物和手術(shù)根治性治療為主要手段[4],早期通過手術(shù)根治性治療,5年的生存率可以達到95%以上[5]。但是前列腺癌容易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,最后發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌,可以通過內(nèi)分泌結(jié)合放療或者化療的方法來延長患者的生存期,但是化療方案不僅存在一定的不良反應(yīng),還容易產(chǎn)生耐藥性等[6],所以臨床需要探索新的治療方式,對于前列腺癌的治療具有重要的意義。

    防己諾林堿(fangchinoline, FAN)是從防己中提取的一種中藥單體,具有較好的藥用價值[7-9]?,F(xiàn)代研究表明,F(xiàn)AN具有鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集、抗炎和降壓等作用[10]。也有研究表明,該藥物有抗菌、抗腫瘤的作用[11],但關(guān)于FAN在前列腺癌中的相關(guān)作用機制報道較少,所以本研究基于線粒體凋亡通路,探究FAN對前列腺癌細(xì)胞PC3增殖、凋亡、侵襲、遷移能力及自噬的影響,進一步闡明其對前列腺癌的治療作用及其機制。

    1 材料與方法

    1.1? 細(xì)胞來源

    實驗細(xì)胞前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(批號:20190117)。

    1.2? 主要試劑

    FAN(成都思科華生物技術(shù)有限公司,批號:20120405);胰蛋白酶、胎牛血清(武漢愛博泰克生物科技有限公司,批號:A1267、A1311);CCK-8增殖檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:18104001、2010201);4%多聚甲醛(成都思科華生物技術(shù)有限公司,批號:180319);P62、LC3B、Bcl-2、Bax和Caspase-3一抗(美國San?鄄taCruz公司,批號:B5172、ST005、P0263、BL520B、B40721);辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(美國Pierce公司,批號:BL516B);Matrigel膠(北京索萊寶公司,批號:150316)。

    1.3? 主要儀器

    INCO108型CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國Memmert公司);Tecan Infinite M200酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD公司);CKX53型倒置相差顯微鏡(Olympus公司);164-5050電泳儀(北京市六一儀器廠);D2060R 型流式細(xì)胞儀(艾森生物有限公司)。

    1.4? 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

    將前列腺癌PC3細(xì)胞放在含有10% FBS和1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng),待PC3細(xì)胞融合度達到80%時,進行傳代處理。細(xì)胞分組:將前列腺癌PC3細(xì)胞按照FAN處理濃度分為4組,分別為FAN 0 μmol/L組、FAN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組,各組依次采用DMSO、5 μmol/L FAN、10 μmol/L FAN和20 μmol/L FAN進行處理,細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h后進行后續(xù)實驗。

    1.5? CCK-8法檢測PC3細(xì)胞增殖

    將各組PC3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化,以1×104個細(xì)胞/mL每孔接種于96孔培養(yǎng)板中,將不同F(xiàn)AN濃度的PC3細(xì)胞設(shè)置3個不同的時間點,分別為24、48、72 h,培養(yǎng)一定時間后,棄掉培養(yǎng)基,每孔加入100 μL的CCK-8試劑和對應(yīng)的含血清培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育4 h,采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處細(xì)胞的吸光度,記錄數(shù)值并計算。

    1.6? 平板克隆法檢測PC3細(xì)胞克隆形成能力

    將各組PC3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化,以1×104個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,將不同濃度的FAN的PC3細(xì)胞分別設(shè)置3個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,吸去上清液,采用4%多聚甲醛固定15 min,吸去多聚甲醛,5%結(jié)晶紫染色10 min,PBS清洗,顯微鏡下觀察細(xì)胞群落數(shù)量,計算細(xì)胞克隆的形成數(shù)量。

    1.7? 流式細(xì)胞儀檢測PC3細(xì)胞凋亡

    將各組PC3細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,加入FAN,孵育48 h后,PBS清洗,收于1.5 mL的離心管中,向離心管中依次加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI,避光室溫孵育20 min。孵育完成后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,采用FlowJo 10.6.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。

    1.8? Transwell實驗檢測PC3細(xì)胞侵襲

    采用不含血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠,將Transwell上室平鋪Matigel膠50 μL,培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 min。將不同F(xiàn)AN濃度的PC3細(xì)胞調(diào)整為1×105/mL,在每個Transwell上室加入細(xì)胞懸液200 μL,下室加入相同藥物濃度的正常培養(yǎng)基,設(shè)置3個復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,吸走培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定10 min,PBS清洗,結(jié)晶紫染色10 min,PBS清洗,顯微鏡下拍照。

    1.9? 劃痕試驗檢測PC3細(xì)胞遷移

    將各組PC3細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶正常消化,離心處理,4000 r/min,離心半經(jīng)10 cm,4 ℃條件下離心10 min,離心后放在含有血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以5×105個/mL接種于每孔中,孵育2 h,在培養(yǎng)板上橫線劃痕,PBS清洗,置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h,于0 h和24 h在光學(xué)顯微鏡下取樣,應(yīng)用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測量。

    1.10? Western blot檢測PC3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和線粒體凋亡通路蛋白

    將各組PC3細(xì)胞加入RIPA蛋白質(zhì)裂解液進行蛋白質(zhì)提取,采用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白濃度。上樣前向蛋白質(zhì)樣品中加入5×loading buffer,電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入蛋白P62(1∶1 000稀釋)、LC3B(1∶1 000稀釋)、Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)和Caspase-3(1∶1 000稀釋)一抗,4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋),37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色,凝膠成像,Image J圖像處理軟件進行分析處理。

    1.11? 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料符合正態(tài)分布和方差齊性采用“x±s”表示,組間兩兩比較采用t校驗,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞增殖的影響

    FAN 0 μmol/L組、FAN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞增殖率分別為100.00%±0.00%、77.83%±21.62%、45.42%±11.28%和10.47%±3.59%。與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組在24~72 h的PC3細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.001)。

    2.2? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞克隆形成能力的影響

    與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞克隆形成能力明顯降低(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(P<0.001)。詳見表1和圖1。

    2.3? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的影響

    與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.001)。詳見表1和圖2。

    2.4? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲和遷移的影響

    與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低(P<0.001)。詳見表1和圖3—4。

    2.5? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

    與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞P62蛋白表達明顯降低(P<0.001),LC3B蛋白表達明顯升高(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞P62蛋白表達顯著降低(P<0.001),LC3B蛋白表達顯著升高(P<0.001)。詳見表2和圖5。

    2.6? FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞線粒體凋亡通路蛋白相對表達的影響

    與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.001),Bax和Caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.001);與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.001),Bax和Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.001)。詳見表3和圖5。

    3 討論

    前列腺癌就是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤,是前列腺腺泡細(xì)胞異常無序生長的結(jié)果[12]。前列腺癌的發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異,是西方國家常見的惡性腫瘤腫瘤之一,現(xiàn)已經(jīng)成為男性死亡的第二大原因[13]。前列腺癌的發(fā)展與前列腺組織的炎癥具有一定的相關(guān)性[14],在臨床上,許多慢性炎癥在后期使致癌因子在種族、年齡、遺傳、飲食以及生活方式等因素的影響下,發(fā)生和發(fā)展成為腫瘤[15]。其中,家族遺傳是前列腺癌的第二大影響因素,控制著5%的前列腺癌的遺傳易感性[16]。另外,前列腺癌是睪酮依賴性惡性腫瘤,在日常飲食中攝入高纖維、低脂肪食物可以減少血液中70%的睪酮,抑制前列腺癌的發(fā)生[17]。近年來,我國前列腺癌的發(fā)病率明顯低于西方國家,但是隨著工業(yè)的發(fā)展,致癌因素增多,導(dǎo)致我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升[18]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計,我國前列腺癌的發(fā)病率位于第5位,死亡率位居第9位,嚴(yán)重威脅著男性的健康[19]。因此,前列腺癌的治療已經(jīng)受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視,已成為腫瘤研究的熱點之一。

    天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)修飾衍生物一直是研發(fā)抗腫瘤新藥的自然寶庫,包括紫杉醇類化合物、長春堿類化合物等挽救和延長了無數(shù)腫瘤患者的生命,一直在臨床上占據(jù)重要地位[20]。防己始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中李當(dāng)之《藥錄》,歸膀胱、肺經(jīng),味苦性寒[21]。防己分為漢防己和木防己兩大類,漢防己是防己科植物粉防己的干燥根,主要成分為FAN和粉防己堿[22]。實驗表明,F(xiàn)AN具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等作用[23]。相關(guān)研究表明,F(xiàn)AN可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低磷酸化Akt來抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[24]。也有研究報道,F(xiàn)AN以劑量依賴性地抑制人宮頸癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力,而沒有明顯的細(xì)胞毒作用,作為治療宮頸癌轉(zhuǎn)移的候選藥物[25]。另有研究表明,F(xiàn)AN可以抑制肺癌H1299和A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進其凋亡[26]。

    本研究通過體外實驗首先驗證了FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、克隆形成、凋亡、侵襲和遷移的影響,結(jié)果顯示,與FAN 0 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 5 μmol/L組、FAN 10 μmol/L組和FAN 20 μmol/L組PC3細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲和遷移能力明顯降低,PC3細(xì)胞凋亡率明顯升高;與FAN 5 μmol/L組和FAN 10 μmol/L組相比,F(xiàn)AN 20 μmol/L組的PC3細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲和遷移能力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高。從而說明,隨著FAN濃度的逐漸升高,PC3細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲和遷移能力逐漸降低,而PC3細(xì)胞凋亡率逐漸升高。隨后驗證了FAN對前列腺癌PC3細(xì)胞自噬的影響,結(jié)果顯示,F(xiàn)AN濃度越高,自噬相關(guān)蛋白P62蛋白表達越低,而LC3B蛋白表達越高。細(xì)胞自噬是生物體內(nèi)細(xì)胞組分降解及循環(huán)的重要通路,自噬的主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)的大蛋白及損傷的細(xì)胞器,以保持細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的再利用及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持[27]。相關(guān)研究表明,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的自噬與腫瘤的生長與發(fā)展密切相關(guān)[28]。LC3B、P62是最常用于檢測的自噬相關(guān)蛋白,LC3B是細(xì)胞自噬過程的重要調(diào)控因子,與自噬過程的發(fā)生密切相關(guān)[29],而P62的最突出的作用就是作為細(xì)胞選擇性自噬的底物[30]。上述結(jié)果表明,F(xiàn)AN具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用。

    細(xì)胞凋亡是一種必不可少的程序性細(xì)胞死亡途徑,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和死亡受體是3條主要的凋亡通路[31]。線粒體作為調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡的重要細(xì)胞器,在抗癌藥物發(fā)揮藥理作用過程中扮演關(guān)鍵的角色[32],一旦線粒體分裂和融合之間的平衡被打破,線粒體結(jié)構(gòu)功能將受損,釋放凋亡相關(guān)因子,凋亡因子在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[33]。本研究結(jié)果顯示,F(xiàn)AN濃度越高,Bcl-2蛋白表達越低,而Bax和Caspase-3蛋白表達越高。當(dāng)接收到凋亡信號時,線粒體的Bcl-2等癌基因蛋白的表達減小,Bax等促凋亡蛋白的水平升高,促使線粒體膜極化,誘導(dǎo)Caspase-3的激活,促進某些相關(guān)蛋白穿過線粒體膜[34]。

    綜上所述,F(xiàn)AN可能通過線粒體凋亡通路抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進其自噬和凋亡,并呈現(xiàn)劑量依賴性,對前列腺癌具有一定的輔助治療價值。

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