基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探討紫菀散對慢性支氣管炎氣道炎癥的干預(yù)作用

吳笛，藺曉源，雷詩卉，姜帆，譚駿嵐

〔摘要〕 目的 觀察紫菀散對慢性支氣管炎氣道炎癥的干預(yù)作用，并基于Toll樣受體4（Toll-like receptors 4， TLR4）/髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）信號通路探討其作用機(jī)制。方法? 60只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，除正常組外均采用氣管內(nèi)滴注脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）的方法建立慢性支氣管炎模型。醋酸地塞米松組給予0.075 mg·kg-1醋酸地塞米松灌胃，每天1次；紫菀散低、中、高劑量組分別給予1.5、3.0、6.0 g·kg-1紫菀散灌胃，每天1次；模型組、正常組給予等量生理鹽水灌胃。采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）水平，采用細(xì)胞計數(shù)板法計數(shù)BALF中白細(xì)胞數(shù)量，采用HE染色、AB-PAS染色觀察肺組織病理改變，采用免疫組化法檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.01），白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），肺組織呈病理改變且氣道杯狀細(xì)胞增生評分升高（P＜0.01），TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸地塞米松組及紫菀散各劑量組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均降低（P＜0.01），肺組織病理改變均減輕，氣道杯狀細(xì)胞增生評分均降低（P＜0.05或P＜0.01），TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均減少（P＜0.05或P＜0.01）；與醋酸地塞米松組比較，紫菀散中、高劑量組TGF-β1水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），紫菀散低劑量組白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），紫菀散中劑量組中性粒細(xì)胞數(shù)量、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），紫菀散高劑量組淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01），紫菀散低、中劑量組肺組織病理改變均加重，紫菀散低劑量組氣道杯狀細(xì)胞增生評分升高（P＜0.05），紫菀散低劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。結(jié)論 紫菀散可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮抗慢性支氣管炎氣道炎癥的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 紫菀散；慢性支氣管炎；氣道炎癥；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.005

Intervention effects of Ziwan Powder on airway inflammation in chronic bronchitis based on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

WU Di1，2， LIN Xiaoyuan1，2*， LEI Shihui1，2， JIANG Fan1，2， TAN Junlan3

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Key Laboratory of Research on Prevention and Treatment of Major Diseases in Chinese Internal Medicine and Transformation of Achievements of Ministry of Education， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the intervention effects of Ziwan Powder on airway inflammation in chronic bronchitis， and to explore its mechanism based on toll-like receptor 4 （TLR4）/myeloid differentiation factor 88 （MyD88）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway. Methods Sixty healthy adult male SD rats were randomly divided into 6 groups， with 10 in each group. They were induced into chronic bronchitis models by instilling lipopolysaccharides （LPS） into the trachea， except for those of normal group. Dexamethasone Acetate group was given once daily gavage of 0.075 mg·kg-1 Dexamethasone Acetate. Once daily gavage of 1.5， 3.0 and 6.0 g·kg-1 extracts of Ziwan Powder were given to low-， medium-， and high-dose Ziwan Powder groups， respectively. The equal gavage of normal saline was administered to model group and normal group. The levels of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were measured by ELISA. White blood cell count in BALF was checked by hemacytometer. Lung tissue pathological changes were observed by HE and AB-PAS staining. The protein expressions of TLR4， MyD88， and NF-κB in lung tissues were observed by immunohistochemistry staining. Results Compared with normal group， model group showed higher levels of TGF-β1， IL-1β， and IL-6 （P<0.01）， elevated count of total white blood cells， macrophages， lymphocytes， neutrophil granulocytes， and eosinophil granulocytes （P<0.01）， increased protein expression levels of TLR4， MyD88， and NF-κB （P<0.01）， a higher pathological score of airway goblet cell hyperplasia （P<0.01）， and obvious pathological changes in lung tissues. Compared with model group， Dexamethasone Acetate group and all Ziwan Powder groups shared lower levels of TGF-β1， IL-1β， and IL-6 （P<0.05 or P<0.01）， reduced count of total white blood cells， macrophages， lymphocytes， neutrophil granulocytes and eosinophil granulocytes （P<0.01）， decreased protein expression levels of TLR4， MyD88， and NF-κB （P<0.05 or P<0.01）， a lower pathological score of airway goblet cell hyperplasia （P<0.05 or P<0.01）， and improved pathological changes in lung tissues. Compared with Dexamethasone Acetate group， medium- and high-dose Ziwan Powder groups shared a lower level of TGF-β1 （P<0.05 or P<0.01）; low-dose Ziwan Powder group showed elevated count of total white blood cells， macrophages， lymphocytes， neutrophil granulocytes， and eosinophil granulocytes （P<0.01）， increased protein expression levels of TLR4， MyD88， and NF-κB （P<0.05）， and an increased number of airway goblet cells （P<0.05）; medium-dose Ziwan Powder group showed elevated count of neutrophil granulocytes and eosinophil granulocytes （P<0.01）; high-dose Ziwan Powder group showed reduced count of lymphocytes （P<0.01）; low-dose and medium-dose Ziwan Powder groups shared aggravated pathological changes in lung tissues. Conclusion Ziwan Powder may alleviate airway inflammation in chronic bronchitis by inhibiting the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Ziwan Powder; chronic bronchitis; airway inflammation; TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway; transforming growth factor-β1; interleukin-1β; interleukin-6

慢性支氣管炎是由于感染或非感染性因素導(dǎo)致的氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，以咳嗽、咳痰或伴有喘息等反復(fù)發(fā)作為主要癥狀，可并發(fā)阻塞性肺氣腫、肺源性心臟病、肺動脈高壓等常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者正常的生活和工作[1-2]。慢性支氣管炎在我國是一種常見病、多發(fā)病，患者多為中老年人，且患病率隨年齡增長而增加，我國50歲以上人群患病率超過14%[3]。目前，臨床常采用抗感染、抗炎、止咳、化痰等措施治療慢性支氣管炎，但易反復(fù)發(fā)作。雖然慢性支氣管炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但有研究[4-6]顯示，Toll樣受體4（toll-like receptors 4， TLR4）/髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）信號通路是其發(fā)病的重要機(jī)制之一。

紫菀散為古代經(jīng)典名方，方出孫思邈《備急千金要方》卷十八“大腸腑方”，由紫菀、款冬花兩味中藥組成，能止咳化痰，主治咳嗽日久，痰涎不利。此方現(xiàn)多用于治療慢性支氣管炎，可隨證加減，療效確切，但鮮見紫菀散治療慢性支氣管炎的實驗研究，故其具體機(jī)制尚不明確。李聰?shù)萚7]通過小鼠毛細(xì)血管通透性實驗、氨水致小鼠急性呼吸道炎癥模型及脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的變化來觀察紫菀、款冬花部位配伍后的抗炎作用，結(jié)果顯示，紫菀90%醇沉部位、款冬花90%醇溶部位及其配伍均能抑制小鼠毛細(xì)血管通透性和氨水致敏引起的急性呼吸道炎癥，配伍組作用增強(qiáng)；紫菀90%醇沉部位、款冬花90%醇溶部位均能抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞后一氧化氮的產(chǎn)生，配伍后作用增強(qiáng)。此研究證實紫菀、款冬花均具有顯著的抗炎作用，兩者配伍后抗炎效果顯著提高，符合相須、相使配伍理論，但未涉及作用機(jī)制。

本研究擬觀察紫菀散對LPS誘導(dǎo)的大鼠慢性支氣管炎氣道炎癥的干預(yù)作用，并基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 實驗動物

60只成年健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量（200±20） g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24～26 ℃，相對濕度為50%～60%，光照周期為各12 h明暗交替，用全價顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2020-0010。實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審查號：ZYFY20220321。

1.2? 藥品及試劑

紫菀、款冬花均購于湖南邵東廉橋藥材市場，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，分別為菊科植物Aster tataricus L. f.的干燥根和根莖、菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H33020822，規(guī)格：0.75 mg，批號：200124）。95%乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2021101902）；LPS（美國Sigma-Aldrich公司，批號：L4516）；戊巴比妥鈉（上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：570471）；生理鹽水（上海生工生物工程股份有限公司，批號：220316）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：21313432）；瑞氏姬姆薩染色液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：CR2102001）；蘇木精染色液、伊紅染色液、阿辛蘭-過碘酸希夫染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20220224、20220323、20211216）；大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6） ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：2204R11、2204R13、2204R19）；一抗兔抗鼠TLR4、MyD88、NF-κB抗體（英國Abcam公司，批號：ab220312、ab220320、ab220405）；二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G， IgG）抗體（英國Abcam公司，批號：GR231489-7）。

1.3? 實驗儀器

Enspire型多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer公司）；H1850型臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DSX100型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；STP-120型組織脫水機(jī)、HM325型輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)、HistoStar型石蠟包埋機(jī)、Gemini AS型染色機(jī)（美國ThermoFisher公司）。

2 方法

2.1? 藥液制備

取54 g紫菀、81 g款冬花，混合，依次加10倍量90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和水分別加熱回流提取4次，每次1 h，合并4次提取液，濃縮至生藥含量為0.15 g·mL-1，得到紫菀散低劑量組用藥（相當(dāng)于臨床等效劑量）；取108 g紫菀、162 g款冬花，處理方法同紫菀散低劑量組用藥，提取液濃縮至生藥含量為0.30 g·mL-1，得到紫菀散中劑量組用藥（相當(dāng)于臨床等效劑量的2倍）；取216 g紫菀、324 g款冬花，處理方法同紫菀散低劑量組用藥，提取液濃縮至生藥含量為0.60 g·mL-1，得到紫菀散高劑量組用藥（相當(dāng)于臨床等效劑量的4倍）。紫菀散藥液濃度根據(jù)紫菀散給藥劑量及大鼠每100 g體質(zhì)量1 mL的單次給藥體積換算確定。為最大程度提取不同極性的化學(xué)成分，采用不同濃度的乙醇溶液梯度提取制備紫菀散各劑量組用藥。另取醋酸地塞米松片1片，研末，過6號篩（100目），加純化水100 mL，制成混懸液，得到醋酸地塞米松組用藥（相當(dāng)于臨床等效劑量，臨用前制備）。醋酸地塞米松藥液濃度根據(jù)醋酸地塞米松給藥劑量及大鼠每100 g體質(zhì)量1 mL的單次給藥體積換算確定。

2.2? 動物造模

采用氣管內(nèi)滴注LPS的方法建立慢性支氣管炎模型，具體參照文獻(xiàn)[8]方法：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉，以耳鏡插入喉口，用靜脈套管針（拔去針芯）每周注入1 mg·mL-1的LPS溶液200 μL，共3次。模型制備成功的判斷依據(jù)為以耳鏡插入大鼠喉口可觀察到大量痰液和氣泡。

2.3? 動物分組及給藥

60只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、醋酸地塞米松組、紫菀散低劑量組、紫菀散中劑量組、紫菀散高劑量組，共6組，每組10只。除正常組外，其余5組均造模。醋酸地塞米松組給予0.075 mg·kg-1醋酸地塞米松灌胃，每天1次[給藥劑量基于醋酸地塞米松片0.75 mg/片的規(guī)格及成人每日0.75 mg（1片）的用量，根據(jù)大鼠與人體表面積比值換算確定]；紫菀散低、中、高劑量組分別給予1.5、3.0、6.0 g·kg-1紫菀散提取物灌胃，每天1次（給藥劑量基于孫思邈《備急千金要方》卷十八“大腸腑方”中紫菀散處方“紫菀二兩款冬花三兩”及紫菀、款冬花常用劑量5～10 g的用量，根據(jù)大鼠與人體表面積比值換算確定）；模型組和正常組給予等量生理鹽水灌胃。各組均干預(yù)3周。

2.4? 樣本采集及指標(biāo)檢測

2.4.1? ELISA法檢測BALF中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平? 各組大鼠干預(yù)3周后，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉，打開胸腔，分離并結(jié)扎左主支氣管，分離暴露大鼠氣管并插管，按每100 g/mL生理鹽水分兩次灌洗，收集BALF，3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑17.5 cm），ELISA法檢測上清液中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平。

2.4.2? 細(xì)胞計數(shù)板法計數(shù)BALF中白細(xì)胞數(shù)量? BALF離心后的沉淀用0.5 mL生理鹽水混勻，取細(xì)胞混懸液100 μL，滴于細(xì)胞計數(shù)板上，用100 μL白細(xì)胞計數(shù)液稀釋，光鏡下計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，稀釋液涂片，自然干燥，用瑞氏姬姆薩染色液染色，油鏡下每張涂片計數(shù)200個細(xì)胞，得出白細(xì)胞分類計數(shù)值。

2.4.3? HE染色、AB-PAS染色觀察肺組織病理改變? 取未灌洗的左肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛液固定、漂洗、脫水、透明和石蠟包埋、切片，HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤，AB-PAS染色觀察氣道杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個支氣管腔大小視野進(jìn)行觀察，采用五級評分法評估AB-PAS染色切片中杯狀細(xì)胞增生情況：0分表示正常；1分表示輕微，大支氣管內(nèi)杯狀細(xì)胞增生；2分表示輕度，大中支氣管內(nèi)杯狀細(xì)胞增生；3分表示中度，大中和一些小支氣管內(nèi)杯狀細(xì)胞增生；4分表示重度，所有氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞增生[9]。

2.4.4? 免疫組化法檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)? 免疫組化染色檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量TLR4、MyD88、NF-κB免疫組化圖片平均光密度值，對大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示。兩組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 造模及動物一般表現(xiàn)

造模成功的大鼠，表現(xiàn)出咳嗽、氣喘、呼吸困難、行動遲緩、精神萎靡、瘦弱、體毛枯槁等表觀癥狀（不一定全部具備），最明顯、可靠的標(biāo)志為以耳鏡插入喉口可觀察到大量痰液和氣泡，故以此作為造模成功的判斷依據(jù)。模型組、醋酸地塞米松組、紫菀散低劑量組、紫菀散中劑量組、紫菀散高劑量組分別有1、1、2、0、0只大鼠未造模成功，成功率為92%。模型組、紫菀散中劑量組、紫菀散高劑量組分別有1、2、2只造模成功的大鼠死亡，均從本研究中剔除。

3.2? 紫菀散對慢性支氣管炎模型大鼠BALF中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平的影響

與正常組比較，模型組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸地塞米松組及紫菀散各劑量組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）；與醋酸地塞米松組比較，紫菀散中、高劑量組TGF-β1水平均降低（P＜0.05或P＜0.01），紫菀散低劑量組TGF-β1水平及紫菀散各劑量組IL-1β、IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

3.3? 紫菀散對慢性支氣管炎模型大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量的影響

與正常組比較，模型組白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸地塞米松組及紫菀散各劑量組白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均減少（P＜0.01）；與醋酸地塞米松組比較，紫菀散低劑量組白細(xì)胞總數(shù)和各種白細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），紫菀散中劑量組的中性粒細(xì)胞數(shù)量、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），紫菀散高劑量組的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01），白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

3.4? 紫菀散對慢性支氣管炎模型大鼠肺組織病理改變的影響

3.4.1? 各組HE染色情況比較? 正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，氣道無明顯炎性細(xì)胞浸潤及炎癥物質(zhì)滲出；與正常組比較，模型組肺組織可見炎性細(xì)胞浸潤及炎癥物質(zhì)滲出，氣道周圍可見充血，氣道出現(xiàn)明顯狹窄伴炎癥物質(zhì)滲出，基底膜增厚，氣道平滑肌增厚，氣道上皮細(xì)胞破壞；與模型組比較，紫菀散各劑量組及醋酸地塞米松組肺組織及氣道腔內(nèi)炎癥物質(zhì)滲出均不同程度減少，炎性細(xì)胞浸潤改善，氣道壁增厚減輕；醋酸地塞米松組與紫菀散高劑量組肺組織病理形態(tài)學(xué)接近。詳見圖1。

3.4.2? 各組AB-PAS染色情況比較? 正常組氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞幾乎無增生；與正常組比較，模型組杯狀細(xì)胞增生評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸地塞米松組及紫菀散各劑量組杯狀細(xì)胞增生評分降低（P＜0.05或P＜0.01）；與醋酸地塞米松組比較，紫菀散低劑量組杯狀細(xì)胞增生評分升高（P＜0.05），紫菀散中、高劑量組杯狀細(xì)胞增生評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2、表3。

3.5? 紫菀散對慢性支氣管炎模型大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸地塞米松組及紫菀散各劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05或P＜0.01）；與醋酸地塞米松組比較，紫菀散低劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），紫菀散中、高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3—5、表4。

4 討論

中醫(yī)學(xué)無慢性支氣管炎病名，但根據(jù)其咳、痰、喘等主要癥狀，將慢性支氣管炎歸屬于“咳嗽”“痰飲”“喘證”等范疇[10]。慢性支氣管炎，咳、痰、喘是其外在表現(xiàn)，下氣道炎癥是其本質(zhì)。紫菀散由紫菀、款冬花兩味中藥組成，紫菀重在化痰，款冬花偏于止咳，二藥合用，原用于治療咳嗽日久，痰涎不利，現(xiàn)用于治療慢性支氣管炎，效果確切。秦永琪[11]報道紫菀所含紫菀酮、紫菀皂苷等成分可能與紫菀祛痰作用有關(guān)。盧艷花等[12]證實紫菀酮、表木栓醇具有祛痰、鎮(zhèn)咳作用。劉可越[13]對紫菀散的藥效物質(zhì)進(jìn)行了研究，確定了其鎮(zhèn)咳、祛痰的有效部位，發(fā)現(xiàn)祛痰活性成分至少包括紫菀酮、表木栓醇、山柰酚、槲皮素及總皂苷。LI等[14-15]報道綠原酸、異綠原酸A、蘆丁可能與款冬花鎮(zhèn)咳、祛痰作用密切相關(guān)。WU等[16]證實從款冬花中分離得到的綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎活性。另有研究[17-19]顯示，從款冬花中分離得到的倍半萜類化合物及從紫菀中分離得到的脂肪酸、萜類、黃酮類化合物均具有抗炎作用。上述研究結(jié)果提示紫菀散用于慢性支氣管炎不僅能對癥治療，也能對因治療，標(biāo)本兼治。

LPS是一種細(xì)菌內(nèi)毒素，是引起慢性支氣管炎等炎癥性疾病的主要因素之一。LPS可與位于細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，活化的TLR4可通過MyD88依賴途徑激活NF-κB[5-6， 20]。NF-κB是一種調(diào)控基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，對巨噬細(xì)胞的合成和成熟，以及促炎細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生至關(guān)重要，也是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的主要刺激因素[21-22]。NF-κB可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成、釋放多種促炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)（如TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-α），誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[23]。抑制NF-κB的持續(xù)激活進(jìn)而減少促炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，是治療多種炎癥性疾病的重要策略和手段[24-26]。TGF-β1廣泛存在于呼吸系統(tǒng)組織內(nèi)，在肺疾病過程中的表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用，一方面，適量的TGF-β1有利于細(xì)胞創(chuàng)傷的修復(fù)；另一方面，在急性病變中，TGF-β1的產(chǎn)生是應(yīng)激性的，呈短時間分泌，而在慢性病中，TGF-β1的產(chǎn)生是持續(xù)性的，過多的TGF-β1沉積最終加重局部炎性反應(yīng)[27]。IL-1β在炎癥反應(yīng)時分泌旺盛，通過抑制慢性支氣管炎模型大鼠肺組織IL-1β的水平，可干預(yù)模型大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)[28]。IL-6是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在感染、組織損傷等方面起著重要作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，介導(dǎo)肺組織、氣道炎癥反應(yīng)[29]。有學(xué)者將機(jī)體IL-6的水平作為評估慢性支氣管炎病情輕重的參考指標(biāo)[30]。另有研究[31]顯示，慢性支氣管炎模型大鼠肺組織TGF-β1、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)明顯升高，治療后模型大鼠肺組織TGF-β1、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)顯著降低。

本研究結(jié)果顯示，紫菀散低、中、高劑量組均可顯著下調(diào)慢性支氣管炎模型大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)，降低BALF中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平，減少白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞數(shù)量，減少肺組織炎性細(xì)胞浸潤和炎癥物質(zhì)滲出，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)及肺組織病理改變，其中以紫菀散高劑量組效果最佳。本研究結(jié)果提示，紫菀散可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮其抗慢性支氣管炎氣道炎癥的作用。

臨床常用的抗炎藥分為兩大類，甾體抗炎藥（如可的松、潑尼松、地塞米松）和非甾體抗炎藥（如阿司匹林、對乙酰氨基酚、布洛芬），雖然具有確切的抗炎作用，但也具有較多的毒副作用和不良反應(yīng)，如胃腸道損害、腎損害、肝損害、中樞神經(jīng)癥狀、水鈉潴留、骨質(zhì)疏松等。紫菀散作為基礎(chǔ)方用于治療慢性支氣管炎，可隨證加減，療效確切。本研究通過動物實驗證實紫菀散具有確切的抗慢性支氣管炎氣道炎癥的效果，紫菀散高劑量組抗慢性支氣管炎氣道炎癥的效果與甾體抗炎藥醋酸地塞米松基本相當(dāng)，且部分指標(biāo)更優(yōu)。紫菀散臨床應(yīng)用已有千年歷史，迄今未見任何關(guān)于毒副作用和不良反應(yīng)的報道，其安全性較常用的甾體和非甾體抗炎藥更有優(yōu)勢，值得推廣應(yīng)用。

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（本文編輯? 周? 旦）