補救性卵子激活技術(shù)在挽救ICSI未受精卵子中的應(yīng)用研究

王淑林 翁崇雙 巢時斌 鄭雯雯

（上饒市婦幼保健院輔助生殖科，江西 上饒 334100）

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（injection of single sperm，ICSI）是一種通過直接在卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)注射入精子的輔助受精技術(shù)，現(xiàn)目前已在畸精子癥、少精子癥等病癥中得到廣泛應(yīng)用[1]。ICSI受精方式繞過了自然受孕時精子獲能、頂體反應(yīng)及穿過卵子透明帶等過程。因此ICSI常被認(rèn)為是有保障的受精方式，但是臨床治療中仍然有2%～3%患者ICSI受精失敗，加上受精率低下的患者也占到ICSI的20%～30%[2]。到目前為止臨床上仍沒有辦法預(yù)測和預(yù)防ICSI受精失敗，由于觀察受精時間一般在ICSI后16 h左右，完全不受精或者低受精率的卵子已老化，目前仍然無較好的解決方案改善本次ICSI治療受精失敗后的臨床結(jié)局[3]。在輔助生殖技術(shù)中，激活卵母細胞是受精過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受精失敗和受精率低的主要原因是精子缺乏頭部的卵子激活因子，導(dǎo)致卵子激活失敗[4]。越來越多的研究以及試驗數(shù)據(jù)表明[5]，對于反復(fù)ICSI受精失敗的患者，采用ICSI授精方式聯(lián)合補救性卵子激活（assisted oocyte activation，AOA技術(shù)能夠顯著提高受精率、卵裂率以及胚胎著床率。但目前臨床上關(guān)于補救性AOA挽救ICSI受精失敗卵子中的案例仍罕見報道?；诖吮尘?，本次研究通過觀察AOA技術(shù)在挽救ICSI受精失敗卵子中的應(yīng)用研究，以更加全面深入的探討ICSI-AOA是否能夠有效改善既往ICSI后受精失敗患者臨床結(jié)局的潛在作用。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年11月致2021年11月我院生殖醫(yī)學(xué)中心接受ICSI-AOA治療的患者58例患者設(shè)為試驗組，將ICSI助孕失敗且僅行常規(guī)治療的58例患者作為對照組（未行AOA處理）；同時將治療成功的200例患者的新生兒結(jié)局作為空白對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①本周期獲得成熟卵數(shù)≥3枚。②符合以下1項標(biāo)準(zhǔn)：前次ICSI周期正常受精率≤30%，前次ICSI周期第3天無優(yōu)質(zhì)胚胎，診斷為圓頭精子癥患者。③距離前次ICSI周期失敗間隔＜1年。④患者知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①其他類型的嚴(yán)重精子畸形。②卵母細胞本身質(zhì)量差或畸形。③前次ICSI受精失敗的非激活障礙者。因?qū)φ战M分娩數(shù)據(jù)樣本量偏小，為此選擇本院同期接受常規(guī)ICSI的200對患者分娩數(shù)據(jù)進行新生兒結(jié)局比較設(shè)為對照組。本研究已經(jīng)通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 卵子收集 監(jiān)測到卵泡發(fā)育至少滿足下列一個條件時進行扳機：①有3個卵泡直徑≥16 mm。②2個主導(dǎo)卵泡直徑≥17 mm。③1個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm。扳機后35～38 h后超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。于5% O2、6% CO2和37 ℃條件下的培養(yǎng)箱（澳大利亞Cook公司）中保持培養(yǎng)2～3 h。去卵冠丘后對裸露卵子進行成熟度評估，對成熟的MII期卵子進行ICSI操作。

1.2.2 ICSI后卵子激活 ICSI注射后，于G-IVF Plus培養(yǎng)基配置的10 μmol/L離子霉素（德國Merck KgAA公司）中進行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)10 min。激活后，將卵母細胞經(jīng)預(yù)平衡的受精液漂洗至少3次，繼續(xù)培養(yǎng)直至受精觀察。

1.2.3 原核觀察 ICSI后卵子激活16～18 h后顯微鏡（日本Nikon公司，ECLIPSETi-S、SM2645）下觀察評估受精情況，顯示不為2個原核（pronucleus，PN）的胚胎為異常受精，只有可見2PN的為正常受精卵。在新配置的培養(yǎng)基中進行正常受精卵培養(yǎng)，3 d后進行卵裂期胚胎發(fā)育情況的評估。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)及冷凍 在第3天胚胎移植和玻璃化冷凍處理后，將剩余的胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6 d。采用Gardner評判標(biāo)準(zhǔn)進行囊胚評分[6]，B4-B6囊胚擴張同時有至少一個B的內(nèi)細胞團和更好等級的囊胚或滋養(yǎng)外胚層用于移植。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較試驗組與對照組的總性腺激素劑量、促排時間、子宮內(nèi)膜厚度、啟動性腺激素劑量、扳機日血清孕酮和雌二醇水平等臨床特征。②比較試驗組和對照組試驗結(jié)果，包括：獲卵數(shù)目、注射MII卵子數(shù)目、卵裂率、囊胚形成率、完全受精失敗率、低受精率、正常受精率、總受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D3可利用胚胎率。評估標(biāo)準(zhǔn)如下。優(yōu)質(zhì)胚胎：胚胎中碎片程度≤20%，且卵裂球大小均勻，數(shù)目7～9個?？衫门咛ィ号咛ブ兴槠?0%，且卵裂球數(shù)目≥5個[7]。③比較試驗組和對照組臨床結(jié)局，包括取卵和移植周期臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、取卵和移植周期活產(chǎn)率，胚胎種植率=具有胎心搏動的孕囊數(shù)目/同移植胚胎數(shù)目×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠患者數(shù)/進行胚胎移植患者數(shù)×100%。妊娠第4周經(jīng)陰道超聲觀察到有胎心的孕囊被確定為臨床妊娠；在妊娠20周之前失去臨床妊娠被認(rèn)定為流產(chǎn)；分娩至少1名活產(chǎn)嬰兒被確定為活產(chǎn)。④比較試驗組和空白對照組新生兒結(jié)局，包括新生兒出生體質(zhì)量、雙胎率、早產(chǎn)兒率結(jié)局、低出生體質(zhì)量率、大于胎齡兒率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件分析，定量資料用（）表示，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用率（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗組與對照組一般情況比較 兩組總性腺激素劑量、促排時間、子宮內(nèi)膜厚度、啟動性腺激素劑量、扳機日血清孕酮和雌二醇水平均差異不顯著（P＞0.05）。見表1。

表1 試驗組與對照組一般情況比較（）

表1 試驗組與對照組一般情況比較（）

2.2 試驗組和對照組受精和胚胎發(fā)育情況 試驗組和對照組在獲卵數(shù)目、注射MII卵子數(shù)目、卵裂率、囊胚形成率比較差異不顯著（P＞0.05）；試驗組完全受精失敗率、低受精率顯著低于對照組（χ2=46.561，15.253，P＜0.05）；正常受精率、總受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D3可利用胚胎率顯著高于對照組（χ2=339.888，444.509，6.168，7.523，P＜0.05）。見表2。

表2 試驗組和對照組受精和胚胎發(fā)育情況比較[n=58，，(%)]

表2 試驗組和對照組受精和胚胎發(fā)育情況比較[n=58，，(%)]

2.3 試驗組和對照組臨床結(jié)局比較 試驗組在取卵和移植周期臨床妊娠率、種植率、取卵和移植周期活產(chǎn)率均顯著高于對照組（χ2=27.228，5.447，5.860，28.554，10.290，P＜0.05）。試驗組和對照組流產(chǎn)率比較差異不顯著（χ2=2.438，P＞0.05）。見表3。

表3 試驗組和對照組臨床結(jié)局比較[n（%）]

2.4 試驗組和空白對照組新生兒結(jié)局比較 試驗組和空白對照組新生兒出生體質(zhì)量、雙胎率、早產(chǎn)兒率結(jié)局、低出生體質(zhì)量率、大于胎齡兒率比較差異均不顯著（χ2=1.114，0.007，0.280，0.038，2.436，P＞0.05）。見表4。

表4 試驗組和空白對照組新生兒結(jié)局比較

3 討論

常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）受精率為60%～80%，但是仍存在3.5%～20%的受精率低下和完全受精失敗的現(xiàn)象[8]。ICSI技術(shù)通過將單個精子注入卵胞質(zhì)內(nèi)進行受精，有效解決了不孕夫婦中男方及受精障礙等因素導(dǎo)致不育，在治療男性不育中療效顯著。但ICSI周期中出現(xiàn)完全受精失敗的患者仍然還有2%～3%，ICSI后卵子的受精率為70%～80%，成熟卵子中的20%～30%即使注射精子仍無法受精[9]。這多是因為卵母細胞激活失敗造成的[10]。注入精子的生物刺激和機械刺激是在ICSI過程中對卵母細胞的主要刺激。當(dāng)精子進入卵母細胞后會產(chǎn)生一系列的生物反應(yīng)激活卵母細胞。卵母細胞在針刺進入后會誘發(fā)Ca2+波動，但影響并不顯著，卵母細胞的酶在完成精子注入后可以修飾精子膜，釋放“鈣振素”活化卵子，三磷酸肌醇和其他第二信使系統(tǒng)被激活。因此卵母細胞激活失敗可能是由ICSI操作過程引發(fā)其細胞胞質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致卵母細胞死亡。有研究表明，磷脂酶C-ζ作為精子赤道板區(qū)含有的酶，將其直接注入卵母細胞后，可誘發(fā)鈣振蕩，當(dāng)精子缺乏磷脂酶C-ζ時會導(dǎo)致受精失敗[11]。目前AOA報道中應(yīng)用包括了鈣離子載體激活、化學(xué)激活、電激活、注射磷脂酶C-ζcRNA 等方式，其中離子載體在AOA應(yīng)用效果較好，其作用機制為通過在鈣離子載體溶液中暴露卵母細胞，提高卵子胞質(zhì)中的胞內(nèi)Ca2+水平，激活下游蛋白級聯(lián)反應(yīng)，能夠顯著提高臨床妊娠率[12-13]。

在本研究中，筆者通過建立對照試驗觀察了因ICSI受精低下或失敗再次接受ICSI助孕時進行AOA處理的58例患者，結(jié)果顯示，試驗組和對照組在獲卵數(shù)目、注射MII卵子數(shù)目、卵裂率、囊胚形成率比較差異不顯著，試驗組完全受精失敗率、低受精率顯著低于對照組，正常受精率、總受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D3可利用胚胎率、取卵和移植周期臨床妊娠率、種植率、取卵和移植周期活產(chǎn)率均顯著高于對照組。表明既往ICSI后受精失敗患者選擇ICSI-AOA技術(shù)能夠有效提高胚胎發(fā)育質(zhì)量改善其臨床結(jié)局，有效提高受精率和妊娠率。這一結(jié)果與羅陽等[14]和張希等[15]在ICSI-AOA技術(shù)中采用離子霉素激活卵母細胞對受精率、胚胎的發(fā)育質(zhì)量影響的試驗中所得到的結(jié)果相似。結(jié)果還表明，試驗組和空白對照組新生兒出生體質(zhì)量、雙胎率、早產(chǎn)兒率結(jié)局、低出生體質(zhì)量率、大于胎齡兒率比較差異均不顯著。提示ICSI-AOA技術(shù)，新生兒結(jié)局良好無影響。這與國外的一項關(guān)于ICSI-AOA與常規(guī)ICSI在雙胞胎率、出生體質(zhì)量等安全性問題的討論研究結(jié)果相同[16]。與Li等[17]在ICSIAOA試驗中關(guān)于新生兒缺陷類型、出生體質(zhì)量、分娩時孕周、畸形類型和胎兒性別方面均無顯著差異的研究結(jié)果相同。

綜上所述，既往ICSI后受精失敗患者選擇ICSIAOA技術(shù)能夠有效改善其臨床結(jié)局，有效提高受精率和妊娠率，且新生兒結(jié)局良好良好，臨床應(yīng)用價值較高。